Injeção intramuscular (IM): Entrega composta no músculo dorsal de um zebrafish adulto

Overview

Este vídeo descreve a técnica de injeção intramuscular para fornecer compostos nos músculos dorsais de um zebrafish adulto.

Protocol

1. Injeção da Vacina de DNA e Eletroporação

1. Para imunizações de acordo com este protocolo, use zebrafish adulto saudável de 6 a 12 meses. Mantenha o peixe em um sistema de fluxo com um ciclo claro/escuro de 14/10 horas, com um máximo de sete peixes por 1 L de água.
2. Prepare uma solução de ácido etílico 0,02% 3-aminobenzoico (tricaine) (pH 7) em água do tanque para anestesiar o peixe. Use uma placa de Petri de 10 cm ou algo parecido.
3. Prepare um tanque de recuperação preenchendo um béquer 5 L com 3 L de água limpa do sistema.
4. Prepare um preenchimento de vacinação para manter o peixe em posição fixa durante a vacinação. Pegue um pedaço de 5 x 7 cm² de uma esponja de 2 a 3 cm de espessura. Corte uma ranhura na esponja com uma lâmina de bisturi ou uma tesoura afiada.
   NOTA: O mesmo preenchimento de vacinação pode ser usado em vários experimentos. Desinfete a esponja entre os experimentos, encharcando-a em 70% de álcool etílico e deixe secar.
5. Mergulhe completamente a esponja na água do sistema e coloque a esponja em uma placa de Petri.
6. Acelere o peixe 24 horas antes das vacinas.
7. Anestesia um peixe-zebra colocando-o em uma placa de Petri contendo 0,02% de tricaine. Espere até que o peixe não responda à estimulação do toque e até que não haja movimento das brânquias. Anestesiar um único peixe de cada vez.
8. Usando uma colher de plástico, transfira o zebrafish anestesiado para a esponja molhada e coloque o lado ventral do peixe para baixo na ranhura. Na posição correta, certifique-se de que a cabeça e a maior parte do corpo do peixe estão dentro da ranhura e a barbatana dorsal e a cauda estão se projetando para fora da ranhura.
9. Sob o microscópio, coloque cuidadosamente a agulha em um ângulo de aproximadamente 45° perto do músculo dorsal do zebrafish, usando as rodas de ajuste fino x e y-eixo no micromanipulador.
10. Encontre o pequeno ponto sem escamas na frente da barbatana dorsal, onde empurrar a agulha não exige força. Se a resistência for sentida, tente um local adjacente. Evite ferir a coluna vertebral, a barbatana dorsal ou as escamas.
    NOTA: Se a agulha dobrar enquanto empurra, encurte ligeiramente a agulha cortando-a.
11. Use o interruptor do pé para injetar gradualmente a solução da vacina no músculo. Observe a injeção através do microscópio: o vermelho fenol é visível quando entra no tecido muscular. Ajuste a duração do pulso, se necessário.
    NOTA: Alternativamente, use o botão de iniciador de pulso no painel frontal da bomba pneumática para a injeção. No entanto, o uso de um interruptor remoto para o pé permite usar a outra mão para ajustar o comprimento do pulso pela roda de discagem de 10 voltas. Evite injetar a solução muito rápido, pois isso pode causar danos excessivos ao tecido. Certifique-se de não injetar ar.
12. Eletroporar o peixe imediatamente após a injeção. Certifique-se de que o peixe ainda está sob anestesia. Mantenha o peixe na esponja e coloque o peixe entre eletrodos do tipo pinça, de modo que os eletrodos estejam localizados em cada lado do local da injeção. Não pressione muito as pinças de eletrodos, mas mantenha os dois eletrodos em contato com o peixe.
    1. Pressione o botão de partida no eletroporador para dar seis pulsos de 40 V, 50 ms.
    2. Transfira suavemente o peixe para o tanque de recuperação.
    3. Limpe os eletrodos após cada eletroporação deslizando-os com 70% de etanol.
       NOTA: Monitore cuidadosamente o bem-estar dos peixes após a vacinação. Eutanize qualquer peixe que atrapale sinais de desconforto (uma recuperação lenta da anestesia, natação aberrante, ofegante) em 0,04% de tricaine. Após a recuperação, transfira o peixe para a unidade de fluxo e alimente-o normalmente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Olympus	ZS61
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
Plastic spoon
Sponge
Styrofoam workbench