Generación y análisis transcriptómico unicelular de organoides de carcinoma hepatocelular tras el tratamiento con medicamentos

Nos centramos en cómo responden los organoides del CHC al tratamiento con medicamentos y cómo sus estudios traslacionales cambian en el trabajo. Este protocolo es útil para organoides de HCC y también puede adaptarse a otros sistemas organoides tumorales. Para empezar, establecer el carcinoma hepatocelular o organoides derivados del paciente con HCC, y prepáralos para la perturbación terapéutica.

Prepara la solución de stock de lenvatinib en dimetilsulfóxido, o DMSO, según las instrucciones del fabricante. Diluir la solución de base en un medio de cultivo precalentado inmediatamente antes de usarla hasta la concentración de trabajo predefinida. Preparar suficiente solución para lograr volúmenes finales iguales en todos los pozos, asegurando la misma concentración de DMSO en cada pozo.

A continuación, añade un medio que contenga lenvatinib a 20 micromolares a lo largo de la pared de cada pozo para evitar alterar las cúpulas de la matriz. Incluye un control del vehículo con la misma concentración final de DMSO. Incubar los organoides bajo condiciones estándar de cultivo durante el periodo de tratamiento predefinido.

Para tratamientos que excedan las 72 horas, sustituye el medio que contiene fármaco cada 48 a 72 horas, asegurando un calendario de reemplazo consistente en todos los pozos. Graba imágenes basales en campo claro antes del tratamiento. Adquirir imágenes a intervalos fijos durante el tratamiento utilizando los mismos ajustes de microscopio, aumento y posiciones de campo.

Para la evaluación basada en morfología de la respuesta al tratamiento, se utilizan ajustes de exposición, aumento y umbrales de análisis idénticos para todas las imágenes. Mide la curva de crecimiento del área organoide calculando el área total del organoide, por pozo o campo, en cada punto temporal, y normalizando los valores hasta la línea base. Para medir el diámetro medio de un organoide, determina el diámetro de organoides intactos individuales y calcula el valor medio por pozo.

A continuación, determina el recuento de organoides supervivientes contando organoides intactos identificables morfológicamente, excluyendo cualquier escombro o fragmento colapsado. Realizar un ensayo tridimensional de viabilidad por luminiscencia en el punto final del tratamiento si se requiere una evaluación adicional de viabilidad a granel siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, grafica las curvas de crecimiento del área organoide a lo largo del tiempo.

Comparar el diámetro medio de organoides entre grupos tratados con vehículo y tratados con lenvatinib. Además, compara los recuentos de organoides supervivientes entre los grupos de tratamiento. Asegurarse de utilizar calendarios de imagen, criterios de inclusión y parámetros de análisis consistentes para garantizar la reproducibilidad.

Selecciona pozos organoides con morfología 3D intacta, material suficiente para la captura de células individuales y sin contaminación visible. Grabar imágenes en campo claro de cada una seleccionada mucho antes de la disociación utilizando los mismos ajustes de microscopio, aumento y criterios de selección de campo. Recoger organoides en puntos temporales coincidentes entre grupos de control y tratados, manteniendo la misma densidad de placa, calendario de tratamiento y condiciones de reemplazo de medios idénticos en todas las muestras.

Aspira completamente el medio de cultivo de cada pozo. Lava cada pozo dos veces con PBS bien frío para eliminar el medio residual y los restos. Añade un mililitro de solución de recuperación de células heladas a cada pozo e incuba en hielo durante 20 a 30 minutos.

Pipetear suavemente cada cinco a siete minutos durante la incubación para facilitar la disolución de la matriz. Transfiere el material disuelto a tubos preenfriados usando una punta de pipeta de ánima ancha o cortada para minimizar el esfuerzo por cizalladura. Procede a la disociación enzimática solo después de que la matriz esté en gran parte disuelta y quede un residuo de gel visible mínimo.

Centrifugar la suspensión organoide recuperada a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Retira el sobrenadante con cuidado sin mover la bola. Resuspende el pellet en un mililitro de enzima de disociación celular recombinante e incuba a 37 grados Celsius durante cinco a diez minutos.

Pipetea suavemente entre ocho y diez veces cada dos o tres minutos, usando una punta de calibre ancho P1000, para promover la disociación. Detener la digestión cuando la mayoría de los fragmentos organoides se han dispersado en células individuales y solo quedan pequeños racimos residuales. A continuación, añade cuatro mililitros de PBS helado que contiene un 2% de suero fetal bovino para detener la digestión.

Luego, filtra la suspensión a través de un colador de celda de 40 micrómetros. Lava una vez con PBS para eliminar enzimas residuales, agregados y restos. Cuenta las células usando la exclusión de azul de tripán.

Después de asegurar la viabilidad celular del 85% o más, ajustar la concentración final de la célula a 700 a 1.200 células por microlitro. Excluye muestras con exceso de residuos, abundantes células muertas, grandes agregados visibles o disociación incompleta. Repite la filtración antes de cargar si hay agregados presentes.

Control de procesos y muestras tratadas bajo condiciones idénticas, incluyendo la enzima de disociación, tiempo de digestión, frecuencia de pipeteo, método de filtración, concentración celular y estrategia de carga. Finalmente, tras la amplificación de la biblioteca de una sola celda, realizar secuenciación de una sola celda. El organoide sobrevivió y se expandió bajo condiciones estándar de cultivo tridimensional desde el primer día hasta el sexto día tras la recuperación.

Al primer día, los organoides aparecían como estructuras pequeñas y compactas, mientras que al sexto día mostraban un aumento de tamaño y una morfología bien definida. Los organoides tratados con lenvatinib eran más pequeños y mostraban morfología alterada en comparación con los controles tratados con DMSO. El análisis cuantitativo mostró una reducción en el diámetro medio de organoides tras el tratamiento con lenvatinib, en comparación con los controles con DMSO.

Este protocolo nos permite estudiar los cambios en el estado celular, la composición celular y la expresión génica tras el tratamiento. El mayor desafío es preservar la viabilidad celular, manteniendo un procesamiento simple consistente en todos los grupos. El análisis posterior celular puede realizarse siguiendo este procedimiento, incluyendo agrupamiento, análisis de experimentos diferenciales de genes, análisis de enriquecimiento de vías e inferencia de tesorería.