Una herramienta de análisis que cuantifica los cambios celulares Morfología de imágenes tridimensionales de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método automatizado para analizar y cuantificar los cambios en la morfología de una célula de forma indefinida obtenida a partir de imágenes de fluorescencia confocal tridimensionales. Esto se logra primero realizando el experimento de estimulación química que incluye células tratadas con agonista, células tratadas con antagonista seguido de agonista, y células sin tratamiento. Luego, las células se preparan para el análisis de inmunofluorescencia.

El segundo paso consiste en adquirir imágenes de fluorescencia tridimensionales multiespectrales. A continuación, se realiza un análisis morfométrico tridimensional utilizando el software informático ameris neuroscience, ameris XT y MATLAB. Los cambios fenotípicos a nivel de célula individual visualizados mediante el análisis morfométrico tridimensional se analizan y cuantifican luego como paso final.

En última instancia, esta plataforma de software se utiliza para cuantificar los cambios en la forma celular tras la activación del receptor, proporcionando una herramienta adicional para el descubrimiento de fármacos. En general, los investigadores tienen una experiencia estándar en sistemas biológicos, pero pueden no estar familiarizados con aplicaciones informáticas. En este protocolo del módulo I 60, se cierra la brecha entre la visualización y el lenguaje informático antes del inicio de este procedimiento.

Transfecte células de riñón embrionario humano con el receptor dos de la hormona liberadora de corticotropina marcado con hemaglutinina o CRF R dos, según se indica en el protocolo escrito. CRF dos es un receptor acoplado a proteína G o GPCR. Al día siguiente de la transfección, flamee los cubreobjetos y colóquelos en una placa de seis pocillos.

Añada 10 mililitros de PBS a un vial con cinco miligramos de polilisina liofilizada y mezcle. Luego, diluya cinco mililitros de polilisina disuelta en 500 mililitros de PBS y agregue dos mililitros de la mezcla sobre cada uno de los cubreobjetos. Deje la placa con los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de 20 minutos, lave los cubreobjetos añadiendo dos mililitros de PBS y luego eliminándolos; repita este proceso dos veces.

Después de añadir dos mililitros de medio DMEM con 10 %FBS, agregue de dos a cinco gotas de células sobre los cubreobjetos. Las células deben estar en la concentración necesaria para alcanzar un 60 % de confluencia. Al día siguiente.

Incubar las células durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente. Verificar que las células presenten una confluencia del 60 % para el tratamiento con agonista. Estimular las células designadas reemplazando el medio con dos mililitros de medio suplementado con el ligando endógeno del receptor CRF R2, el factor liberador de corticotropina, a una concentración de un micromolar.

Incube las células en un incubador a 37 grados Celsius durante 30 minutos para que sean pretratadas con el antagonista. Reemplace el medio con dos mililitros de medio suplementado con el antagonista selectivo de CFR2, anti salvaging 30, a una concentración de un micromolar. Incube las células en un incubador a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Después del tratamiento con el antagonista. Estimule las células con el agonista CRF e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos para las células no tratadas. Reemplace el medio con dos mililitros de medio fresco tras el tratamiento.

Sustituya el medio en cada pocillo por dos mililitros de medio fresco y agregue anti HHA diluido uno a mil, tras una incubación de 60 minutos a 37 grados Celsius. Aspire el medio y agregue dos mililitros de fijador a cada pocillo. Incube la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos tras aspirar el fijador.

Lave las células tres veces con solución salina tamponada con tris. Añada 100 microlitros de solución sanguínea encima de cada cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego aspire la solución de bloqueo existente de los pocillos y añada 100 microlitros de una nueva mezcla de anticuerpos secundarios a cada cubreobjetos. Tras una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad, lave cuatro veces con TBSC agregando y retirando suavemente la solución de la pared lateral del pocillo, manteniéndose aún en la solución de lavado final.

Recoger cada cubreobjetos con una aguja y pinzas curvas. Colocar el cubreobjetos con las células hacia abajo sobre un portaobjetos con una gota de medio de montaje vectorial con sellador DAPI, fijar con esmalte de uñas y dejar secar de 15 a 20 minutos. Se utiliza el anticuerpo marcado con Alexa 488 nanómetros para visualizar CFR2 y DAPI para visualizar los núcleos en la fase mitótica. Para comenzar, montar las células fijadas en un microscopio de fluorescencia. Para reducir la subjetividad experimental, mantener las condiciones experimentales desconocidas hasta después de adquirir y analizar las imágenes.

Se utilizó un objetivo de aceite plan acromático con un aumento de 63x y una apertura numérica de 1,4 en combinación con el microscopio confocal Zeiss LSM 510 Meta conectado a un sistema láser de dos fotones coherente integrado. Durante el proceso de adquisición de datos, compartimente las células tanto por multicanal como por partición c para incluir datos desde la membrana nuclear hasta las extremidades externas de los receptores extracelulares. Procese los datos de fluorescencia utilizando Amaris, lo que permite la visualización y segmentación de un conjunto de datos de microscopía 3D. Tras el algoritmo diseñado por Amaris, utilice primero la representación de superficie para representar la membrana nuclear NU.

Amaris determinará si existe más de un núcleo en la región de interés, o ROI. A continuación, utilice el algoritmo de creación de puntos para localizar los puntos de extensión de CFR dos. Para compensar el ruido de fondo y la intensidad irregular de la red compleja de células con forma amorfa y maximizar la inclusión de cada unidad de detección de fluorescencia de CFR dos, establezca el diámetro de los puntos en 0,2 micrómetros, que es la unidad más pequeña dentro de la imagen.

Esto permite la extrapolación de información distinta en forma de una intensidad medida. Mediante un filtro gaussiano, incorpore filtrado de puntos en el proceso automatizado de creación de puntos. Para evitar la saturación de datos, convierta el conjunto de datos de punto fijo de ocho bits a punto flotante de 32 bits.

Seleccione la superficie creada y determine la ubicación espacial exacta de cada punto fuera de la superficie nuclear realizando una transformación de distancia utilizando la membrana nuclear como punto de referencia. Intercambie los datos de intensidad de vóxeles por datos de coordenadas de puntos utilizando el módulo ameris XT interconectado con MATLAB. Seleccione los puntos y seleccione el tipo estadístico codificado en el tipo estadístico.

Seleccione el centro de intensidad informado en el nuevo canal creado. Cargue el color deseado para la visualización y configure el rango del mapa de colores para el análisis. Los datos numéricos pueden visualizarse en la pestaña estadística y exportarse a Excel utilizando GraphPad Prism.

Cuantifique los datos resultantes y preséntelos en formato gráfico para el análisis estadístico. Realice comparaciones entre grupos utilizando el análisis de varianza de dos vías (two-way Inova) y la prueba post hoc de Bonferroni; presente los datos como media ± desviación estándar. Para demostrar el potencial de este enfoque, se muestran los cambios celulares que resultan de la interacción de los receptores acoplados a proteínas G y el receptor de factor liberador de corticotropina dos con su ligando endógeno CRF.

En células HT K 2 93 transfectadas, se cuantificaron imágenes fusionadas que se visualizan mediante un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Alexa 4 88 y DPI para visualizar los núcleos. Los resultados revelan que los receptores CRF R dos se localizan en la membrana plasmática y se proyectan desde regiones definidas de la membrana celular. Mediante análisis convencional en 2D, es posible detectar este subconjunto de receptores CRF R dos extracelulares solo si se analizan los puntos de adhesión del receptor en las cubiertas de vidrio.

Por consiguiente, se pierde cualquier otra información derivada de los datos MULTIESPECTRALES apilados de ZS. El resultado mostró ninguna diferencia entre la ausencia de tratamiento y el agonista. Aunque los puntos de adhesión del receptor son notablemente diferentes cuando las células se tratan con CRF, los receptores extracelulares se reducen considerablemente, como se observa en la disminución de la distancia de los puntos respecto a la membrana plasmática.

También se redistribuyen desde ubicaciones principalmente finitas hacia una serie de ubicaciones discretas. El efecto de la CRF sobre la distribución de receptores en la membrana es prevenido por el pretratamiento con los antagonistas específicos de CR2. 30 30.

Bajo estas condiciones, las dos extensiones de CRFR no cambian con el tratamiento con CRF. Se utiliza la distribución distal de puntos trazados en intervalos codificados por colores en un espectro de cinco micrómetros para visualizar la distancia de los vóxeles respecto a la membrana nuclear. No se observó ninguna diferencia significativa en la contracción del RGPC entre la ausencia de tratamiento y el pretratamiento con antagonista antes del tratamiento con agonista.

El tratamiento de las células con el agonista CRF reduce progresivamente el número de vóxeles que contienen CFR2 en comparación con la ausencia de tratamiento o con células no tratadas. Pretratadas con el antagonista As tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las técnicas de imagen cuantitativa exploraran y caracterizaran numerosos cambios fenotípicos a nivel de célula individual, convirtiendo este ensayo basado en células en una herramienta adicional de perfilado a nivel de célula única para el proceso de descubrimiento de fármacos.