Overview
يصف هذا الفيديو تقنية الحقن العضلي لتوصيل المركبات إلى العضلات الظهرية لسمك الحمار الوحشي البالغ.
Protocol
1. حقن لقاح الحمض النووي والكهرومporation
- للتحصين وفقا لهذا البروتوكول، استخدم سمك الحمار الوحشي البالغ البالغ من العمر 6 إلى 12 شهرا. الحفاظ على الأسماك في نظام التدفق من خلال مع 14/10 ساعة ضوء / دورة الظلام، مع الحد الأقصى من سبعة أسماك لكل 1 لتر من الماء.
- إعداد 0.02٪ 3-أمينوبنزويك حمض إيثيل استر (tricaine) حل (درجة الحموضة 7) في مياه الخزان تخدير الأسماك. استخدام طبق بيتري 10 سم أو شيء من هذا القبيل.
- إعداد خزان الانتعاش عن طريق ملء كوب 5 لتر مع 3 لتر من مياه النظام النظيف.
- إعداد حشوة التطعيم للحفاظ على الأسماك في وضع ثابت أثناء التطعيم. خذ 5 × 7 سم2 قطعة من اسفنجة 2-3 سم سميكة. قطع الأخدود في الاسفنج مع شفرة مشرط أو مقص حاد.
ملاحظة: ويمكن استخدام الحشو التطعيم نفسه في تجارب متعددة. تطهير الإسفنج بين التجارب عن طريق نقع في الكحول الإيثيل 70٪ والسماح لتجف. - نقع تماما الإسفنج في مياه النظام وتعيين الاسفنج على طبق بيتري.
- بسرعة الأسماك 24 ساعة قبل التطعيمات.
- تخدير حمار وحشي واحد عن طريق وضعه على طبق بيتري يحتوي على 0.02٪ tricaine. انتظر حتى لا تستجيب الأسماك لتحفيز اللمس وحتى لا تكون هناك حركة للخياشيم. تخدير سمكة واحدة في وقت واحد.
- باستخدام ملعقة بلاستيكية، نقل حمار وحشي مخدر على الإسفنج الرطب وتعيين الجانب البطني للأسماك وصولا الى الأخدود. في الموضع الصحيح، تأكد من أن الرأس ومعظم الجسم من الأسماك داخل الأخدود والزعنفة الظهرية والذيل تبرز من الأخدود.
- تحت المجهر، ضع الإبرة بعناية في زاوية 45 درجة تقريبا بالقرب من العضلة الظهرية لسمك الحمار الوحشي، باستخدام عجلات الضبط الدقيق x-و y-axis على الميكرمانيبولاتور.
- العثور على بقعة صغيرة دون جداول أمام زعنفة الظهر، حيث دفع الإبرة لا يتطلب القوة. إذا شعرت المقاومة، حاول بقعة مجاورة. تجنب إصابة العمود الفقري أو الزعنفة الظهرية أو الموازين.
ملاحظة: إذا انحنت الإبرة أثناء الضغط، قم بتقصير الإبرة قليلا عن طريق قطعها. - استخدم مفتاح القدم لحقن محلول اللقاح تدريجيا في العضلة. مراقبة الحقن من خلال المجهر: فينول الأحمر مرئيا كما أنه يدخل الأنسجة العضلية. ضبط مدة النبض إذا لزم الأمر.
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم زر البادئ النبض على اللوحة الأمامية للمضخة الهوائية للحقن. ومع ذلك، فإن استخدام مفتاح القدم عن بعد يسمح باستخدام اليد الأخرى لضبط طول النبض بواسطة عجلة الاتصال الهاتفي ذات 10 بدوره. تجنب حقن المحلول بسرعة كبيرة ، لأن هذا قد يسبب تلفا مفرطا في الأنسجة. تأكد من عدم حقن أي هواء. - Electroporate الأسماك مباشرة بعد الحقن. تأكد من أن الأسماك لا تزال تحت التخدير. الحفاظ على الأسماك على الإسفنج وتعيين الأسماك بين الأقطاب الكهربائية من نوع ملاقط، بحيث تقع الأقطاب الكهربائية على كل جانب من موقع الحقن. لا تضغط على ملاقط القطب ضيق جدا ولكن الحفاظ على كل من الأقطاب الكهربائية على اتصال مع الأسماك.
- اضغط على زر البدء على جهاز الكتروبورتور لإعطاء ستة نبضات 40 فولت، 50 مللي ثانية.
- نقل بلطف الأسماك إلى خزان الانتعاش.
- تنظيف الأقطاب الكهربائية بعد كل electroporation عن طريق تمرير لهم مع الإيثانول 70٪.
ملاحظة: مراقبة رفاهية الأسماك بعناية بعد التطعيم. القتل الرحيم أي سمكة تظهر علامات عدم الراحة (الشفاء البطيء من التخدير، والسباحة الشاذة، واللهاث) في tricaine 0.04٪. بعد الانتعاش، نقل الأسماك إلى وحدة التدفق من خلال وإطعامه بشكل طبيعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| Plastic spoon | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench |
