Méthodes fondamentales de biologie cellulaire et moléculaire

De nombreuses expériences biomédicales nécessitent la manipulation d'une quantité connue de cellules, afin d'obtenir des données précises, reproductibles et statistiquement pertinentes. Par conséquent, apprendre à compter les cellules est une technique particulièrement essentielle pour n'importe quel chercheur biomédicale. La façon la plus commune pour compter les cellules est d'utiliser un hémacytomètre - un instrument qui porte deux grilles gravées au laser, qui aide dans l'énumération d’un...

Les lignées cellulaires sont fréquemment utilisées dans des expériences biomédicales, car la croissance et l’expansion rapide de plusieurs types de cellules permettent l'analyse expérimentale accélérée. Les lignées cellulaires sont cultivées dans des conditions similaires par rapport à des cellules fraîchement isolées, ou primaires, mais avec quelques différences importantes de base : (i) des lignées cellulaires exigent un mélange de facteurs de croissance spécifique et (ii) leur croissance...

La réaction en chaîne par polymérase, ou PCR, est une technique utilisée pour amplifier l'ADN à travers des thermocycles - cycles de changement de températures à des intervalles de temps fixés. En utilisant un ADN polymérase thermostable, la PCR peut créer de nombreuses copies d'ADN depuis les blocs de construction de l'ADN appelés dinucléosides de triphospshates ou dNTPS. Il y a trois étapes dans la PCR: la dénaturation, l'hybridation, et l'élongation. La dénaturation est la première étape...

L'électrophorèse d'ADN sur gel est une technique utilisée pour la détection et la séparation des molécules d'ADN. Un champ électrique est appliqué à une matrice de gel constituée d'agarose, et à l'intérieur du gel, les particules chargées vont migrer et seront séparées sur base de leur taille. Les phosphates du squelette de l'ADN négativement chargés provoquent le mouvement des fragments d'ADN vers l'anode – l'électrode chargée positivement.La vidéo explique le mécanisme via lequel les...

L'Electrophorèse sur Gel de Polyacrylamide en présence de Dodécylsulfate de Sodium, ou SDS-PAGE, est une techique largement utilisée pour la séparation de mélanges de protéines, basée sur leur taille et rien d'autre. SDS, un détergent anionique, est utilisé pour produire une charge égale à travers la longueur des protéines qui ont été linéarisées. Par, d'abord, leur chargement dans un gel fait de polyacrylamide et, ensuite, en appliquant un champ électrique au gel, les protéines enrobées au SDS...

La transformation est un processus qui apparait lorsqu'une cellule ingère un ADN étranger depuis son entourage. La transformation peut se produire dans la nature dans certains types de bactérie. En biologie moléculaire, la transformation est reproduite artificiellement au labo via la création de pores dans les membranes des cellules bactériennes. Les cellules bactériennes qui sont capables de prendre l'ADN depuis l'environnement sont appelées cellules compétentes. Au laboratoire, les cellules...

Le terme “transformation” fait référence à l'ingestion cellulaire d'ADN étranger. Dans la nature, une transformation peut avoir lieu dans certain types de bactéries. En biologie moléculaire, cependant, la transformation est artificiellement induite à travers la création de pores dans les murs de la cellule bactérienne. Les cellules bactériennes qui sont capables de prendre l'ADN depuis l'environnement sont appelées cellules compétentes. Les cellules électrocompétentes peuvent être produites en...

Un dosage d'immunoadsorption par enzyme lié ELISA (de enzyme-linked immunosorbent assay) est typiquement réalisé pour détecter la présence et/ou la quantité d'une protéine d'intérêt cible dans un échantillon expérimental. La détection de la protéine cible est rendue possible par les anticorps, qui font de l'ELISA un dosage immunologique. A travers une série d'étapes d'incubation et de lavages, ces anticorps, qui sont généralement liés, ou conjugués, à un enzyme, détecteront une protéine...

La purification de plasmide est une technique utilisée pour isoler et purifier l'ADN plasmidique de l'ADN génomique, des protéines, des ribosomes, et du mur de la cellule bactérienne. Un plasmide est un ADN double brin petit et circulaire, qui est utilisé comme porteur de molécules spécifiques d'ADN. Lorsqu'il est introduit dans un organisme hôte via transformation, le plasmide sera répliqué, créant de nombreuses copies du fragment d'ADN à l'étude.Dans cette vidéo, une procédure généralisée pas...

La purification sur gel est utilisée pour récupérer des fragments d'ADN après séparation par électrophorèse. La récupération d'ADN à partir d'un gel d'agarose inclu trois étapes de base: la liaison, le lavage et l'élution depuis une colonne de silice. Il est communément accepté que l'ADN se lie à la silice en présence d'une haute teneur en sel via un pont salé. Après la liaison, l'ADN est lavé des impuretés et élué sous des conditions faible en sel perturbant cette interaction.Cette vidéo...

L'immunotransfert est utilisé pour identifier la présence de protéines spécifiques dans des échantillons séparés par électrophorèse. Faisant suite à la séparation par une technique, connue sous le nom d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium, ou SDS-PAGE, l'immunotransfert est utilisé pour déplacer les protéines depuis un gel polyacrylamide vers un morceau de membrane qui piège les protéines dans leur emplacement respectif. Ensuite, les membranes sont...

La transfection est la procédure d'insertion de matériel génétique, tel que l'ADN et l'ARN double brin, à l'intérieur de cellules mammifères. L'insertion d'ADN dans une cellule permet l'expression, ou la production, de protéines utilisant la propre machinerie des cellules, alors que l'insertion d'ARN dans une cellule est utilisée pour réguler vers le bas la production d'une protéine spécifique par l'arrêt de la traduction. Alors que le lieu d'action pour l'ARN transfecté est le cytoplasme,...

En biologie moléculaire, la ligature fait référence au raccrochement de deux fragments d'ADN à travers la formation d'une liaison phosphodiester. Un enzyme connu sous le nom de ligase catalyse la réaction de ligature. Dans la cellule, les ligases réparent les simples ou doubles brins cassés, ceci a lieu lors de la réplication de l'ADN. Au laboratoire, l'ADN ligase est utilisé pendant le clonage moléculaire pour relier les fragments d'ADN d'inserts avec les vecteurs – porteurs de molécules d'ADN...

Les enzymes de restriction ou endonucléases reconnaissent et coupent l'ADN en une séquence spécifique. Ces enzymes sont produits naturellement chez les bactéries comme défense contre les bactériophages – virus qui infectent les bactéries. Les enzymes de restriction bactérielles coupent l'ADN du bactériophage invasif tout en laissant l'ADN génomique bactérien sain et sauf grâce à l'addition de groupes méthyles.Cette vidéo explique les principes de base des enzymes de restriction incluant:...

Le clonage moléculaire est un ensemble de méthodes, qui sont utilisées pour insérer un ADN recombinant dans un vecteur – un porteur de molécules d'ADN qui va répliquer les fragments d'ADN recombinant dans les organismes hôtes. Le fragment d'ADN, qui peut être un gène, peut être isolé depuis un spécimen procaryote ou eucaryote. Après l'isolation du fragment d'intérêt, ou insert, le vecteur et l'insert doivent être coupés avec les enzymes de restriction et purifiés. Les morceaux purifiés sont...