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La coloration de Gram permet une visualisation rapide de la morphologie bactérienne et une large distinction cellulaire à partir d’un large éventail d’échantillons environnementaux. Pour tacher les bactéries, une tache uniforme est appliquée sur une face en verre et laissée sécher. Après la fixation thermique du frottis, du violet cristallin est appliqué.
Un agent décolorant rince le violet cristallin des cellules à Gram négatif, mais pas des cellules à Gram positif. Un deuxième colorant, généralement de la safranine, est utilisé comme colorant de fond pour visualiser les cellules à Gram négatif. Une fois colorées, les cellules peuvent être évaluées pour la morphologie, la taille et la disposition des cellules, telles que les chaînes ou les grappes.
Cette vidéo montrera comment préparer un échantillon environnemental, isoler les espèces bactériennes qui s’y trouvent et effectuer une coloration de Gram sur les colonies isolées
La coloration de Gram permet de catégoriser la plupart des bactéries en deux grandes classes structurelles : Gram-positif et Gram-négatif. Bien que les deux classes aient une membrane plasmique phospholipidique sous-jacente, la structure de la paroi cellulaire varie considérablement. La paroi cellulaire à Gram positif est principalement composée d’une épaisse couche de peptidoglycane, qui est un polymère composé de sucres et d’acides aminés. Les parois cellulaires à Gram négatif ont une couche plus mince de peptidoglycane, prise en sandwich entre une deuxième membrane lipidique. Cette membrane externe contient généralement des lipopolysaccharides.
Le violet cristallin chargé positivement se lie faiblement à la paroi cellulaire bactérienne chargée négativement. L’iode de Gram forme un complexe insoluble avec le colorant violet cristallin, le fixant ainsi dans la paroi cellulaire.
Au cours de l’étape de décoloration, le peptidoglycane dans les cellules à Gram positif est déshydraté, ce qui le fait se contracter et piéger les complexes cristallins violet-iode. Dans les cellules à Gram négatif, l’agent décolorant compromet la membrane externe, augmentant ainsi sa porosité. Cela permet aux complexes cristallins violet-iode d’être éliminés.
Maintenant que vous comprenez les principes qui sous-tendent la coloration de Gram des bactéries du sol, voyons le processus effectué sur les bactéries du sol en laboratoire.
Après avoir prélevé un échantillon de sol sur le terrain, apportez-le au laboratoire pour analyse. Affinez l’échantillon à l’aide d’un tamis et pesez 10 g de sol tamisé à l’aide d’une balance analytique.
Diluer l’échantillon dans 95 mL de solution saline tamponnée au phosphate et de vortex pour mélanger. Effectuez 1 à 10 dilutions supplémentaires, en tourbillonnant entre chaque dilution. Transvaser des aliquotes d’au moins 3 dilutions successives sur des plaques d’agarose à faible teneur en nutriments.
Après la stérilisation à la flamme d’éthanol et le refroidissement d’une tige de verre pliée en tapotant sur le support, étalez l’échantillon sur la surface des plaques. Incuber les plaques à température ambiante. Après une incubation de 3 à 5 jours, sélectionnez la dilution la plus élevée avec 30 à 300 colonies distinctes. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, sélectionnez les colonies d’intérêt pour l’isolement.
Étalez la colonie sur une section d’une assiette fraîche. En stérilisant la boucle entre les stries, faites des stries successives en zigzag sur chaque section de la plaque pour permettre l’isolement ultérieur de colonies uniques discrètes. Incuber les plaques pendant 1 à 2 jours à température ambiante.
Pour commencer la préparation des frottis bactériens, fixez une pince à une lame de verre pré-nettoyée pour faciliter la manipulation. Pour chaque frottis bactérien, nettoyez et stérilisez à la flamme une boucle d’inoculation. Placez 2 boucles d’eau distillée stérile au centre de la lame.
Après avoir stérilisé à nouveau l’anse, prélevez une petite quantité de culture d’une colonie isolée et mélangez-la à l’eau sur la lame. Il est important de refroidir la boucle avant de toucher la culture en tapotant plusieurs fois une portion non inoculée de gélose. Le frottis doit ressembler à du lait dilué. Laissez la lame sécher à température ambiante. Après séchage, fixez la chaleur en la faisant passer rapidement à travers une flamme.
Une fois sec, pipetez le violet cristallin sur le frottis et laissez reposer pendant 2 à 3 minutes. Rincez soigneusement la lame à l’eau distillée en orientant le flux direct vers le haut de la lame, permettant à l’eau de s’écouler doucement vers le bas. Ne dirigez pas le débit d’eau directement vers le frottis.
Couvrez la diapositive avec de l’iode de Gram. Au bout de 2 min, rincer délicatement à l’eau distillée. Décolorez la lame avec de l’éthanol à 95 % jusqu’à ce que la tache ne disparaisse plus. Rincer immédiatement à l’eau distillée. Cela limitera la décoloration excessive du frottis.
Ajouter la safranine comme contre-coloration au frottis pendant 30 s. Cela tachera toutes les cellules à Gram négatif présentes. Rincez doucement à l’eau distillée et séchez avec du papier absorbant. Observez la lame résultante avec un microscope. Utilisez d’abord un objectif de faible puissance pour effectuer des réglages grossiers et trouver une partie idéale du frottis avant de passer au champ de vision plus petit des grossissements les plus élevés.
Après une imagerie plus poussée et un ajustement du frottis avec un objectif de puissance moyenne, ajoutez de l’huile d’immersion directement sur le frottis. L’huile est nécessaire pour les objectifs de haute puissance qui fourniront les meilleures micrographies. Les bactéries à Gram positif apparaîtront de couleur bleue ou violette, tandis que les cellules à Gram négatif seront rouges ou roses. En plus de la structure de la paroi cellulaire, la forme et la disposition sont élucidées à partir des micrographies résultantes.
La capacité de la coloration de Gram à étudier qualitativement les bactéries est importante dans un large éventail de domaines scientifiques.
Le sol n’est qu’une des sources environnementales à partir desquelles les bactéries peuvent être isolées et analysées. Pour l’eau potable, la préparation des échantillons doit être modifiée. Des échantillons d’eau du robinet peuvent être prélevés à partir d’un robinet et placés sur un milieu de croissance qui facilite la croissance de diverses colonies bactériennes hétérotrophes. Lors du placage sur un milieu tel que le R2A, le processus est presque identique à la procédure au sol.
Pour certaines techniques d’identification bactérienne, les paramètres dépendent du type de paroi cellulaire de la bactérie d’intérêt. Dans cet exemple, le sang d’un patient septique a été analysé et s’est avéré être porteur de bactéries à Gram positif.
Grâce à ces informations, des sondes d’acide nucléique peptidique spécifiques à l’espèce ont été choisies qui se lieraient à l’ARNr des cellules. Ces sondes étaient liées à des colorants fluorescents qui servaient à identifier les espèces présentes.
En raison des différences fondamentales dans la structure cellulaire à Gram positif et négatif, les bactéries ont des réponses uniques à d’autres composés que le violet cristallin. Cette expérience visait à isoler Clostridium difficile, une bactérie à Gram positif, à partir d’échantillons fécaux. De la cyclosérine, qui inhibe la croissance des cellules à Gram négatif, a été ajoutée à la plaque de gélose. Les cellules à Gram positif qui se sont développées sur la plaque ont été isolées par d’autres méthodes.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la coloration de Gram pour les études environnementales. Vous devez maintenant comprendre les avantages du processus et comment effectuer la technique et utiliser les résultats. Merci d’avoir regardé !
