Análisis comparativo de la estructura del ARN de transcritos nacientes y maduros en Saccharomyces cerevisiae
27 de febrero de 2026
La estructura secundaria del ARN se ha observado principalmente en ARN maduro mediante métodos de sondeo estructural. La secuenciación de seguimiento de estructura co-transcripcional (CoSTseq) unifica el funcionamiento nuclear, que se ha utilizado para estudiar la posición de la polimerasa en ARN naciente, mediante sondeo estructural. CoSTseq permite así la observación de la estructura secundaria del ARN en ARN bajo transcripción activa.
Estudiamos el procesamiento de ARN cotranscripcional, y eso incluye cómo el ARN naciente se pliega al emerger de la ARN polimerasa que lo sintetiza. Antes de este método, no podíamos monitorizar cómo se pliega el ARN durante la síntesis, y esto nos estaba frenando en nuestra investigación. Así que este nuevo método supera esos vacíos.
CoSTseq se desarrolló para investigar el plegamiento de ARN naciente en levaduras. Es especialmente eficaz para analizar ARN de alta abundancia. Para empezar, inocular la cepa BY4741 de Saccharomyces cerevisiae en 50 mililitros de medio YPAD e incubar a 30 grados Celsius con agitación a 200 revoluciones por minuto hasta que el cultivo alcance la fase media logarítmica.
Recoger aproximadamente tres mililitros de cultivo de levadura correspondientes a 1,8 unidades de densidad óptica y centrifugar a 2.500 x g durante tres minutos a cuatro grados Celsius usando una centrífuga preenfriada. Descarta el sobrenadante en un contenedor de residuos. Suspende el pellet en 10 mililitros de PBS frío y centrifuga de nuevo a 2.500 x g durante tres minutos a cuatro grados Celsius.
Quita el sobrenadante y guarda el pellet de levadura en hielo. Resuspende cuidadosamente el pellet de levadura en 10 mililitros de sarkosyl al 0,5% frío sin crear burbujas. Incubar la levadura resuspendida sobre hielo durante 20 minutos para permitir la permeación, luego pelletar las células a 400 x g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y volver a suspender las células permeables de levadura en 100 microlitros de agua sin nucleasas usando una pipeta P-1000.
Preparar una solución operativa de 2,5X de tampón de transcripción con cinco milimolares de ditiotreitol recién añadido y precalentar 2,5X de tampón de sondeo de estructura a 30 grados Celsius. En un tubo limpio de dos mililitros, añade todos los componentes de reacción necesarios y mezcla bien. A continuación, añade 100 microlitros de las células de levadura preparadas al tubo de reacción e incubalas en el mezclador térmico a 30 grados Celsius, agitando a 500 revoluciones por minuto durante dos minutos.
Luego añade rápidamente 200 microlitros del tampón de sondeo estructural precalentado 2,5X y 25 microlitros de reactivo de sulfato de dimetilo simultáneamente. Haz un vórtice suave en dos pulsos y colócalo de nuevo en la incubadora a 30 grados Celsius y 500 revoluciones por minuto. Continúa incubando en la termomezcladora durante cuatro minutos, espaciando 30 segundos entre muestras.
Prepara los amortiguadores de parada y lavado con antelación y colócalos sobre hielo hasta que se usen. Detiene la metilación del sulfato de dimetilo añadiendo un mililitro de tampón de parada al tubo de reacción. Ahora centrifuga las muestras marcadas con sulfato de dimetilo a 3.500 x g durante cinco minutos en una centrífuga pre-enfriada.
Después del giro, descarta el sobrenadante en un contenedor de residuos adecuado. Añade un mililitro de buffer de lavado frío al pellet y vuelve a suspender. Repite la centrifugación a 3.500 x g durante cinco minutos.
Procede inmediatamente a la extracción de ARN y no congeles el pellet de levadura. Resuspende el pellet de levadura marcado con sulfato de dimetilo en 600 microlitros de tampón de lisis de ARN y luego transfiere la suspensión a un tubo que contiene 40 microlitros de dodecilo sulfato al 20% de sodio. Incubar la muestra a 65 grados Celsius durante 30 segundos, agitando a 950 revoluciones por minuto.
A continuación, realiza la extracción de fenol-cloroformo del ARN siguiendo el procedimiento estándar. Toma en vórtice las perlas magnéticas de estreptavidina y transfiere 44 microlitros de las perlas a un nuevo tubo por cada muestra de 80 microgramos de ARN total. Coloca las cuentas magnéticas sobre una rejilla magnética hasta que se asienten.
Después de retirar el buffer de almacenamiento, vuelve a suspender las perlas en un mililitro de buffer de pre-lavado A. Ahora incuba la suspensión durante dos minutos a temperatura ambiente, luego magnetiza y retira el sobrenadante. Después del lavado, vuelve a suspender las perlas en 88 microlitros de buffer de unión 2X. Transfiere 80 microlitros de la suspensión a un tubo estéril de 1,5 mililitros que contenga 80 microgramos de muestra de ARN biotinilado en 80 microlitros.
Gira la mezcla de la muestra de perlas en un rotador durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego coloca el tubo en la rejilla magnética para recoger el flujo que contiene ARN maduro y guardarlo para la precipitación y realizar la selección poli-A de ARN maduros usando el flujo de trabajo DMS-MaPseq. A continuación, enjuaga el complejo de ARN perla-naciente dos veces con 500 microlitros de tampón alto en sal.
Luego enjuaga una vez con 500 microlitros de tampón de unión 1X, seguido de un enjuague final con 500 microlitros de tampón bajo en sal. Ahora añade 300 microlitros de reactivo de ARN al complejo perla=ARN naciente, resuspende completamente e incuba en el termomezclador durante cinco minutos a 60 grados Celsius. Después, añade 60 microlitros de cloroformo, haz un vórtice e incuba durante tres minutos a temperatura ambiente.
Centrifuga la muestra a 14.000 x g durante cinco minutos en la centrífuga de pre-enfriamiento. Finalmente, transfiere la fase acuosa superior de aproximadamente 180 microlitros a un nuevo tubo de recogida. Descarta la fase orgánica restante, dejando atrás las perlas y la solución acuosa residual.
Tras purificar el ARN naciente, realizar la transcripción inversa de conmutación de plantillas, ligar el adaptador 5' y seleccionar bibliotecas para secuenciar. La visualización de los productos de prueba de PCR en un gel al 1%agarosa reveló una formación mínima de dímeros cebadores y una citología característica de alrededor de 300 pares de bases para secuenciación de seguimiento co-transcripcional de estructuras o bibliotecas CoSTseq y DMS-MaPseq. El electroferograma de la primera muestra de CoSTseq confirmó la distribución del tamaño de la biblioteca con un pico de alrededor de 285 pares de bases.
La alineación de lecturas del ARNm ASC1 reveló que la biblioteca CoSTseq incluía cobertura en todo el intrón, confirmando que el ARN está en fase incipiente. Mientras que la biblioteca DMS-MaPseq carecía de cobertura de intrones, lo que indica que el ARN está maduro. La matriz de plegamiento transcripcional COT del pre-ARNr 18S reveló que la reactividad del DMS mostraba cambios abruptos a medida que la ARN polimerasa progresaba de la posición 790 a la 811 a lo largo del locus de ADNr.
El análisis de reactividad por DMS del ARNm de ADH1 mostró perfiles similares entre las formas naciente y madura, indicando regiones de estabilidad estructural. En contraste, el ARNm de SSA2 mostró regiones de diferente reactividad DMS entre formas nacientes y maduras, lo que sugiere cambios estructurales durante la maduración. Con CoSTseq, los investigadores pueden determinar in vivo estructuras secundarias de ARN naciente y la posición de la ARN polimerasa a lo largo de los transcritos de ARN.
CoSTseq tiene pasos con plazos y utiliza productos químicos tóxicos. Es mejor procesar no más de dos muestras a la vez. A partir del ARN total generado por CoSTseq, los ARN no biotinilados pueden utilizarse para sondeo concurrente de estructuras maduras utilizando DMS-MaPseq tradicional.
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Overview
This article presents Co-transcriptional Structure Tracking sequencing (CoSTseq), a method for probing the secondary structure of nascent RNA as it emerges from RNA polymerase in Saccharomyces cerevisiae. CoSTseq enables simultaneous mapping of RNA polymerase position and RNA base pairing status, overcoming previous limitations in studying transient, low-abundance nascent transcripts. The protocol also allows parallel analysis of mature RNA structures using DMS-MaPseq.
Key Study Components
Area of Science
- RNA biology
- Structural genomics
- Molecular genetics
Background
- RNA secondary structures formed during transcription influence gene expression, RNA processing, translation, and stability.
- Traditional methods primarily analyze mature RNA, leaving nascent RNA folding poorly understood.
- Nascent RNAs are rare and transient, making their isolation and structural characterization challenging.
- Understanding cotranscriptional folding is critical for elucidating RNA function and regulation.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a protocol for capturing the structure of nascent RNA in vivo.
- To simultaneously determine RNA polymerase position and RNA base pairing status during transcription.
- To compare nascent and mature RNA structures within the same experimental framework.
Methods Used
- Growth and preparation of S. cerevisiae cultures.
- Transcriptional run-on with biotin-NTP incorporation to stall RNA polymerase at active sites.
- DMS (dimethyl sulfate) treatment to methylate unpaired A, C, and U nucleotides in RNA.
- Biotin-based enrichment of nascent RNA using streptavidin magnetic beads.
- RNA extraction, reverse transcription with template switching, and library preparation for sequencing.
- Parallel DMS-MaPseq workflow for mature RNA structure analysis.
Main Results
- CoSTseq libraries showed coverage across introns, confirming capture of nascent RNA, while DMS-MaPseq libraries lacked intron coverage, indicating mature RNA.
- DMS reactivity profiles revealed abrupt structural changes in 18S pre-rRNA as RNA polymerase progressed along the gene.
- ADH1 mRNA displayed similar DMS reactivity in nascent and mature forms, suggesting structural stability.
- SSA2 mRNA exhibited differences in DMS reactivity between nascent and mature forms, indicating structural remodeling during maturation.
Conclusions
- CoSTseq enables in vivo mapping of nascent RNA secondary structures and RNA polymerase positions.
- The method provides insights into cotranscriptional RNA folding and structural transitions during RNA maturation.
- CoSTseq can be performed alongside DMS-MaPseq for comprehensive analysis of RNA structure dynamics.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Co-transcriptional Structure Tracking sequencing (CoSTseq) enables direct analysis of nascent RNA folding and polymerase position in vivo, addressing a critical gap in understanding RNA structure dynamics during transcription. This capability enhances predictive confidence in gene regulation studies and supports mechanistic de-risking at the target validation stage. Integrating nascent and mature RNA structure analysis informs early discovery decisions and portfolio triage in RNA-targeted drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RNA folding states as transcripts emerge from RNA polymerase.
- Supports functional target validation by mapping structural transitions relevant to gene regulation.
- Improves predictive confidence in RNA-targeted therapeutic hypotheses.
- Facilitates portfolio triage by distinguishing stable versus dynamic RNA regions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RNA structure datasets for downstream screening workflows.
- Enables assay standardization by providing quantitative DMS reactivity profiles.
- Supports reproducibility through parallel analysis of nascent and mature transcripts.
- Facilitates reliable evaluation of compound effects on RNA structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns RNA structure analysis with disease-relevant gene expression systems.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of RNA-targeted mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement by revealing structural remodeling during RNA maturation.
- Supports mechanistic de-risking for RNA-based therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
CoSTseq integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, enabling comprehensive RNA structure analysis at multiple pipeline stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping nascent RNA folding in vivo.
- Screening: Provides quantitative, reproducible DMS reactivity outputs for assay readiness.
- Analytics: Delivers paired-end sequencing data to compare structural states across transcript maturation.
- Translational Research: Connects RNA structure dynamics to disease-relevant gene expression and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for RNA structure analysis across diverse targets and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes RNA structure probing with scalable, parallelizable workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying RNA structural transitions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biology, sequencing, and chemical probing techniques.
- Needs access to paired-end sequencing platforms and analytical infrastructure for DMS reactivity analysis.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptation may be needed for different yeast strains or RNA abundance levels.
- Throughput is limited by time-sensitive steps and handling of toxic chemicals.
