Name: Análisis comparativo de la estructura del ARN de transcritos nacientes y maduros en Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende CoSTseq para mapear estructuras de ARN naciente y posición de ARN polimerasa en Saccharomyces cerevisiae. Este método computacional revela plegamiento cotranscripcional y dinámica estructural durante la maduración del ARN.

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<ol><li>Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+opportunities+in+RNA+structure+experimental+determination+and+computational+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling.</a> Nature Methods. 19 (10), 1193-1207 (2022).</li>
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<li>Rodgers, M., Woodson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+for+rRNA+folding+and+assembly+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">A roadmap for rRNA folding and assembly during transcription.</a> Trends in biochemical sciences. 46 (11), 889-901 (2021).</li>
<li>Tomezsko, P., Swaminathan, H., Rouskin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMS-MaPseq+for+Genome-Wide+or+Targeted+RNA+Structure+Probing+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DMS-MaPseq for Genome-Wide or Targeted RNA Structure Probing In Vitro.</a> Methods in Molecular Biology. 2254, 219-238 (2021).</li>
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<li>Hawley, D. K., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+steps+in+transcription+initiation+and+reinitiation+from+the+major+late+promoter+in+a+HeLa+nuclear+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional steps in transcription initiation and reinitiation from the major late promoter in a HeLa nuclear extract.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (8), 3452-3461 (1987).</li>
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<li>Tijerina, P., Mohr, S., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMS+foot-printing+of+structured+RNAs+and+RNA-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">DMS foot-printing of structured RNAs and RNA-protein complexes.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2608-2623 (2007).</li>
<li>Liebig, A., Waldsich, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+RNA+structure+within+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing RNA structure within living cells.</a> Methods in enzymology. 468, 219-238 (2009).</li>
<li>Pelechano, V., Chávez, S., Pérez-Ortín, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Complete+Set+of+Nascent+Transcription+Rates+for+Yeast+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Complete Set of Nascent Transcription Rates for Yeast Genes.</a> PLOS ONE. 5 (11), (2010).</li>
<li>Wery, M., Descrimes, M., Thermes, C., Gautheret, D., Morillon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-mediated+RNA+fragmentation+allows+robust+transcript+reassembly+upon+whole+transcriptome+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Zinc-mediated RNA fragmentation allows robust transcript reassembly upon whole transcriptome RNA-Seq.</a> Methods. 63 (1), 25-31 (2013).</li>
<li>Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+T4+polynucleotide+kinase%3A+an+RNA+repair+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme.</a> The EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).</li>
<li>Köster, J., Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake+a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fastp%3A+an+ultrafast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">fastp: an ultrafast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics+%28Oxford%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithms+for+efficiently+collapsing+reads+with+Unique+Molecular+Identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Algorithms for efficiently collapsing reads with Unique Molecular Identifiers.</a> PeerJ. 7, (2019).</li>
<li>Spasic, A., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+RNA+secondary+structure+folding+ensembles+using+SHAPE+mapping+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling RNA secondary structure folding ensembles using SHAPE mapping data.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 314-323 (2018).</li>
<li>Saldi, T., Fong, N., Bentley, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+elongation+rate+affects+nascent+histone+pre-mRNA+folding+and+3%E2%80%B2+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription elongation rate affects nascent histone pre-mRNA folding and 3′ end processing.</a> Genes & Development. 32 (3-4), 297-308 (2018).</li>
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<li>Yu, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computationally+reconstructing+co-transcriptional+RNA+folding+from+experimental+data+reveals+rearrangement+of+nonnative+folding+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Computationally reconstructing co-transcriptional RNA folding from experimental data reveals rearrangement of nonnative folding intermediates.</a> Molecular Cell. 81 (4), 870-883 (2021).</li>
<li>Yu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+eukaryotic+nascent+RNA+structure+elucidates+cotranscriptional+folding+and+its+antimutagenic+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of eukaryotic nascent RNA structure elucidates cotranscriptional folding and its antimutagenic effect.</a> Nature communications. 14 (1), (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ATP 10mM</td><td>Invitrogen</td><td>18330019</td><td></td></tr><tr><td>10mM Biotina-11-CTP</td><td>Biociencias de Jena</td><td>NU-831-BIOX</td><td></td></tr><tr><td>10mM GTP</td><td>Invitrogen</td><td>18332015</td><td></td></tr><tr><td>10mM UTP</td><td>Invitrogen</td><td>18333013</td><td></td></tr><tr><td>10X NEBuffer 1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7001S</td><td>Usado en el paso 7.2.1</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato 10X (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS</td><td>RPI&nbsp;</td><td>L23100-500</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:cloroformo ácido y nbsp;</td><td>Ambión</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas AMPure XP para la selección de tamaño</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>A63880</td><td>Usado para la selección de tamaño en el paso 7.5.1</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura bacto</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bicicleta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B3876-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319988</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-GLUCOSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>DIFCO AGAR</td><td>BD DIFCO</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D186309-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Dinabeads y comercio; Cuentas de estreptavidina C1 MyOne &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td>Utilizado para el pulldown de biotina en la Sección 4.1</td></tr><tr><td>Dinabeads y comercio; ARNm DIRECTO & COMERCIO; Kit de purificación</td><td>Invitrogen</td><td>61011</td><td>Utilizado para la selección Poly A en la Sección 5.1</td></tr><tr><td>EDTA, pH 8, 0,5M</td><td>Sigma Aldrich y Sigma Aldrich;</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td>Co-precipitante usado en los pasos 4.2.7 y 5.2.4</td></tr><tr><td>Induro y reg; &nbsp; Transcriptasa inversa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0681S</td><td>Enzima RT utilizada en el paso 6.3.1</td></tr><tr><td>Alcohol isoamílico</td><td>Sigma Aldrich y Sigma Aldrich;</td><td>W205710-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>JT-BAKER</td><td>9084-05-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de PCR KAPA HiFi HotStart &nbsp; &nbsp;</td><td>Roche</td><td>07958889001</td><td>ADN Pol de alta fidelidad usado en 7.3.2 y 7.4.1 para reacciones PCR</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLCM2154</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación PCR MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Usado para la limpieza de ADN en los pasos 6.3.3 y 7.2.2</td></tr><tr><td>Ligasa de ARN M-ésimo</td><td>New England Biolabs</td><td>M2611A</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Clean & Concentrador</td><td>Zymo Research</td><td>D4060</td><td>Sugieren para la limpieza de ADN Oligo en el paso 7.1.2</td></tr><tr><td>Acetato de Potasio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236497-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>JT Baker</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Avantor</td><td>6984-04-01</td><td></td></tr><tr><td>ARN Limpio y Concentrador-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1014</td><td>Kit de limpieza de ARN utilizado en el paso 5.3.2 tras el tratamiento con PNK</td></tr><tr><td>RNaseOUT y comercio; Inhibidor de la ribonucleasa recombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td>Inhibidor de RNasa utilizado en el paso 5.3.1 durante el tratamiento con PNK</td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>IBI Scientific</td><td>IB07080</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Calidad Biológico</td><td>351-035-721</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5150-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio y nbsp;</td><td>Macron</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&middot; En y comercio; Inhibidor de RNasa (20 U/&mu; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2696</td><td>Inhibidor de RNasa usado en el paso 6.3.1</td></tr><tr><td>Polinucleótido quinasa T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Termoestable 5' App ADN/ARN Ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0319L</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 7,4, 1M</td><td>Termo Científica</td><td>J60202. K2</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>TEKNOVA</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&trade; Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Para la elución de ARN incipiente en la Sección 4.2; también denominado "reactivo de ARN" en la Sección 4</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis comparativo de la estructura del arn de transcritos nacientes y maduros en saccharomyces cerevisiae

Comparative RNA Structure Analysis of Nascent and Mature Transcripts in Saccharomyces cerevisiae

Análisis comparativo de la estructura del ARN de transcritos nacientes y maduros en Saccharomyces cerevisiae

During transcription, nascent RNA starts base pairing as it exits RNA polymerases (Pols). This base pairing permits the formation of RNA structures that ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este protocolo, la expresión de genes en la levadura...

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

Este protocolo describe un procedimiento experimental para la realización de...

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

El nivel de estado estacionario de ARNm específicos se determina por la velocidad de síntesis y la descomposición del ARNm. Las tasas de degradación de ARNm de todo el genoma o las tasas de descomposición de ARNm específicos se pueden medir mediante la determinación de ARNm de vida media. Este protocolo se centra en la medición de las tasas de descomposición de ARNm en Saccharomyces cerevisiae.

La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Uso<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

Aquí, presentamos un protocolo usando RNA-seq para controlar los niveles de mRNA con el tiempo durante la respuesta hipóxica de las células de S. cerevisiae . Este método puede adaptarse para analizar la expresión génica durante cualquier respuesta celular.

Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica

El protocolo aquí descrito se basa en la cuantificación del genoma de mRNA recién sintetizada purificada de células de levadura con 4-tiouracilo. Este método permite para medir la síntesis de mRNA desacoplado del decaimiento del mRNA y por lo tanto, proporciona una medida exacta de la transcripción del RNA polimerasa II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Aquí presentamos un protocolo para el escote dependiente de DNAzyme de ARN. Esto permite un análisis rápido y dependiente del sitio del ARN 2'-O-metilación. Este enfoque se puede utilizar para la evaluación preliminar o importante de la actividad del esnoRNA.

Análisis dependiente de DNAzyme de rRNA 2'-O-Methylation

La reticulación cinética y el análisis del ADNc es un método que permite la investigación de la dinámica de las interacciones proteína-ARN en células vivas a alta resolución temporal. Aquí se describe el protocolo en detalle, incluido el crecimiento de células de levadura, la reticulación UV, la recolección, la purificación de proteínas y los pasos de preparación de la biblioteca de secuenciación de próxima generación.

Monitorización de la dinámica de interacción proteína-ARN in vivo a alta resolución temporal utilizando χCRAC

Este protocolo describe cómo generar un perfil de polisoma sin utilizar generadores de gradiente automatizados o sistemas de fraccionamiento de gradiente.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

El protocolo proporciona instrucciones para modificar el ARN con sulfato de dimetilo para experimentos de perfiles mutacionales. Incluye sondeo in vitro e in vivo con dos métodos alternativos de preparación de bibliotecas.

Sondeo de la estructura del ARN con perfil mutacional de sulfato de dimetilo con secuenciación in vitro y en células

Este protocolo mide cuantitativamente la estabilidad y la vida media de ARN potenciadores intergénicos e intragénicos en células madre embrionarias de ratón mediante tratamiento con Actinomicina D, RT-qPCR y análisis de regresión no lineal. Se incorporan estrategias de normalización específicas por posición para modelar con precisión la dinámica de desintegración del ARNe de manera dependiente del contexto.

Evaluación cuantitativa optimizada de la estabilidad del ARN potenciador en células madre embrionarias de ratón

Proporcionamos métodos detallados para marcar y purificar metabólicamente los transcritos nacientes para el análisis transcriptomático en embriones tempranos de Xenopus utilizando 5-etinil-uridina (5-EU).

Marcado metabólico del transcriptoma naciente en Xenopus embriogénesis temprana

Aprende CoSTseq para mapear estructuras de ARN naciente y posición de ARN polimerasa en Saccharomyces cerevisiae. Este método computacional revela plegamiento cotranscripcional y dinámica estructural durante la maduración del ARN.

Análisis comparativo de la estructura del ARN de transcritos nacientes y maduros en Saccharomyces cerevisiae

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