Summary
In questo studio dimostriamo realizzazione di costruzioni a base di collagene dei tessuti, contenenti mioblasti scheletrici. Questi costrutti ingegnerizzati in 3-D possono essere usati per sostituire o riparare i tessuti
Abstract
Nonostante il fatto che i pacemaker elettronici sono salvavita dispositivi medici, le loro prestazioni a lungo termine nei pazienti pediatrici può essere problematico a causa delle restrizioni imposte dalle ridotte dimensioni di un bambino e la loro crescita inevitabile. Di conseguenza, vi è una reale necessità di terapie innovative progettate specificamente per i pazienti pediatrici con disturbi del ritmo cardiaco. Proponiamo che una alternativa biologica conduttivo costituito da una matrice a base di collagene contenenti autologously cellule derivate potrebbe adattarsi meglio alla crescita, ridurre la necessità di interventi chirurgici ricorrenti, e migliorare notevolmente la qualità della vita per questi pazienti. Nel presente studio, si descrive una procedura per l'integrazione primaria mioblasti scheletrici colture di cellule in una matrice idrogel di moda un costrutto tessuto chirurgicamente impiantabili che servirà come un condotto elettrico tra le camere superiori e inferiori del cuore. In ultima analisi, possiamo anticipare utilizza questo tipo di ingegneria tessutale per ripristinare atrioventricolare di conduzione elettrica nei bambini con arresto cardiaco completo. In considerazione di questo, abbiamo isolare mioblasti dai muscoli scheletrici di ratti neonati Lewis e la piastra di loro su piatti tessuto laminina rivestite cultura utilizzando una versione modificata di protocolli stabiliti
Protocol
Parte 1: Assemblare costruire stampi
- Utilizzare una lama di rasoio di dimezzare tubi in silicone (VWR) e tagliarla in 3 pezzi cm di lunghezza.
- Mettere una goccia di protesi in silicone RTV di qualità adesiva (Rhodia) all'interno di ciascuna estremità del tubo.
- Rapidamente posto un piccolo pezzo (1 cm x 1 cm) di poliestere mesh (McMaster-Carr) sulla caduta di silicone e allinearlo con l'estremità del tubo. Questo presenta una superficie leggermente rialzato e piano per il fissaggio costruire. Ripetere l'operazione per l'altra estremità.
- Lasciare lo stampo ad asciugare a temperatura ambiente per 3 giorni. E 'utile fare 20-30 stampi in un momento, in quanto questi sono essenzialmente usa e getta.
- Una volta che l'adesivo è completamente asciutto, conservare questi stampi in un bicchiere pieno di etanolo al 70% fino a quando non sono necessari. Questa operazione aiuterà sterilizzare gli stampi e il prodotto finito è mostrata in Figura 1.
Parte 2: Preparazione per l'isolamento delle cellule mioblasti
- Diluire 1 mg Laminina (Sigma) in 250 ml 0,22 micron, sterilizzata per filtrazione tampone fosfato salino (PBS) contenente 1% di penicillina / streptomicina (Invitrogen) e 1% Fungizone (Invitrogen).
- Cappotto 150 millimetri di tessuto piastre di coltura (BD Falcon) con 4 mL di soluzione diluita Laminina dal punto 1.1 e incubare a 37 ° C per almeno 4 ore prima della placcatura primaria mioblasti scheletrici.
- Fai il medium mioblasti mescolando F-10 Ham Miscela di nutrienti (Sigma) con 20% FBS (Atlanta Biologicals), 5 ng / L di base del fattore di crescita dei fibroblasti (Promega), 1% penicillina / streptomicina (Invitrogen), e 1% Fungizone ( Invitrogen).
- Preparare la soluzione di digestione del muscolo scheletrico sciogliendo 1 g di ~ 295 U / mg Collagenasi 2 (Worthington) in 100 ml 2,4 U / mL dispasi-2 (Roche). Aggiungere 0,037 g di CaCl 2 e mescolare bene. Filtro sterilizzare il buffer digestione utilizzando un disco di 0,2 micron filtro montato su una siringa da 10 ml e aliquote conservare a -20 ° C. Posizionare l'importo necessario per la digestione dei tessuti a 37 ° C insieme con i media mioblasti.
Parte 3: isolamento dei mioblasti di muscolo scheletrico
- Con pinze e forbici piccole, rimuovere i muscoli paravertebrali da ratti neonati morti Lewis dal taglio lungo la schiena lungo il midollo spinale, togliendo la pelle e gli strati fascia e poi asportare i muscoli.
- In una cappa colture di tessuti, i muscoli asportato posto in un tubo da 50 ml coniche (BD Falcon) riempito con 40 mL di soluzione 1X Salt Hanks bilanciata (HBSS) (Invitrogen) su ghiaccio. Lasciare le strisce muscolari di depositarsi sul fondo della provetta e rimuovere con attenzione la maggior parte dei residui liquidi e sangue da vuoto di aspirazione con una pipetta Pasteur sterile in una cappa cultura (Baker).
- Versare i pezzi di muscolo raccolte su di un piatto di cultura 150 mm e rimuovere la maggior quantità di liquido residuo possibile con aspirazione. Utilizzando 2 singolo taglio lame di rasoio tritare il tessuto di una pasta spessa. Versare preriscaldata soluzione digestione sulla pasta e trasferire il composto per un nuovo tubo da 50 ml con una pipetta 10 ml. Durante la digestione enzimatica, il tessuto è occasionalmente triturato (senza bolle) con una pipetta 10 mL montata su un cordless Pipetta-Aid (Drummond). Ancora una volta, permette al tessuto di stabilirsi e di rimuovere il liquido in eccesso.
- Posizionare il tubo su una piattaforma a dondolo e digerire a 37 º C per circa 30 min.
- Una volta che il muscolo è liquefatto, filtrare la soluzione attraverso un colino cellula 70 micron (BD Falcon) e centrifugare a temperatura ambiente per 10 min a 600 xg (Beckman GP). Con una pipetta Pasteur e di aspirazione, rimuovere la maggior quantità di liquido possibile e risospendere il precipitato con 10 ml di medium mioblasti caldo.
- Pre-piastra le cellule su una piastra di coltura non patinata 150 millimetri di tessuto per 15 minuti per contribuire a rimuovere fibroblasti.
- Trasferire le cellule che non hanno ancora attaccato al laminina rivestite cultureware e diluire in modo che vi è una piastra per ogni 1 o 2 cuccioli di ratto. Porre la piastra in una serie incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2.
Parte 4: Casting costruzioni di ingegneria tessutale (5 ml)
- Dopo 1 o 2 giorni, rimuovere 10 dei 150 lastre tessuto millimetri cultura mioblasti dal termostato, lavare due volte con 37 ° C 1X PBS e aggiungere 4 ml di caldo 0,05% tripsina-EDTA per ogni piatto. Ritorna le piastre per l'incubatore per 5 min.
- Raccolto il mioblasti staccato dalle piastre nel cofano della cultura e raccogliere il liquido in un tubo da 50 ml (BD Falcon). Usare 10 ml di medium mioblasti a lavare tutti i piatti e combinare questo con le cellule in provetta da centrifuga. Agglomerare le cellule a temperatura ambiente per 10 min a 600 xg (Beckman GP) e rimuovere il liquido in eccesso come descritto al punto 3.5.
- Risospendere le cellule mioblasti in 1,6 ml di terreno mioblasti e posto sul ghiaccio.
- Utilizzando cautela il numero 4 stampini da costruire passo 1,5 e lavare due volte con PBS 1X. Aspirazione aspirare tutte le tracce di PBS con una pipetta Pasteur prima di effettuare ogni stampo in un 6-ben cu tessutolture piastra (BD Falcon).
- Raccogliere le altri reagenti necessari per la preparazione di costruire (F10 Ham di 10X, gli antibiotici, il collagene di tipo 1 [3,9 mg / ml] [6] e Matrigel ™) su ghiaccio e tenere i media mioblasti a 37 ° C. Combina 500 microlitri 10X Ham F10, 100 ul penicillina / streptomicina, 100 microlitri Fungizone, 1,6 ml di collagene, e 750 ™ Matrigel microlitri in un tubo da 15 ml. Miscelare la soluzione per 10 secondi con un Mini-vortex (VWR) impostato su 10 e posto sul ghiaccio.
- Successivamente, aggiungere 80 ml di NaHCO 3 e la sospensione mioblasti dal punto 3.3 a miscela dal punto 3.5. Vortice della miscela per 10 secondi e riportare il tubo al secchio del ghiaccio per un paio di minuti per eliminare la soluzione di bolle.
- Accuratamente fusa il composto negli stampi prima che inizi a solidificare con una pipetta 10 ml. Ogni stampo terrà circa 1 ml di liquido viscoso. Cercate di evitare l'introduzione di bolle d'aria durante questa procedura.
- Trasferire accuratamente l'piastra contenente i costrutti cast dell'incubatore. Dopo circa 30 minuti, togliere i costrutti solidificato dal termostato ed aggiungere con cautela medio mioblasti in ciascun pozzetto per coprire il tessuto costrutto. Riportare la piastra per l'incubatore (Figura 2).
Parte 5: risultati Rappresentante
Quando questo protocollo è eseguita correttamente, i mioblasti contenente costruire il tessuto è pronto per l'impianto in vivo (cioè quando viene rimosso dallo stampo) o per ulteriori analisi in vitro dopo 2 giorni.
Esempi Figura 1. Completato di costruire stampi (vedi punto 1.5).
Figura 2. Un solidificato mioblasti contenente tessuto costruire [1].
Figura 3. Sezioni H & E macchiato di un mioblasti contenente tessuto costruire. "A" rappresenta una sezione longitudinale e "B" mostra una sezione trasversale.
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Discussion
Le forme in cui il costrutto tessuto sarà cast può essere effettuato in qualsiasi forma e dimensione, ma ci deve essere almeno due punti di attacco. In caso contrario, la matrice e le cellule formano una struttura sferica e le cellule muoiono. Nel presente protocollo, si descrive l'utilizzo di una maglia in poliestere per questo scopo, ma abbiamo anche utilizzato con successo in rete in acciaio inox. Ovviamente, più grandi stampi richiederà più celle e un volume maggiore di altri ingredienti. Quando si effettuano gli stampi, è importante ridurre al minimo la quantità di silicone adesivo utilizzati e per assicurare che si trova agli estremi confini del tubo. Questo perché mioblasti vicino l'adesivo tendono a non essere praticabile, anche dopo diversi giorni di stagionatura. Inoltre, è prudente al piatto del mioblasti solo per un giorno o due prima di preparare i costrutti di tessuto come fibroblasti contaminanti si moltiplicheranno rapidamente e, infine, sopraffare i componenti miogena della cultura. Allo stesso modo, mioblasti non dovrebbe essere placcato densamente perché le cellule in contatto tra di loro inizieranno a fondere e differenziarsi in miotubi. Per quanto riguarda la fabbricazione dei costrutti di tessuto, ci sono un certo numero di fonti disponibili in commercio il collagene di tipo 1, tuttavia, ogni dimostrare le differenze nel tasso di solidificazione e la consistenza del prodotto finale. Inoltre, è essenziale che la preparazione collagene non viene irradiato con luce UV come questo processo inibisce il processo di gelificazione. Nelle nostre mani, i costrutti cambiamento di colore dal rosa scuro al rosa chiaro durante la solidificazione. Infine, la nostra preparazione collagene è l'acido-solublized (pepsina non digerito), in modo che il pH della miscela di cui 3,5 deve essere aumentata con l'aggiunta di NaHCO 3 prima di incorporare le cellule.
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Disclosures
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso in bambini Hospital di Boston.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da borse di ricerca dal National Institutes of Health (HL068915; HL088206), un premio Ricercatore Nuovo dal Fondo di ricerca Thrasher, e contributi al fondo di conduzione cardiaca presso il Children Hospital di Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone tubing | VWR international | 60985-724 | |
| Silicone adhesive | Rhodia Silicones | MED ADH 4300 RTV | |
| Polyester Mesh | McMaster-Carr | 93185T17 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Nutrient Mixture F-10 HAM | Sigma-Aldrich | N6908 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Dispase-2 | Roche Group | 10295825001 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | 46H8863 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Promega Corp. | G5071 | |
| 150 mm tissue culture dishes | BD Biosciences | 353025 | |
| 0.05% (1X) Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| 7.5% NaHCO3 | GIBCO, by Life Technologies | 25080-094 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 6-well plates | BD Biosciences | 353046 | |
| 50 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352098 | |
| 15 mL Conical Vial | BD Biosciences | 352099 | |
| 0.2 μm filter | Nalge Nunc international | 194-2520 |
References
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Blau, H. M., Webster, C. Isolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).
- Powell, C. Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy. Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).
- Vandenburgh, H. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Gallop, P. M., Seifter, S. Preparation and Properties of Soluble Collagens. Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).
