Análisis comparativo de la estructura del ARN de transcritos nacientes y maduros en Saccharomyces cerevisiae

Estudiamos el procesamiento de ARN cotranscripcional, y eso incluye cómo el ARN naciente se pliega al emerger de la ARN polimerasa que lo sintetiza. Antes de este método, no podíamos monitorizar cómo se pliega el ARN durante la síntesis, y esto nos estaba frenando en nuestra investigación. Así que este nuevo método supera esos vacíos.

CoSTseq se desarrolló para investigar el plegamiento de ARN naciente en levaduras. Es especialmente eficaz para analizar ARN de alta abundancia. Para empezar, inocular la cepa BY4741 de Saccharomyces cerevisiae en 50 mililitros de medio YPAD e incubar a 30 grados Celsius con agitación a 200 revoluciones por minuto hasta que el cultivo alcance la fase media logarítmica.

Recoger aproximadamente tres mililitros de cultivo de levadura correspondientes a 1,8 unidades de densidad óptica y centrifugar a 2.500 x g durante tres minutos a cuatro grados Celsius usando una centrífuga preenfriada. Descarta el sobrenadante en un contenedor de residuos. Suspende el pellet en 10 mililitros de PBS frío y centrifuga de nuevo a 2.500 x g durante tres minutos a cuatro grados Celsius.

Quita el sobrenadante y guarda el pellet de levadura en hielo. Resuspende cuidadosamente el pellet de levadura en 10 mililitros de sarkosyl al 0,5% frío sin crear burbujas. Incubar la levadura resuspendida sobre hielo durante 20 minutos para permitir la permeación, luego pelletar las células a 400 x g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y volver a suspender las células permeables de levadura en 100 microlitros de agua sin nucleasas usando una pipeta P-1000.

Preparar una solución operativa de 2,5X de tampón de transcripción con cinco milimolares de ditiotreitol recién añadido y precalentar 2,5X de tampón de sondeo de estructura a 30 grados Celsius. En un tubo limpio de dos mililitros, añade todos los componentes de reacción necesarios y mezcla bien. A continuación, añade 100 microlitros de las células de levadura preparadas al tubo de reacción e incubalas en el mezclador térmico a 30 grados Celsius, agitando a 500 revoluciones por minuto durante dos minutos.

Luego añade rápidamente 200 microlitros del tampón de sondeo estructural precalentado 2,5X y 25 microlitros de reactivo de sulfato de dimetilo simultáneamente. Haz un vórtice suave en dos pulsos y colócalo de nuevo en la incubadora a 30 grados Celsius y 500 revoluciones por minuto. Continúa incubando en la termomezcladora durante cuatro minutos, espaciando 30 segundos entre muestras.

Prepara los amortiguadores de parada y lavado con antelación y colócalos sobre hielo hasta que se usen. Detiene la metilación del sulfato de dimetilo añadiendo un mililitro de tampón de parada al tubo de reacción. Ahora centrifuga las muestras marcadas con sulfato de dimetilo a 3.500 x g durante cinco minutos en una centrífuga pre-enfriada.

Después del giro, descarta el sobrenadante en un contenedor de residuos adecuado. Añade un mililitro de buffer de lavado frío al pellet y vuelve a suspender. Repite la centrifugación a 3.500 x g durante cinco minutos.

Procede inmediatamente a la extracción de ARN y no congeles el pellet de levadura. Resuspende el pellet de levadura marcado con sulfato de dimetilo en 600 microlitros de tampón de lisis de ARN y luego transfiere la suspensión a un tubo que contiene 40 microlitros de dodecilo sulfato al 20% de sodio. Incubar la muestra a 65 grados Celsius durante 30 segundos, agitando a 950 revoluciones por minuto.

A continuación, realiza la extracción de fenol-cloroformo del ARN siguiendo el procedimiento estándar. Toma en vórtice las perlas magnéticas de estreptavidina y transfiere 44 microlitros de las perlas a un nuevo tubo por cada muestra de 80 microgramos de ARN total. Coloca las cuentas magnéticas sobre una rejilla magnética hasta que se asienten.

Después de retirar el buffer de almacenamiento, vuelve a suspender las perlas en un mililitro de buffer de pre-lavado A. Ahora incuba la suspensión durante dos minutos a temperatura ambiente, luego magnetiza y retira el sobrenadante. Después del lavado, vuelve a suspender las perlas en 88 microlitros de buffer de unión 2X. Transfiere 80 microlitros de la suspensión a un tubo estéril de 1,5 mililitros que contenga 80 microgramos de muestra de ARN biotinilado en 80 microlitros.

Gira la mezcla de la muestra de perlas en un rotador durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego coloca el tubo en la rejilla magnética para recoger el flujo que contiene ARN maduro y guardarlo para la precipitación y realizar la selección poli-A de ARN maduros usando el flujo de trabajo DMS-MaPseq. A continuación, enjuaga el complejo de ARN perla-naciente dos veces con 500 microlitros de tampón alto en sal.

Luego enjuaga una vez con 500 microlitros de tampón de unión 1X, seguido de un enjuague final con 500 microlitros de tampón bajo en sal. Ahora añade 300 microlitros de reactivo de ARN al complejo perla=ARN naciente, resuspende completamente e incuba en el termomezclador durante cinco minutos a 60 grados Celsius. Después, añade 60 microlitros de cloroformo, haz un vórtice e incuba durante tres minutos a temperatura ambiente.

Centrifuga la muestra a 14.000 x g durante cinco minutos en la centrífuga de pre-enfriamiento. Finalmente, transfiere la fase acuosa superior de aproximadamente 180 microlitros a un nuevo tubo de recogida. Descarta la fase orgánica restante, dejando atrás las perlas y la solución acuosa residual.

Tras purificar el ARN naciente, realizar la transcripción inversa de conmutación de plantillas, ligar el adaptador 5' y seleccionar bibliotecas para secuenciar. La visualización de los productos de prueba de PCR en un gel al 1%agarosa reveló una formación mínima de dímeros cebadores y una citología característica de alrededor de 300 pares de bases para secuenciación de seguimiento co-transcripcional de estructuras o bibliotecas CoSTseq y DMS-MaPseq. El electroferograma de la primera muestra de CoSTseq confirmó la distribución del tamaño de la biblioteca con un pico de alrededor de 285 pares de bases.

La alineación de lecturas del ARNm ASC1 reveló que la biblioteca CoSTseq incluía cobertura en todo el intrón, confirmando que el ARN está en fase incipiente. Mientras que la biblioteca DMS-MaPseq carecía de cobertura de intrones, lo que indica que el ARN está maduro. La matriz de plegamiento transcripcional COT del pre-ARNr 18S reveló que la reactividad del DMS mostraba cambios abruptos a medida que la ARN polimerasa progresaba de la posición 790 a la 811 a lo largo del locus de ADNr.

El análisis de reactividad por DMS del ARNm de ADH1 mostró perfiles similares entre las formas naciente y madura, indicando regiones de estabilidad estructural. En contraste, el ARNm de SSA2 mostró regiones de diferente reactividad DMS entre formas nacientes y maduras, lo que sugiere cambios estructurales durante la maduración. Con CoSTseq, los investigadores pueden determinar in vivo estructuras secundarias de ARN naciente y la posición de la ARN polimerasa a lo largo de los transcritos de ARN.

CoSTseq tiene pasos con plazos y utiliza productos químicos tóxicos. Es mejor procesar no más de dos muestras a la vez. A partir del ARN total generado por CoSTseq, los ARN no biotinilados pueden utilizarse para sondeo concurrente de estructuras maduras utilizando DMS-MaPseq tradicional.