Overview
该视频描述了肌肉注射技术,用于将化合物输送到成年斑马鱼的后部肌肉。
Protocol
1. 注射DNA疫苗和电扩散
- 对于根据此协议的免疫接种,使用健康的6至12个月大的成年斑马鱼。将鱼保持在14/10小时光/暗循环的流动系统中,每1升水中最多有7条鱼。
- 在水箱水中准备0.02%的3氨基苯甲酸乙酯(三甲酸)溶液(pH 7),用于麻醉鱼。使用10厘米的培养皿或类似的东西。
- 用 3 升清洁系统水填充 5 升烧嘴,准备回收罐。
- 准备疫苗接种填充物,使鱼在接种疫苗期间处于固定位置。取一块5×7厘米2 厘米厚的海绵。用手术刀刀片或锋利的剪刀将凹槽切入海绵中。
注: 相同的疫苗接种填充可用于多个实验。通过将海绵浸泡在70%的乙醇中,对实验之间的海绵进行消毒,并允许干燥。 - 将海绵浸泡在系统水中,并将海绵放在培养皿上。
- 接种疫苗前24小时禁食鱼。
- 麻醉一条斑马鱼,将其放在含有0.02%三角星的培养皿上。等到鱼对触摸刺激没有反应,直到刺没有运动。一次麻醉一条鱼。
- 使用塑料勺子,将麻醉斑马鱼转移到湿海绵上,并将鱼的腹侧放到凹槽中。在正确的位置,确保鱼的头部和大部分身体在凹槽内,背鳍和尾巴从凹槽中伸出来。
- 在显微镜下,使用微操纵器上的 x-和 y 轴微调轮,小心地将针头置于靠近斑马鱼躯干肌肉的大约 45° 角度。
- 在背鳍前找到没有鳞片的小点,推针不需要力。如果感觉到阻力,请尝试相邻的位置。避免伤害脊椎、背鳍或鳞片。
注: 如果针头在推力时弯曲,则通过切割稍微缩短针头。 - 使用足部开关逐渐将疫苗溶液注射到肌肉中。通过显微镜观察注射:苯酚红色在进入肌肉组织时可见。如果需要,调整脉冲的持续时间。
注: 或者,使用气动泵前面板上的脉冲启动按钮进行注射。但是,使用远程脚开关允许使用另一只手通过 10 转拨盘轮调整脉冲长度。避免注射溶液太快,因为这可能导致过度的组织损伤。确保不要注入任何空气。 - 注射后立即对鱼进行电镀。确保鱼还在麻醉下。将鱼放在海绵上,将鱼放在钳子式电极之间,使电极位于注射点的每一侧。不要将电极钳子压得太紧,但要保持两个电极与鱼的接触。
- 按下电压器上的启动按钮,提供六个 40 V,50 ms 脉冲。
- 轻轻地将鱼转移到回收罐中。
- 每次电挥发后,用70%的乙醇刷净电极。
注: 接种疫苗后仔细监测鱼的福祉。在0.04%的三卡因中安乐死任何有不适迹象的鱼(麻醉、异常游泳、喘气缓慢恢复)。恢复后,将鱼转移到流动单元,并正常喂养。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
Plastic spoon | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench |