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Le marquage métabolique est utilisé pour étudier la machinerie d’une cellule. Ceci est accompli à l’aide d’analogues chimiques pour sonder les transformations et les modifications biochimiques qui se produisent. Cette vidéo montrera les principes du marquage métabolique, les procédures typiques de marquage isotopique et photoréactif, et certaines applications.
Le marquage métabolique peut être effectué à l’aide d’un certain nombre de stratégies. Nous décrirons ici le marquage isotopique, photoréactif et bio-orthogonal.
Le marquage isotopique est effectué à l’aide d’analogues structuraux chimiquement identiques à leurs homologues naturels, mais dont la structure contient des isotopes peu communs. Dans cet analogue de la L-lysine, les atomes de carbone et d’azote sont remplacés par du carbone 13 et de l’azote 15. Les cellules cultivées en présence d’analogues isotopiques les intégreront dans leurs structures biochimiques. Les métabolites sont prélevés dans les cellules et purifiés pour être analysés. Les échantillons contenant des isotopes stables sont analysés à l’aide de techniques telles que la spectrométrie de masse ou la spectroscopie RMN. Les échantillons portant des marqueurs radioactifs sont analysés à l’aide d’un comptage par scintillation liquide et de films radiographiques, ce qui sera démontré dans le protocole de marquage isotopique.
Les marqueurs photoréactifs sont des groupes fonctionnels incorporés dans les protéines, qui sont stables jusqu’à ce qu’ils soient exposés à la lumière ultraviolette. Le groupe fonctionnel forme un radical réactif, qui se lie à la protéine la plus proche. Un exemple courant, la L-photo-leucine, contient un cycle diazirine, qui est un réticulant photoréactif. Contrairement au marquage isotopique, il existe une certaine dissemblance chimique entre les analogues chimiques photoréactifs et leurs homologues naturels. Les cellules peuvent incorporer préférentiellement des composés naturels plutôt que des analogues. Par conséquent, il est important d’effectuer un marquage photoréactif dans un milieu exempt de composé imité. Une fois exposés au rayonnement ultraviolet, les groupes photo-réactifs d’une protéine marquée deviennent instables et très réactifs, ce qui l’amène à se réticuler avec les protéines en interaction, créant ainsi un complexe protéique. Les complexes réticulés agissent comme des instantanés qui peuvent ensuite être analysés à l’aide de méthodes SDS-PAGE et de spectrométrie de masse. Cela donne un aperçu des réactions qui se produisent dans la voie métabolique en identifiant les espèces réactionnelles et la façon dont elles interagissent en déterminant les sites de liaison.
Les stratégies de marquage bioorthogonal utilisent des analogues avec de petits groupes fonctionnels qui ont peu ou pas de réactivité avec les biomolécules naturelles. Par exemple, les azides sont de petits groupes fonctionnels, dont la réactivité est dite orthogonale aux réactions biochimiques. Dans la ligature de Staudinger, un groupe phosphine attaque le groupe azido. Cela produit un état de transition qui réagit intramoléculairement avec un ester proche, ce qui donne un ligand lié aux amines. Les groupes fonctionnels bioorthogonaux incorporés dans les biomolécules peuvent être ligaturés à l’aide d’étiquettes de détection telles que les groupes fonctionnels fluorescents et les étiquettes d’affinité telles que les antigènes.
Maintenant que certains concepts et stratégies de marquage métabolique ont été discutés, examinons le processus en laboratoire.
La première étape d’une expérience de marquage métabolique consiste à collecter la protéine d’intérêt. Pour ce faire, des cellules sont cultivées sur une plaque et une méthode d’expression est utilisée pour favoriser la synthèse de la protéine souhaitée. Dans cet exemple, les kinases répétées riches en leucine, ou LRRK, sont exprimées. Le phosphate disodique, contenant du phosphore 32 radioactif, est utilisé comme analogue. Des mesures appropriées doivent être prises pour se protéger contre les rayonnements ionisants. Cela comprend la mise en place d’une zone de travail, le port d’un équipement de protection approprié et la vérification de la contamination radioactive. Une fois que les mesures de sécurité ont été prises, le milieu contenant les analogues isotopiques est préparé. Le milieu de culture est retiré et remplacé par un autre contenant les analogues chimiques isotopiques, puis incubé. Après l’incubation, les cellules sont lysées. Le lysat est recueilli et purifié.
Après purification, les protéines sont résolues à l’aide de SDS-PAGE, puis transférées dans une membrane PVDF. L’autoradiographie est réalisée en exposant la membrane à un film radiographique et mesurée à l’aide d’un imageur au phosphore. Le western blot est utilisé pour mesurer les niveaux relatifs de protéines dans la membrane PVDF. Dans cet exemple, les niveaux de phosphorylation des kinases répétées riches en leucine synthétisées dans les cellules 293T ont été mesurés. L’autoradiogramme montre la quantité de phosphore incorporée dans la protéine. Le Western blot permet d’élucider les niveaux de protéines LRRK. Un logiciel d’analyse d’images est utilisé pour obtenir des données quantitatives sur les niveaux de phosphorylation des protéines.
Dans cette procédure suivante, le marquage photoréactif est démontré. Tout d’abord, les cellules sont préparées et cultivées. L’analogue photoréactif est ajouté aux cellules au milieu de la phase logarithmique et incubé. Dans cette procédure, la p-benzoylphénylalanine est utilisée. Les échantillons sont prélevés à intervalles réguliers et placés sur de la glace. Les échantillons sont ensuite exposés pour obtenir des instantanés des voies biochimiques au fil du temps. Les protéines d’intérêt sont ensuite purifiées et résolues à l’aide de SDS-PAGE.
Une stratégie de marquage photoréactif a été utilisée pour identifier les composés qui interagissent avec la protéine d’intérêt. L’immunodétection par Western blot met en évidence la présence de bandes protéiques indiquant la présence de protéines de poids moléculaire plus élevé dans les échantillons irradiés. Il s’agit de la réticulation due à l’interaction protéine-protéine qui se produit lors de l’irradiation UV.
Maintenant que nous avons passé en revue les procédures de marquage métabolique, examinons certaines des façons dont le processus est utilisé.
Les concepts de marquage métabolique peuvent être étendus aux organismes multicellulaires. Les plantes sont cultivées dans un environnement scellé, riche en isotopes stables pour produire du matériel végétal étiqueté. Du dioxyde de carbone contenant du carbone 13 est ajouté à l’enclos, tandis qu’un engrais riche en azote 15 est utilisé. La matière végétale récoltée qui en résulte peut aider à répondre aux questions sur le cycle du carbone et de l’azote de l’écosystème.
Le marquage permet de séparer l’ARN nouvellement synthétisé de l’ARN plus ancien. En modifiant la concentration initiale de l’analogue, la cinétique de la synthèse de nouveaux ARN peut être déterminée. Les résultats montrent que la concentration de 4-thiouridine affecte la quantité de nouvel ARN transcrite. De plus, les taux d’incorporation du marqueur dans l’ARN peuvent être directement quantifiés à l’aide d’un spectrophotomètre.
En utilisant la chimie clic biorthogonale, les glycanes d’un embryon de poisson zèbre peuvent être marqués. Les œufs sont injectés avec un composé de marquage qui entraîne des marquages d’alcyne sur les glycanes. Les glycanes des larves sont ensuite ligaturés à un composé colorant au stade de développement souhaité. Les glycanes des embryons sont ensuite imagés. Les glycanes produits à différents moments peuvent être identifiés par étiquetage à l’aide de différentes couleurs à différents stades du développement de l’embryon.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur le marquage métabolique. Cette vidéo décrivait les concepts derrière le marquage métabolique et leurs stratégies, passait en revue deux procédures générales et couvrait certaines des utilisations de ces techniques.
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