Summary
SC1 функции через двойное торможение Рас-GAP и ERK1. Мы протестировали функции SC1 в поддержке ЭСК мыши самообновление в отсутствие LIF и показал, что SC1 способен поддерживать самообновление мыши культур ЭСК.
Abstract
Мышь эмбриональных стволовых (ЭС) клеток условно культивировали с подавления лейкоза фактор (LIF) для поддержания самообновления.
Protocol
1. Подготовка пластин MEF подачи
- За день до культивирования клетки ES, оттепель один флакон облученных E14.5 CF-1 MEF фидерных клеток (см. нашу процедуру о том, как оттепель ЭС клетки).
- Пластина питателя MEF клетки при плотности 10000 клеток / лунку в 12-луночного планшета. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2. MEF ячейки СМИ: DMEM с добавлением 10% ES-би-эс, 1X 1X глютамин и не-незаменимых аминокислот.
2. Поддержание самообновления ЭС клетках мыши
- Отсоедините ES клеток с использованием трипсина. Семенной клетки при плотности 50000 клеток / лунку на заранее подготовленные MEF подачи пластин в питательной среде (Knockout MEM дополнена с 15% КСР, 4 мМ L-глутамина, 0,1 ммоль без незаменимых аминокислот и 1X BME) с добавлением SC1 при требуемой концентрации (мы использовали 100 нм, 300 нм, и 1 мкМ). Мы также добавили положительный контрольный колодец, который был дополнен 1000 μ / мл LIF. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2.
- Культуры клеток при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 3-4 дней в каждом проходе. Обновить СМИ каждые 48 часов.
- Прохождение клетки 1:10 до 1:15 трипсином для поддержания одинаковой плотности, как начальная плотность посева. Через 5 пассажей, клетки могут быть проверены на предмет выражения типичных плюрипотентности маркеры, используя иммуноцитохимия.
3. Иммуноцитохимическая Экспертиза плюрипотентности Маркеры
- Вымойте клетки мягко три раза PBS.
- Fix клеток с 500 мкл фиксатором в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Вымойте клетки мягко три раза PBS.
- Блок неспецифического связывания с 500 мкл блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре.
- Инкубируйте клетки с 250 мкл конкретных первичных антител (мы использовали Nanog, Sox2, SSEA1 и Oct4 на следующие разведения: 1:500, 1:2000, 1:500 и 1:500)
- Вымойте клетки мягко три раза PBS.
- Инкубируйте клетки с 250 мкл вторичными антителами в течение двух часов при комнатной температуре, держась подальше от света (мы использовали осла антимышиным сопряженных с Alexa Fluor 555 ® на 1:2000 и осла анти-кролик сопряженных с Alexa Fluor ® 488 на 1 : 2000).
- Вымойте клетки мягко три раза PBS.
- Добавить DAPI (конечная концентрация 1 мкг / мл) до последнего мыть и инкубировать 5 минут для визуализации ядер.
- Анализ клеток под флуоресцентным микроскопом.
4. Представитель Результаты:
1. Морфология результаты:
ЭС клетки мыши (ESC R1) были выращены на MEF фидерных клеток в присутствии либо LIF или SC1 для поддержания самообновления в недифференцированное состояние. После второго прохода, дифференциации можно было наблюдать в клетках, не LIF или SC1 (отрицательный контроль) и после 5 проходов по сути, не недифференцированное колоний не наблюдалось. LIF (положительный контроль) рассматриваются колоний остались в недифференцированном состоянии на протяжении 5 проходов клетки. Клетки обрабатывали SC1 в концентрации 300 нМ или 100 нм также остается недифференцированной после 5 проходов, однако, клетки обрабатывали 1 мкМ SC1 опытных гибель клеток после четвертого прохода. (Рис 2 отметить приложение) В таблице 1 приведены морфологические наблюдения.
2. Экспрессия маркеров плюрипотентности
ЭС клетки мыши поддерживается в течение 5 проходы были зафиксированы и рассмотрены иммуноцитохимии для SSEA1, Oct4, Nanog и Sox2. Маркер выражении был похож на клетки сохраняются в LIF. (Рис. 3 и 4 записки приложение)
Рисунок 1: Морфология сравнению клеток поддерживается в LIF или SC1. Никаких различий в морфологии не наблюдалось.
Рисунок 2 и Рисунок 3: Nanog, SSEA1, Sox2, и Oct4 окрашивания ЭС клеток поддерживается с SC1 или LIF (рис. 4 записки приложение). Клетки поддерживается в SC1 показывают, что аналогичные выражения плюрипотентности маркер для клеток поддерживается в LIF.
Таблица 1
| Отрицательный контроль | LIF Положительный контроль | SC1 1 мкм | SC1 300 нМ | SC1 100 нМ | |
| Прохождение первого | Нормальная морфология ячейки ES | Нормальная морфология ячейки ES | Нормальная морфология ячейки ES | Нормальная морфология ячейки ES | Нормальная морфология ячейки ES |
| Второй проход | Некоторые дифференцированной морфологии | Нормальная ES морфологии клеток | Нормальная морфология ячейки ES | Нормальная морфология ячейки ES | Нормальная морфология ячейки ES |
| Третий Прохождение | Большинство клеток дифференцированных | Нормальная морфология ячейки ES | Нормальная морфология ячейки ES | Нормальная морфология ячейки ES | Нормальная морфология ячейки ES |
| Четвёртое Прохождение | Нет ESC колонии | Нормальная морфология ячейки ES | Гибель клеток наблюдается | Нормальная морфология ячейки ES | Нормальная морфология ячейки ES |
| Прохождение пятой | дифференцированный | Нормальная морфология ячейки ES | Гибель клеток наблюдается | Нормальная морфология ячейки ES | Нормальная морфология ячейки ES |
Discussion
Небольшой SC1 молекулы могут быть использованы для поддержания самообновления с недифференцированное состояние, в ЭС клетках мыши. Перед использованием на непроверенных клеточной линии, однако, следует титровать, чтобы определить оптимальную концентрацию. Например, мы протестировали три концентрации на мыши ES клеточной линии ЭСК R1. 100 нм и 300 нм концентрации были в состоянии поддерживать ЭС клетках мыши, однако, 1 мкМ концентрации токсичных.
SC1 также может быть использован под фидерных свободных условиях.
Disclosures
Авторы этой статьи являются сотрудниками Stemgent, который производит реактивы и инструменты, используемые в этой статье.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Шэн Дин из исследовательского института Скриппса и доктор Дэн Hongkui Пекинского университета за оказанную помощь и руководство.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SC1 | Stemgent | 04-0011 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| SSEA-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | 21702 | |
| Nanog antibody | Abcam | ab21603 | |
| Sox2 antibody | Chemicon International | Ab5603 | |
| Oct4 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-5279 |
References
- Williams, R. L., Hilton, D. J., Pease, S., Willson, T. A., Stewart, C. L., Gearing, D. P., Wagner, E. F., Metcalf, D., Nicola, N. A., Gough, N. M. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ying, Q. L., Wray, J., Nichols, J., Batlle-Morera, L., Doble, B., Woodgett, J., Cohen, P., Smith, A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453, 519-523 (2008).
- Chen, S., Do, J. T., Zhang, Q., Yao, S., Yan, F., Peters, E. C., Scholer, H. R., Schultz, P. G., Ding, S. Self-renewal of embryonic stem cells by a small molecule. Proc. Natl. Acat. Sci. USA. 103, 17266-17271 (2006).
