Coloration de Gram des bactéries provenant de sources environnementales

1. le prélèvement

1. Recueillir des échantillons de sol et le transport au laboratoire pour analyse microbienne.
2. Dans le laboratoire, peser un échantillon de 10 g à l’aide d’une balance analytique.
3. Diluer l’échantillon 01:10 dans 95 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (10 pièces sol équivaut à 5 parties liquide aqueux) et vortex de mélanger (Figure 2, étape 1).
4. Effectuer ultérieures 01:10 sur le sol des dilutions jusqu'à au moins 10^-5 g / mL, et plaque de propagation sélectionné dilutions dans réplicats de deux ou trois sur un milieu gélose nutritive faible (p. ex., R2A) (Figure 2, les étapes 2 - 3).
5. Incuber les boîtes pendant une semaine à température ambiante (Figure 2, étape 4).
6. Sélectionnez une ou deux colonies pour l’isolement et ensemencer sur plaques de gélose fraîche (Figure 3, les étapes 1-3).
7. Incuber les boîtes de strie pendant deux ou trois jours à température ambiante (Figure 3, étape 4).

2. préparation des frottis bactériennes

1. Observer les plaques strie des colonies isolées.
2. Pour préparer chaque préparation de frottis, trempez une boucle inoculer dans l’éthanol, flamme-les stériliser et placer 1 à 2 anses d’eau distillée stérile vers le centre de lames de verre préalablement nettoyé.
3. Stérilisez la boucle inoculer à nouveau comme décrit précédemment. Une fois refroidi, prélever une petite quantité de la culture d’une seule colonie isolée et mélangez-le avec les gouttelettes d’eau sur la lame (le frottis doit ressembler à du lait écrémé dilué). La boucle à inoculation doit être refroidie avant l’isolement de la colonie. Une boucle qui est trop chaude qui entraîne la colonie et/ou moyen pour éviter les éclaboussures, qui peut conduire à l’aérosolisation de bactéries. En règle générale, lorsque la boucle est trop chaude pour une utilisation, un « sifflement » sera entendu lorsque appliqué à la gélose ou colonie. Un refroidissement de la boucle peut entraîner également au transfert de la culture-pour-slide moins efficace et les distorsions de la morphologie cellulaire.
4. Etaler le frottis sur la surface de la lame mesure environ 2,5 cm x 2,5 cm et laisser sécher à l’air. Il est important pour l’air de séchage pour se produire dans des conditions d’écoulement laminaire. Diapositives pas devraient être soufflés sec de manière à ne pas perturber le frottis. En outre, diapositives ne doivent pas être séchées flamme, afin de maintenir la morphologie cellulaire.
5. Après séchage, chaleur fixer le frottis en passant les glissent rapidement dans une flamme 2-3 x. La diapositive ne devrait pas être tenue stationnaire dans la flamme, pour éviter des distorsions de la morphologie cellulaire et/ou de dommages à la lame de verre.

3. coloration de gram

1. Fixez la lame à une extrémité à l’aide d’une pince à linge propre.
2. Recouvrir le frottis avec cristal violet (colorant primaire) et maintenez-le enfoncé pendant 2 à 3 min.
3. Laver soigneusement la lame avec de l’eau distillée. Le jet d’eau ne devrait pas être dirigé contre le frottis afin d’éviter des dommages et/ou au décollement de la lame de verre.
4. Recouvrir le frottis à l’iode de Gram et maintenez pendant 2 min, puis rincer doucement la lame avec de l’eau.
5. Décolorer le frottis à l’aide d’éthanol à 95 % jusqu'à ce que la tache se lave n’est plus de la lame (cela prend généralement pas plus de 20 s selon l’épaisseur du frottis), puis rincer immédiatement avec de l’eau distillée. Cette étape est essentielle pour éviter une décoloration de la diapositive, qui peut conduire à une fausse gramme tache désignation (c.-à-d., Gram variable).
6. Ajouter le contre-colorant (safranine) pour le frottis et maintenez-le enfoncé pendant 30 s. Puis rincer doucement la lame avec de l’eau distillée et éponger avec du papier absorbant.

4. microscopique Observation de diapositives

1. Observer les diapositives à l’aide de basse (par exemple, 4 X ou 10 X), haute-sèche (par exemple, 40 X), mais les objectifs à immersion (100 X) d’huile. Pour immersion dans l’huile, ajouter l’huile directement sur le frottis.
2. Pour obtenir des résultats représentatifs de bactéries Gram-positives et Gram-négatives, voir Figures 4 et 5.

Figure 2. Dilution et Technique de propagation-Plating. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La figure 3. Isolement de colonie en utilisant la Technique de plaque Streak.

Figure 4. Bactérie Gram-positive de sol Staphylococcus aureus .

Figure 5. Bactérie Gram-négative de sol Escherichia coli.