Método de interacción ADN-ADN con cromatina asociada a ARN

Desarrollamos el método de interacción ADN-ADN con cromatina asociada a ARN, o método RDD, para mapear el contacto con la cromatina organizado por moléculas específicas de ARN. RDD mapea de forma robusta la banda de anillas específicas de ARN y la interacción a largo alcance entre ARN endógenos y exógenos. Para empezar, resuspende el núcleo permeabilizado derivado de células reticuladas dobles de Drosophila S2 en 15 mililitros de tampón de lisis al 0,1% FA que contiene Triton X-100.

Alitera 1,5 mililitros de la suspensión nuclear en un tubo de ensayo de fondo redondo de 14 mililitros evitando la formación de burbujas. Sonica la suspensión a una amplitud del 38% durante 4,5 minutos usando ciclos de 30 segundos encendidos y 30 segundos apagados. Recoge la cromatina sonicada en un tubo de 15 mililitros y centrifuga a 3, 200g durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Transfiere aproximadamente 13 mililitros del sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros. Ahora, añade 100 microlitros de esferas preparadas de estreptavidina C1 al tubo que contiene cromatina sonicada y gíralos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Luego, coloca el tubo sobre una rejilla magnética durante un minuto y transfiere el sobrenadante que contiene la cromatina pre-limpiada a un nuevo tubo de 50 mililitros.

Guarda una alícuota de 10 microlitros a menos 20 grados Celsius para su análisis. Incubar 26 mililitros de tampón de hibridación recién preparado con 13 mililitros de cromatina pre-limpiada en un rotador durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se divide la mezcla de hibridación en tres tubos de 15 mililitros y se añaden seis microlitros de sondas biotiniladas de 100 micromolares a cada muestra.

Después de sellar las tapas de los tubos con película, gira los tubos a 37 grados Celsius durante la noche. Después de bloquear las perlas de estreptavidina C1, retirar el tampón de bloqueo y volver a suspender las perlas en 400 microlitros de tampón de hibridación. Ahora, añade las perlas de estreptavidina C1 tratadas con tampón bloqueante a la cromatina hibridada correspondiente preparada previamente.

Gira la mezcla durante 2,5 horas a temperatura ambiente. Después de descartar el sobrenadante y transferir las perlas a un tubo de 1,5 mililitros, lava las esferas cinco veces con 800 microlitros de tampón de lavado y luego dos veces con tampón TE. Tras el lavado final, descartar el sobrenadante y volver a suspender las perlas en 1.000 microlitros de tampón TE que contenga 1X inhibidor de proteasa a temperatura ambiente.

Para bloquear sitios desocupados en las perlas de estreptavidina C1 unidas al complejo sonda-cromatina, añade 220 microlitros de IPB desnaturalizado a las perlas y gira el tubo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras la incubación, lava las perlas de estreptavidina C1 cinco veces usando un tampón TE. A continuación, añade 693 microlitros de mezcla de reparación final a la cromatina de las perlas de estreptavidina C1 y mezcla bien.

Luego, añade siete microlitros de ADN polimerasa T4. Incuba la mezcla en un termomezclador a 800 revoluciones por minuto y a 12 grados Celsius durante 30 minutos. Luego incuba la muestra en una batidora a 16 grados Celsius durante 15 minutos.

Lava las perlas tres veces con 800 microlitros de buffer ChIA-PET bien frío y luego una vez con buffer TE. Luego, añade 693 microlitros de mezcla A-tailing a la cromatina de las perlas de estreptavidina C1 y mezcla bien. A continuación, añade siete microlitros del fragmento de Klenow tres primos a cinco primos de exonucleasa menos.

Incuba el tubo en una batidora a 12 revoluciones por minuto y a 37 grados Celsius durante 50 minutos. Lava las perlas tres veces con 800 microlitros de tampón ChIA-PET helado y luego una vez con tampón de elución pipeteando suavemente. Ahora, añade 1.390 microlitros de mezcla de ligadura por proximidad a la cromatina en las perlas de estreptavidina C1 e incuba en una batidora a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Añade 10 microlitros de ligasa de ADN T4 a la mezcla e incuba con rotación a 20 revoluciones por minuto a temperatura ambiente durante cinco minutos, luego cambia a 12 revoluciones por minuto a temperatura ambiente durante 50 minutos y continúa la incubación a 16 grados Celsius durante la noche. Después, lava las perlas tres veces con 800 microlitros de buffer ChIA-PET bien frío y luego dos veces con buffer TE. Para liberar cromatina, añade 480 microlitros de tampón de elución LC ChIP a la cromatina en las perlas de estreptavidina C1 y mezcla bien.

Añade 20 microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K para descruzar. Incuba el tubo en un termomezclador a 950 revoluciones por minuto y a 65 grados Celsius durante la noche, luego purifica el ADN ligado por proximidad usando un reactivo fenol:cloroformo:isoamilo alcohol. Añadir todos los componentes necesarios para la prueba de etiquetado Tn5 en un volumen total de reacción de 50 microlitros en un tubo PCR sobre hielo.

Incuba la reacción de etiquetado a 55 grados Celsius durante 10 minutos en un termociclador con la tapa ajustada a 70 grados Celsius, y luego mantenla a cuatro grados Celsius. Añadir 50 microlitros de buffer de elución ChIP y un microlitro de proteinasa K al ADN marcado. Mezcla la solución e incuba en un termomezclador a 65 grados Celsius y 900 revoluciones por minuto durante 30 minutos.

Purifica el ADN usando un kit de purificación de ADN y cuantifica el ADN mediante un sistema automático de electroforesis capilar. Añadir todo el ADN fragmentado ligado a perlas M280 prebloqueadas con buffer bloqueador y ADN genómico y mezclar la suspensión. Gira el tubo de una batidora a temperatura ambiente durante 45 minutos.

Tras un breve giro, coloca el tubo sobre una estantería magnética y descarta el sobrenadante. Siguiendo los pasos de lavado, añade 30 microlitros de tampón de elución a las perlas sin mezclar. Prepara la mezcla PCR según el kit de preparación de la biblioteca de ADN.

Transfiere los tubos de PCR a una máquina de PCR y prepara el programa de amplificación. Finalmente, tras purificar el producto de PCR usando perlas magnéticas, se miden entre 10 y 30 nanogramos de ADN biblioteca utilizando un cuantificador de ácidos nucleicos para preparar la muestra para la secuenciación. Los fragmentos de cromatina sonicada oscilaban entre aproximadamente 1.000 y 3.000 pares de bases, lo que indica una fragmentación exitosa.

La cromatina asociada al ARN mostró un rango de tamaño de fragmento que oscilaba aproximadamente entre 1.000 y 3.000 pares de bases. La cromatina marcada con Tn5 mostró una distribución de fragmentos indicativa de la eficiencia de la etiquetación de la cromatina. La biblioteca de secuenciación tras la amplificación mostró una distribución del tamaño de fragmentos que oscilaba aproximadamente entre 180 y 1.000 pares de bases.

Tras la selección de tamaño, los fragmentos de la biblioteca de secuenciación se enriquecieron predominantemente en un rango de aproximadamente 250 a 600 pares de bases. La interacción ADN-ADN con cromatina asociada al ARN, o método RDD, detectó las ubicaciones genómicas de la unión de NC RNA roX2 y 7SK, junto con los correspondientes bucles de interacción remota con cromatina. Los datos de la ARN polimerasa II ChIA-PET revelan una clara relación reguladora entre estos ARN NC y la expresión génica, con picos que indican la fuerza de interacción.

El análisis multidimensional se logró integrando interacciones ancladas en RDD con mapas de conformación de cromatina genómica Hi-C y marcas epigenómicas, transcripción incipiente y datos de ARN polimerasa II ChIA-PET. En estas regiones, se visualizaron claramente los dominios asociados topológicamente, con bucles de cromatina guiados por ARN a menudo situados en sus límites o que abarcan múltiples de estos dominios. Además, se determinaron los centros reguladores centrados en el ARN.

RDD e interacciones ancladas de cromatina que revelan sitios de unión al ARN e interacciones ADN-ADN asociadas en la organización del genoma 3D. Las enseñanzas clave son mantener las proporciones adecuadas de sonda, enlace y cromatina, y bloquear los sitios de estreptavidina no acotados con la biotina natural antes de la ligadura de la polimerasa. Estudios futuros pueden explorar cómo el ARN enrolla dinámicamente las interacciones de cromatina a través del desarrollo, las perturbaciones y las infecciones.