Ce protocole est un extrait de Nazario-Toole et Wu, Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).
1. Préparer les particules de fluorescéine pour l’injection
- Reconstituer 10 mg de particules de bactéries tuées par la chaleur disponibles dans le commerce, marquées à la fluorescéine (voir le tableau des matières) jusqu’à une concentration de base de 10 mg/mL en ajoutant 990 μL stériles 1x PBS et 10 μL 50 mM d’azoture de sodium. Vortex à mélanger.
- Diviser en aliquotes à usage unique de 8 μL dans des tubes de 0,2 mL et conserver dans une boîte sombre à 4 °C pour minimiser la sensibilité associée à la lumière.
REMARQUE : L’agent de conservation à base d’azoture de sodium est facultatif et peut être omis si des stocks de 10 mg/mL sont fabriqués avec 1 mL de PBS stérile, aliquotes et entreposés à -20 °C.
- Préparez une solution de 10 ml de colorant alimentaire à 5 % dans 1 PBS en mélangeant 500 μL de colorant alimentaire vert filtré pour seringue et 9,5 ml de PBS stérile.
- Laver les particules avant l’injection pour éliminer l’azoture de sodium. Mélanger 42 μL stériles 1x PBS et 8 μL de 10 mg/mL dans un tube de 1,7 mL. Centrifuger à vitesse maximale pendant 2,5 min à température ambiante.
- Retirez le surnageant, ajoutez 50 μL 1x PBS et centrifugez à vitesse maximale pendant 2,5 min à température ambiante.
- Répétez les étapes 1.3 et 1.3.1 2 fois, pour un total de 3 lavages.
- Après le lavage final, jeter le surnageant et remettre les particules en suspension à 1,6 mg/mL dans 50 μL de colorant alimentaire à 5 % dans 1x PBS.
- Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Conserver à 4 °C, jeter après 1 semaine.
2. Préparez la station d’injection et les mouches
- Préparez le tampon d’injection. Pour injecter jusqu’à 4 génotypes de mouches en même temps, utilisez du ruban de laboratoire pour diviser un coussinet anti-mouches rectangulaire au CO2 en 4 sections. Sur la paillasse près du microscope, désignez des zones où placer les flacons une fois que les mouches ont été alignées sur le tampon (un pour chaque coin du tampon).
- Préparez des flacons de mouches d’âge compatible, âgées de 4 à 7 jours, pour injection. Pour chaque souche à tester, transvaser 5 mâles et 5 femelles dans un flacon frais étiqueté de nourriture préparée pour mouches et conserver à 25 °C.
- Préparez l’injecteur pneumatique (voir Tableau des matériaux) en réglant l’instrument sur un mode TIMED de 100 ms (courtes rafales de pression de gaz pour expulser le liquide – permettant la distribution de volumes inférieurs au nanolitre).
- Préparez les lames du microscope. Coupez des bandes de ruban électrique de 1,5 pouce, pliez-les en boucle avec le côté adhésif vers l’extérieur et placez-les sur une lame de microscope étiquetée.
3. Préparer les aiguilles capillaires en verre
- Tirez les aiguilles de verre (capillaires de verre à paroi mince) à l’aide d’un extracteur d’aiguille.
- Tenez l'aiguille sous le microscope avec un micromètre et cassez la pointe à l'aide d'une pince à épiler en acier inoxydable à pointe fine #5. Des pointes de 100 μm sont suffisantes pour percer la cuticule de la mouche tout en minimisant les blessures.
- Mesurez le volume de liquide qui sera injecté dans chaque mouche. Chargez l’aiguille avec du colorant alimentaire stérile à 5 % dans 1x PBS et expulsez le liquide sur une goutte d’huile minérale sur un micromètre à platine de 0,01 mm.
REMARQUE : Si la gouttelette de liquide est sphérique, le volume en picolitres est calculé comme suit : (taille)3/1910. Une aiguille d’un diamètre de 100 μm éjectera ~2 nL en 100 ms.
4. Injecter des mouches
- Pipeter 10 μL de particules de 1,6 mg/mL sur un petit carré de parafilm.
- Tirez le liquide dans l’aiguille et montez-le dans la buse de l’injecteur (voir tableau des matériaux).
- Anesthésisez les mouches avec du CO2 et alignez-les dans leur zone désignée sur le tapis anti-mouches, avec le côté ventral vers le haut et les têtes orientées vers l’avant du coussin. Placez les flacons aux endroits correspondants sur la paillasse.
- Injectez des mouches dans le coin supérieur de l’abdomen avec 5 pompes de 100 ms de liquide (~10 nL au total).
- Transférez les mouches injectées dans les flacons appropriés, notez l’heure sur le flacon. Conserver à 25 °C.
- Chargez une nouvelle aiguille avec une solution de bleu de trypan à 0,4 %.
- Réglez l’injecteur pneumatique sur GATED, ce qui permet à un flux d’air constant de pousser le liquide hors de l’aiguille.
- Anesthésiez les mouches après qu’elles se soient reposées pendant 30 minutes et injectez-les avec Trypan Blue jusqu’à ce que l’abdomen soit plein et distendu.
REMARQUE : Lors de l’examen de la maturation des phagosomes avec des particules marquées avec un colorant sensible au pH, laissez les mouches se reposer pendant 1 h et n’injectez pas de bleu trypan avant de monter les mouches.
- Fixez les mouches sur les lames de microscope avec du ruban isolant, côté ventral vers le bas. Poussez les ailes sur le côté de la mouche et fixez-les au ruban. De plus, enfoncez doucement la tête dans le ruban adhésif pour vous assurer que la mouche ne bougera pas.
