Protocolo quirúrgico para una ventana craneal grande y resellable que permite grabaciones electrofisiológicas longitudinales y multimodales de la red de modo predeterminado del ratón

La Red de Modo Predeterminado o DMN es una red crucial y a gran escala, implicada en una variedad de funciones cognitivas y trastornos neuropsiquiátricos como la depresión. Estudiar la dinámica compleja de la DMN en modelos animales ofrece información invaluable sobre su función tanto en estados sanos como patológicos. Sin embargo, un desafío importante ha sido realizar registros electrofisiológicos estables, a largo plazo y a gran escala de los múltiples nodos profundos y distribuidos, la DMN, en ratones despiertos y en comportamiento.

Aquí presentamos un novedoso protocolo quirúrgico bifásico desarrollado en el laboratorio de Eero Castren. Esta técnica crea una ventana craneal grande, duradera y resellable que permite registros longitudinales repetidos de más de 1.000 canales de electrodos simultáneamente. Esto se logra combinando microelectrocorticografía a nivel superficial, micro-ECoG, con dos sondas Neuropixels, permitiendo un acceso sin precedentes a la Red de Modo Predeterminado.

Este vídeo ofrecerá una guía paso a paso de este robusto procedimiento quirúrgico, desde la preparación animal y la implantación de placas frontales hasta la creación de la ventana craneal crónica, asegurando una adquisición de datos de alta calidad y a largo plazo para la investigación en neurociencia en red. Todos los procedimientos mostrados fueron aprobados por la Junta Nacional de Experimentos en Finlandia y cumplen con la directiva europea para la protección de los animales utilizados con fines científicos. Fase 1, Preparación del Animal e Implantación de la Placa de la Cabeza.

Para realizar este procedimiento, comienza preparando todos los materiales y equipos quirúrgicos necesarios. Anestesiar al ratón con un 4% de isoflurano y mantener la anestesia entre el 1,5 y el 2,5% con un caudal de oxígeno de 0,5 litros por minuto. Afeita el pelaje de la parte superior de la cabeza y coloca al animal sobre una almohadilla térmica controlada equipada con un sensor interno de temperatura calibrado para mantener la temperatura corporal en 37 grados Celsius durante todo el procedimiento.

Aplica pomada ocular de carbómero para evitar la sequedad corneal. Asegurar al ratón en el marco estereotáctico de modo que el cráneo quede plano y administrar analgésicos preoperatorios y agentes antiinflamatorios mediante inyecciones subcutáneas, Carprofeno, Buprenorfina y Dexametasona. Desinfectar la zona afeitada con solución de povidona-yodo e inyectar solución de lidocaína-epinefrina como anestésico local bajo la piel del cuero cabelludo.

Realiza una pequeña incisión transversal en la línea de la orde y amplía la incisión progresivamente hasta exponer completamente la parte superior de la superficie del cráneo. Limpia cuidadosamente el cráneo expuesto con acetona hasta que se haya retirado todo periosteo visible para asegurar una fuerte adherencia del implante. Utiliza una hoja roma y circular para eliminar cualquier fragmento residual de tejido periosteal y conectivo que el lavado con acetona no haya resuelto completamente.

Con el dispositivo estereotáctico, marca un área rectangular de 4 milímetros por 7,6 milímetros en el cráneo respecto al bregma. El rectángulo debe extenderse dos milímetros lateralmente desde el bregma por ambos lados, tres milímetros rostral y 4,6 milímetros caudalmente. A continuación, marque los dos sitios de inserción de la sonda intracraneal en el hemisferio derecho.

Marque el sitio de la sonda rostral a 1,66 milímetros anterior y 1,95 milímetros lateral del bregma, y el sitio de la sonda caudal a 2,2 milímetros posterior y 1,9 milímetros lateral del bregma. A continuación, graba un patrón cruzado sobre todas las superficies óseas expuestas fuera del área designada de la ventana usando una hoja quirúrgica número 11, y produce unas ranuras poco profundas pero definidas de aproximadamente 0,2 a 0,4 milímetros de profundidad para formar una cuadrícula uniforme de aproximadamente uno por un milímetro de cuadrados. Crea un aplicador de pegamento fino colocando una aguja estéril de 30G en la punta de un hisopo de algodón y dobla la aguja en forma de V.

Dispensa cola de cianoacrilato en un pesador de plástico desechable y sumerge el aplicador en el depósito de pegamento. Deposita pegamento sobre cada superficie ósea expuesta y grabada, aplicando no más de un depósito por sitio para que la cobertura sea completa, pero nunca excesiva. Deja que el pegamento seque durante siete minutos antes de continuar.

Para implantar el almohadro de referencia, seleccione el lugar de perforación sobre la posición izquierda del cerebelo para evitar vasos superficiales visibles. Taladra el agujero piloto en ráfagas de cinco a diez segundos usando una rebaba redonda de acero a 20.000 a 25.000 disparos por minuto hasta que el agujero se vuelva más translúcido, revelando un tono rosa claro. Inserta el almohadilla de referencia chapada en oro en el agujero piloto, fíjalo con cola de cianoacrilato y refuerza la unión con cemento dental curable por UV.

Curar el cemento dental con una luz LED de curado durante un minuto. A continuación, coloca una pequeña cantidad de cemento dental curable por UV en el vértice del hueso rostral expuesto y coloca la placa de cabeza bajo el cráneo de modo que un borde descanse sobre el andamiaje de cemento dental, curado alrededor del almohadilla de referencia y con el borde opuesto apoyado sobre el dab fresco de cemento rostral. Asegúrate de que la placa frontal esté centrada y nivelada.

Refuerza la estructura aplicando cemento dental alrededor de la base de la placa de la cabeza y rodeando el hueso grabado y el almohadilla de referencia hasta que se forme un recinto continuo y sellado alrededor del perímetro de la futura ventana craneal. Por último, curé el cemento dental con la luz LED del bolígrafo durante un minuto. Una vez que el cemento esté completamente curado, deja que el ratón despierte de la anestesia.

La primera fase ya está completa. Deja que el ratón se recupere durante al menos 48 horas antes de pasar a la siguiente fase. Fase 2, Creación crónica de ventanas craneales.

La segunda fase requiere las mismas herramientas y medicamentos que la primera, salvo la anestesia local. Además, esta fase requiere una membrana PDMS estéril y fina, líquido cefalorraquídeo frío y artificial almacenado en hielo, un sellador de silicona de elastómero y una tapa protectora personalizada impresa en 3D. Al menos 48 horas después de la primera cirugía, reanestesiar al ratón con isoflurano, colócalo sobre la almohadilla térmica del marco estereotáctico y administra los fármacos preoperatorios como en la primera fase, salvo el anestésico local lidocaína-epinefrina.

Comienza a adelgazar el hueso con el taladro dental a lo largo del contorno rectangular marcado en la Fase 1, comenzando en 25.000 disparos por minuto con el dispositivo de perforación en un ángulo de 90 grados respecto a la superficie del hueso, y realiza una o dos pasadas ligeramente más profundas a lo largo de los bordes rectangulares para establecer una ranura inicial de corte. Perfora surcos poco profundos en el hueso y el cemento dental adyacentes a la ventana craneal en las dos coordenadas de inserción de la sonda. Estos surcos sirven como los puntos visuales persistentes que permanecen visibles tras la retirada del colgajo óseo y se utilizan para reposicionar las sondas intracraneales de forma reproducible en sesiones electrofisiológicas posteriores.

Aplica líquido cefalorraquídeo artificial estéril y helado durante la perforación para evitar daños térmicos en la corteza subyacente y minimizar el sangrado. Reduce progresivamente la velocidad del taladro hasta 20.000 disparos por minuto a medida que el hueso se adelgaza. Sigue taladrando a lo largo del perímetro del rectángulo hasta que el hueso dentro del contorno esté aproximadamente un 90% más delgado.

No perfores completamente el cráneo. Cambia al gancho curvo fino de duradura. Introduce la punta bajo el borde del hueso fino con extrema precaución y desliza el gancho a lo largo del perímetro de la ventana, desprendiendo con cuidado el colgajo óseo del cráneo circundante y del tejido subyacente.

Levanta con cuidado el colgajo óseo que se ha desprendido con éxito con el gancho de la duramadre en dirección posterior a anterior, aproximadamente 35 grados por encima de la superficie del cráneo. Agarra el borde levantado con la pinza y balancea suavemente a izquierda y derecha hasta que la placa se suelte por completo. Despeja suavemente la zona expuesta de sangre coagulada con repetidos lavados de ACSF bien frío.

Coloca una única membrana prefabricada de PDMS estéril directamente bajo la superficie dural una vez que haya disminuido el sangrado. Cuando se ajusta correctamente, cubrirá la ventana con precisión y se adhiere pasivamente a la duramadremadre, manteniéndola plana contra el cerebro. Sella la craneotomía aplicando sellador de silicona.

Rellena cada grieta entre el recinto de cemento dental y el borde interior de la placa de la cabeza, rodeando y solapando completamente los bordes de la membrana BDMS. Fija una tapa protectora impresa en 3D personalizada en la placa con una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato para proteger la ventana entre sesiones de grabación. El ratón ya está listo para la recuperación y debe ser trasladado a su jaula para alojarse individualmente y así evitar daños en el implante.

Una cirugía exitosa resulta en una ventana clara y transparente sobre la corteza, con vascularización visible y signos mínimos de inflamación o infección. Esta claridad puede mantenerse durante más de 21 días, lo que permite estudios longitudinales a largo plazo. Las señales electrofisiológicas en bruto registradas durante la ventana crónica mantuvieron alta calidad a lo largo de la línea temporal longitudinal.

Aquí, se muestran junto a los rastros representativos de micro-ECoG de banda ancha muestreados de una rejilla retroesplénica posterior y trazas simultáneas de potencial de campo local de sonda intracraneal muestreadas de un canal cortical superficial durante el primer día de registro y 21 días después. Las grabaciones del día 21 muestran amplitud de señal comparable, contenido espectral y ausencia de artefactos de movimiento y ruido en comparación con las grabaciones del día 0 del mismo animal, confirmando que ni la presencia crónica de la membrana PDMS y el sello de silicona ni las repetidas punciones durales introdujeron una degradación detectable de la calidad de señal tanto de la superficie como de la sonda intracraneal en capas corticales superficiales donde se esperaría que la degradación surgiera primero. La validación principal de esta técnica es la adquisición de datos electrofisiológicos multimodales estables y de alta calidad a lo largo del tiempo.

La ventana resellable permite la inserción repetida de sondas para registrar de las mismas poblaciones neuronales a lo largo de semanas. En toda la banda alfa, las matrices de valores de bloqueo de fase calculadas a partir de canales a lo largo de la sonda caudal de electrodos intracraneales de alta densidad muestran una arquitectura funcional estable entre la línea base y la sesión posttratamiento del día 21. Esto muestra reinserción reproducible en la misma localización cortical en lugar de un trazado formal de las mismas neuronas individuales.

Aunque una pequeña translación de intercesión del vástago impide una afirmación de la misma unidad, se conserva la estructura laminar agregada y regional de las interacciones en banda alfa, lo que apoya que la ventana crónica permite muestreo longitudinal del mismo circuito funcional. Para verificar directamente que la ventana crónica soporta el direccionamiento laminar reproducible de las mismas estructuras profundas a lo largo de las sesiones, se calcularon mapas de densidad de fuente de corriente o CSD a partir de los canales LFP de las sondas. Los perfiles de CSD evocados por estímulos muestran que las firmas esperadas de la fuente laminar de sumido, incluyendo la corteza prelímbica y el área cingulada anterior, se conservan entre sesiones.

Las superposiciones de perfil laminar de potencia entre ambas sesiones son muy similares entre sesiones, siendo la correlación de Pearson de 0,81. Las diferencias observadas en la corteza motora secundaria probablemente se deban a diferencias de movimiento entre grabaciones. Debido a que la trazada de CSD transporta información anatómica, puede proporcionar una lectura no terminal dentro de la sesión de qué regiones cerebrales está muestreando cada sonda de forma independiente de las tinciones tejituales post mortem.

La reproducibilidad de la colocación de micro-ECoG superficial entre sesiones se cuantifica de forma independiente de la lectura intracraneal de la CSD. Se superponen mapas de potencia espacial limitada en banda calculados a partir de la red micro-ECoG en el Día 0 y el Día 21, y la correlación píxel a píxel de ambos mapas se calcula por separado para las subrejillas rostral y caudal. Las correlaciones de perfiles de subrejilla siguen siendo altas y los códigos de barras espaciales de ambas sesiones co-localizaron visiblemente los mismos puntos calientes de energía cortical, tanto en la mitad rostral como en la caudal del arreglo.

Por tanto, una cola de alineación sinusoidal visible a través de la rejilla translúcida junto con las ranuras óseas grabadas en las coordenadas de inserción de la sonda permite la reproducibilidad a escala milimétrica de la colocación de micro-ECoG durante el intervalo longitudinal de 21 días. Para validar aún más la técnica, se realizaron tinciones inmunohistoquímicas para GFAP e IBA1 en cortes cerebrales post-mortem aproximadamente cuatro semanas después de la cirugía de craneotomía. Los GFAP se expresan mediante astrocitos, que están alterados al alza en la gliosis reactiva como lesiones cerebrales o inflamaciones.

IBA1, por otro lado, se expresa por la microglía, que está más activa durante los procesos neuroinflamatorios. La cohorte de validación consistió en animales en los que se realizó la cirugía completa en dos fases y la ventana craneal se reabrió posteriormente tres veces en los días postoperatorios 0, 21 y 22. Sin embargo, no se realizó colocación de micro-ECoG ni inserciones de sonda intracraneal en esta cohorte.

La ventana se volvió a sellar entre sesiones como durante un registro electrofisiológico. Por tanto, esta cohorte aísla la contribución inflamatoria de la ventana crónica y la exposición dural repetida de cualquier daño tisular inducido por la sonda. No se observaron diferencias significativas en ninguno de los marcadores entre el grupo control sin cirugía y el grupo vehicular que fue sometido a cirugía.

Estas micrografías representativas no muestran evidencia cualitativa de gliosis reactiva ni de activación microglial en la región directamente subyacente a la ventana. Sin embargo, se observó un ligero aumento de la activación microglial y de los astrocitos adyacente a la trayectoria de la sonda y en el hemisferio de la inserción de la sonda respectivamente, lo que probablemente podría deberse a una velocidad de inserción demasiado alta de la sonda intracraneal. Una cirugía exitosa resulta en una ventana clara y transparente sobre la corteza con una inflamación mínima.

Tras el tratamiento crónico, puede aparecer algo de inflamación cerebral. Esto puede gestionarse con un seguimiento cuidadoso y, si es necesario, la administración de más analgésicos. Para grabaciones, simplemente quita la tapa y el sellador, coloca las rejillas micro-ECoG y las sondas Neuropixels y comienza la adquisición de datos del animal despierto y comportado.

En resumen, este protocolo quirúrgico bifásico proporciona un método fiable y altamente eficaz para crear una gran ventana craneal crónica en ratones. Las principales ventajas del procedimiento son su daño mínimo a la duramadre y la gran exposición que proporciona, lo cual es fundamental para la colocación simultánea tanto de las rejillas micro-ECoG superficiales como de múltiples sondas de neuropíxeles profundos del cerebro. Este método permite una investigación longitudinal sin precedentes de la dinámica electrofisiológica a nivel de red en el DMN y otros circuitos a gran escala.

Abre la puerta a investigaciones más profundas sobre los fundamentos neuronales de conductas complejas y la fisiopatología de los trastornos cerebrales, contribuyendo finalmente al desarrollo de nuevas terapias.