Una herramienta de análisis que cuantifica los cambios celulares Morfología de imágenes tridimensionales de fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método automatizado para analizar y cuantificar los cambios en la morfología de una célula de forma indefinida tomada de imágenes tridimensionales de fluorescencia confocal. Esto se logra realizando primero el experimento de estimulación química para incluir células tratadas con células agonistas, tratadas con antagonistas, seguidas de agonistas y células sin tratamiento. A continuación, las células se preparan para el análisis de inmunofluorescencia.

El segundo paso es adquirir imágenes de fluorescencia tridimensionales multiespectrales. A continuación, el análisis morfométrico tridimensional se realiza utilizando el software informático ameris neuroscience, ameris XT y MATLAB. Los cambios fenotípicos de una sola célula visualizados a través del análisis morfométrico tridimensional se analizan y cuantifican como paso final.

En última instancia, esta plataforma de software se utiliza para cuantificar los cambios en la forma de las células tras la activación del receptor, lo que proporciona una herramienta adicional para el descubrimiento de fármacos. Generalmente, el investigador tiene una experiencia estándar en el sistema biológico, puede no estar familiarizado con la aplicación informática. En este protocolo en el módulo I 60, cierre la brecha entre la visualización y el lenguaje informático antes del inicio de este procedimiento.

Transfectar células de riñón embrionario humano con receptor dos del factor liberador de corticotropina marcado con hemaglutinina o CRF R 2, según se menciona en el protocolo escrito. CFR dos es un receptor acoplado a proteína G o GPCR. Al día siguiente de la transfección, la tapa de la llama se desliza y se colocan en una placa de seis pocillos.

Agregue 10 mililitros de PBS a un vial de cinco miligramos de polilisina liofilizada y mezcle. A continuación, diluya cinco mililitros de polilisina disuelta en 500 mililitros de PBS y añada dos mililitros de la mezcla en cada uno de los cubreobjetos. Deje el plato con los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 20 minutos Después de 20 minutos, lave los cubrecubiertos agregando dos mililitros de PBS y luego retírelo, repita este proceso dos veces.

Después de la edición de dos mililitros de DMEM con un 10% de medios FBS, agregue de dos a cinco gotas de células en las cubrebocas. Las células deben estar en la concentración necesaria para alcanzar el 60% de fluidez. Al día siguiente.

Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente. Comprobar que las células están confluentes en un 60% para el tratamiento con agonistas. Estimula las células designadas mediante la sustitución de medios por dos mililitros de medios suplementados con el factor liberador de corticotropina de dos ligandos endógenos CRF R a una concentración de un micromolar.

Incubar las células en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos para que las células sean pretratadas con antagonista. Sustituya el medio por dos mililitros de medio suplementado con el selectivo CFR dos antagonistas anti salvaging 30 a una concentración de un micromolar. Incube las células en una incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Después del tratamiento con antagonistas. Estimular las células con el agonista CRF e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos para las células no tratadas. Reemplace los medios con dos mililitros de medios frescos después del tratamiento.

Reemplace el medio en cada pocillo con dos mililitros de medio fresco y agregue anti HHA diluido de uno a mil, después de una incubación de 60 minutos a 37 grados Celsius. Aspire el medio y agregue dos mililitros de fijador a cada uno. Incubar bien la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos después de aspirar el fijador.

Lave las células tres veces con solución salina inflada tris. Caín. Agregue 100 microlitros de solución sanguínea encima de cada tapa, deslize e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, aspire la solución de blotto existente de los pocillos y añada 100 microlitros de cóctel de anticuerpos secundarios frescos en cada cubreobjetos después de una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente en el lavado oscuro cuatro veces con TBSC añadiendo y retirando suavemente la solución de la pared lateral del pocillo mientras aún estaba en la solución de lavado final.

Recoja cada cubreobjetos con una aguja y pinzas curvas. Coloque las celdas deslizantes de la cubierta boca abajo sobre un portaobjetos con una gota de medio de montaje Vector Shield con dappy fix con esmalte de uñas y déjelo secar durante 15 a 20 minutos. Alexa, 4 88 nanómetros anticuerpo conjugado muse se utiliza para visualizar CFR dos y DAPI se utiliza para visualizar la etapa mitótica de los núcleos para comenzar a montar las células fijas en un microscopio fluorescente para limitar la subjetividad experimental, mantener las condiciones experimentales desconocidas hasta después de que las imágenes se adquieran y se analicen para adquirir imágenes.

Se utilizó un aceite plano acrobático, objetivo DIC con aumento de 63x y apertura numérica de 1,4 en combinación con el microscopio meta confocal zeis LSM five 10 conectado a un sistema láser de dos fotones integrado coherente Durante el proceso de adquisición de datos, compartimentar las células mediante partición multicanal y c para incluir datos desde la membrana nuclear hasta los extremos externos del receptor extracelular. Procese los datos de fluorescencia utilizando amris, lo que permite la visualización y segmentación de un conjunto de datos de microscopía 3D. Siguiendo primero el algoritmo diseñado por Amaris, utilice el renderizado de la superficie para representar la membrana nuclear NU.

Amaris determinará si hay más de un núcleo en la región de interés, o ROI. A continuación, utilice el algoritmo de creación de puntos para ubicar los dos puntos de extensión CFR. Compensa el ruido de fondo y la intensidad irregular de la compleja red de células de forma amorfa para maximizar la inclusión de cada unidad de detección de fluorescencia de CFR dos, establezca el diámetro de los puntos en 0,2 micrómetros, que es la unidad más pequeña dentro de la imagen.

Esto permite la extrapolación de información distinta en forma de una intensidad medida. Con un filtro gaussiano, incorpore el filtrado de manchas en el proceso de creación automatizado de las manchas. Para evitar la cación de datos, convierta el conjunto de datos de punto fijo de ocho bits a flotante de 32 bits.

Seleccione la superficie creada y determine la ubicación espacial exacta de cada punto fuera de la superficie nuclear realizando una transformación de distancia utilizando la membrana nuclear como punto de referencia. Intercambie los datos de intensidades de vóxeles por datos de coordenadas puntuales mediante el módulo ameris XT interconectado con MATLAB. Seleccione los puntos y seleccione la estadística codificada en el tipo de estadística.

Elija el centro de intensidad reportado en el nuevo canal creado. Cargue el color deseado para la visualización y establezca el rango del mapa de colores para el análisis. Los datos numéricos se pueden visualizar en la pestaña estadística y exportar a Excel utilizando el prisma GraphPad.

Cuantificar los datos resultantes y presentarlos en formato gráfico para su análisis estadístico. Realice comparaciones entre los grupos utilizando Inova de dos factores y Bonferroni después de presentar los datos como media más o menos desviación estándar. Para demostrar el poder de este enfoque, los cambios celulares que resultan de la interacción de los receptores acoplados a la proteína G y el receptor dos del factor liberador de corticotropina con su ligando endógeno CRF.

En las células HT K 2 2 93 transfectadas se cuantificaron las imágenes fusionadas que se visualizan utilizando Alexa 4 88 conjugado, anti ratón, anticuerpo secundario y DPI para visualizar los núcleos. Los resultados revelan que los dos receptores CRF R se encuentran en la membrana plasmática y se proyectan desde regiones finitas de la membrana de las células. Utilizando el análisis 2D convencional, es posible detectar este subconjunto de dos receptores extracelulares CRF R dos solo si se analizan los puntos de adhesión del receptor en las cubiertas de vidrio.

En consecuencia, se pierde cualquier otra información derivada de los datos MULTIESPECTRALES apilados de ZS. El resultado no eligió ninguna diferencia entre ningún tratamiento y el agonista. Si bien los puntos de adhesión de los receptores son drásticamente diferentes cuando las células se tratan con CRF, los receptores extracelulares se reducen en gran medida, como lo demuestra la disminución de la distancia de las manchas a la membrana plasmática.

También se redistribuyen desde ubicaciones principalmente finitas a una serie de ubicaciones discretas. El efecto de la CRF sobre la distribución de la membrana del receptor se previene mediante el pretratamiento con los dos antagonistas específicos de la CR. 30 30.

En estas condiciones, las dos extensiones del CRFR no cambian con el tratamiento con CRF. La distribución distal de los puntos trazados en intervalos codificados por colores en un espectro de cinco micrómetros se utiliza para visualizar la distancia de los vóxeles a la membrana nuclear. La ausencia de tratamiento y el pretratamiento con antagonistas antes del tratamiento con agonistas no mostraron diferencias significativas en la contracción del GPCR.

El tratamiento de las células con el agonista CRF reduce progresivamente el número de vóxeles que contienen CFR dos en comparación con ningún tratamiento o en comparación con las células. Pretratado con antagonista As después de su desarrollo. Esta técnica abrió el camino para que los investigadores en el campo de la técnica de imágenes de cuantificación exploraran y caracterizaran numerosos cambios fenotípicos de una sola célula, lo que convierte a este ensayo basado en células en una herramienta adicional de perfil de una sola célula para el proceso de descubrimiento de fármacos.