Análisis morfométricos de la forma: la caja de herramientas de software de análisis para la cuantificación de formas craneofaciales en peces cebra

Nuestra investigación utiliza software morfométrico para cuantificar si el etanol y el bmp7a interactúan y causan sutiles defectos craneofaciales en peces cebra. Las medidas lineales pasan por alto cambios sutiles. Con este método, utilizamos puntos de referencia para cuantificar los cambios de forma mientras controlamos las diferencias de tamaño.

Para empezar, abre el software tpsDigs2. Haz clic en Fuente de entrada, luego en Archivo, y selecciona el archivo guardado de Bloc de notas de TPS. Haz clic en Opciones para visualizar la opción de herramientas de imagen.

Ajusta la longitud de referencia a 100 micrómetros y pulsa en Establecer escala. Haz clic en OK para confirmar los parámetros de escala, luego sal de la ventana de herramientas de imagen. Luego, haz clic en el símbolo de puntería y coloca el primer punto de referencia en la articulación media, entre los cartílagos de Meckel.

Colocar los segundos puntos de referencia en las articulaciones bilaterales entre los cartílagos de Meckel y los cartílagos palatocuadrados. Colocar el tercer hito en la articulación mediana entre los cartílagos ceratohiales y el cuarto punto de referencia en las articulaciones bilaterales entre los cartílagos palatocuadrado y ceratohial. Luego, coloca los quintos puntos de referencia en el extremo distal de los cartílagos hiomandibulares, asegurando que los puntos de referencia se coloquen en el mismo orden para cada imagen.

Después de colocar puntos de referencia, haz clic en Archivo para abrir el menú desplegable. Selecciona Guardar datos y luego sobrescribir para guardar el archivo actualizado. Sal del software tpsDigs2.

Lanza el software MorphoJ. Haz clic en Archivo, selecciona Crear un nuevo conjunto de datos y asigna un nombre al conjunto de datos. Haz clic en TPS y selecciona el archivo Notepad que contiene los nuevos puntos de datos añadidos.

Luego, crea el conjunto de datos. En el Árbol de Proyectos, haz clic en el conjunto de datos. Selecciona preliminares, luego Nuevo Ajuste de Procrustes.

Elige Alinear por ejes principales y haz clic en Realizar Ajuste de Procrustes. En Preliminares, selecciona Generar Matriz de Covarianza para obtener las coordenadas de Procrustes. Ejecuta la función cuando te lo pidan.

Ahora, selecciona Crear o Editar Wireframe y enlaza los puntos en las imágenes. Haz clic en puntos enlazados y acepta o crea la imagen, luego edita los clasificadores según sea necesario. Abre un programa de hoja de cálculo mientras mantienes MorphoJ abierto.

Introduce información del clasificador como GENOTIPO, TRATAMIENTO y GENOTIPO TRATAMIENTO, y luego guarda el archivo como archivo CSV. En MorphoJ, haz clic en Archivo y selecciona Importar variables clasificadoras para importar el archivo CSV. Vuelve al Árbol de Proyectos y haz clic en el conjunto de datos.

En Preliminares, selecciona Editar Clasificadores para confirmar que todas las imágenes están incluidas. En el Árbol de Proyectos, selecciona CovMatrix y luego haz clic en Variación en la parte superior de la página. Selecciona Análisis de Componentes Principales para calcular las puntuaciones de componentes principales.

Haz clic en puntuaciones de PC para mostrar el gráfico generado. Haz clic derecho en el gráfico y selecciona Elipsis de Confianza para añadir el clasificador deseado. Selecciona Puntos de Datos de Color, asigna colores y haz clic en OK para aplicar cambios.

En Preliminares, selecciona Opciones de Establecer para el Gráfico de Formas situado en la parte inferior de la pantalla. Elige gráficos de alambre y modifica los colores de la forma objetivo, la forma inicial y los números. Selecciona variación y luego elige procrustes ANOVA.

Exporta los resultados de la ANOVA de Procrustes al archivo de hoja de cálculo creado anteriormente. En MorphoJ, selecciona el conjunto de datos original en Project Tree. Haz clic en Comparación, luego en Análisis de Variables Canónicas.

Selecciona las variables clasificadoras GENOTYPE TREATMENT y ejecuta la función. Para exportar los resultados, haz clic en la pestaña Resultados y haz clic derecho en la página de resultados. Selecciona Exportar a archivo y guarda los resultados.

En el Árbol de Proyectos, selecciona Análisis de Variables Canónicas y luego puntuaciones. Haz clic en Archivo, elige Exportar Conjunto de Datos, selecciona el tipo de dato y TRATAMIENTO GENOTÍPICO. Guarda las puntuaciones CVA como un archivo TXT.

Para preparar el archivo para el software PASADO, abre las puntuaciones CVA guardadas en un editor de texto. Sustituye el id del término en la esquina superior izquierda por Etiqueta y guarda el archivo editado. Abre el software PAST y haz clic en Archivo, luego abre para seleccionar el archivo editado de puntuaciones CVA.

En la ventana de importación. Selecciona Nombres, datos para fila y columna y Tabulador como separador, luego haz clic en Importar. En la pestaña Mostrar, selecciona Atributos de columna.

En el menú desplegable junto a Tipo, asigna Grupo a la primera columna que contiene las variables clasificadoras. Resalta las columnas de datos de componentes principales o variables canónicas. Selecciona Multivariante, luego Pruebas, y elige Normalidad Multivariante para ejecutar la prueba de normalidad por separado para los datos de componentes principales y variables canónicas.

Haz clic en la celda gris vacía en la esquina superior izquierda sobre Tipo para seleccionar todo el conjunto de datos. Selecciona Multivariante, luego Pruebas, y elige análisis multivariante de variantes para realizar el análisis. Exporta los resultados de MANOVA al archivo de hoja de cálculo creado previamente.

Se adquirieron imágenes del viscerocranio para cada larva de cada genotipo y grupo de tratamiento. Los cartílagos del viscerocranio se etiquetaron en una imagen representativa y se colocaron puntos de referencia en cada imagen para generar conjuntos de datos etiquetados por hitos. El componente principal 1 representó aproximadamente el 34% de la variación total de la forma y el componente principal 2 el 20% de la variación total de la forma.

Cada componente principal mostró variaciones específicas en la forma viscerocraneal en relación con la forma media de todos los viscerocraneos. El gráfico de análisis de componentes principales mostró medias superpuestas entre los grupos de genotipo y tratamiento sin agrupamiento distintivo. Las larvas salvajes tratadas con etanol mostraron una gran elipse del 95% de confianza en la media debido al bajo tamaño de la muestra.

La variable canónica 1 representaba un acortamiento o alargamiento sutil de la articulación ceratohial en el armazón magenta en comparación con el armazón negro medio. La variable canónica 2 mostró un desplazamiento medialmente solo en un lado del viscerocranio en las articulaciones entre el palatocuadrado de Meckel y el palatocuadrado-ceratohial. Las larvas de tipo salvaje tratadas con etanol mostraron una gran elipse del 95% de confianza de la media, que se solapó con todos los demás grupos.

El análisis multivariante de variantes reveló un efecto global significativo del genotipo y el tratamiento. El mayor reto es montar muestras de forma consistente. La larva inclinada puede causar mediciones inexactas y alterar los resultados.

Este protocolo se adapta a diferentes estructuras anatómicas, analiza datos 3D, genera medidas lineales y ayuda a determinar tamaños de muestra experimentales. Estudios futuros investigarán otras sensibilidades al etanol por genotipo, ampliarán el tamaño de las muestras y aplicarán esta versátil caja de herramientas a diversas estructuras anatómicas.