Overview
Denne videoen beskriver teknikken for intramuskulær injeksjon for å levere forbindelser inn i dorsale muskler i en voksen sebrafisk.
Protocol
1. Injeksjon av DNA-vaksinen og elektroporasjon
- For immuniseringer i henhold til denne protokollen, bruk sunn, 6 til 12 måneder gammel voksen sebrafisk. Hold fisken i et gjennomstrømningssystem med en 14/10 t lys/mørk syklus, med maksimalt syv fisk per 1 liter vann.
- Forbered en 0,02% 3-aminobenzoic acid etyl ester (tricaine) løsning (pH 7) i tankvann for bedøvelse av fisken. Bruk en 10 cm Petri-tallerken eller noe lignende.
- Forbered en utvinningstank ved å fylle et 5 L beger med 3 L rent systemvann.
- Forbered en vaksinasjonspolstring for å holde fisken i fast stilling under vaksinasjonen. Ta et 5 x 7 cm2 stykke av en 2 til 3 cm tykk svamp. Klipp et spor inn i svampen med et skalpellblad eller skarp saks.
MERK: Den samme vaksinasjonspolstringen kan brukes i flere eksperimenter. Desinfiser svampen mellom forsøkene ved å suge den i 70% etylalkohol og la den tørke. - Bløtlegg svampen grundig i systemvannet og sett svampen på en Petri-tallerken.
- Spol fisken 24 timer før vaksinasjonene.
- Bedøv en sebrafisk ved å plassere den på en Petri-tallerken som inneholder 0,02% trikain. Vent til fisken ikke reagerer på berøringstimulering og til det ikke er bevegelse av gjellene. Bedøv en enkelt fisk om gangen.
- Bruk en plastskje, overfør bedøvet sebrafisk på den våte svampen og sett fiskens ventrale side ned i sporet. I riktig posisjon må du sørge for at hodet og det meste av fiskens kropp er inne i sporet og dorsalfinen og halen stikker ut fra sporet.
- Under mikroskopet plasserer du nålen forsiktig i en omtrent 45° vinkel nær sebrafiskens dorsalmuskel, ved hjelp av x- og y-aksen finjusteringshjul på mikromanipulatoren.
- Finn det lille stedet uten vekter foran dorsalfinen, hvor det å skyve nålen ikke krever kraft. Hvis motstanden føles, prøv et tilstøtende sted. Unngå å skade ryggraden, ryggfinnen eller skalaene.
MERK: Hvis nålen bøyer seg mens du skyver, forkort nålen litt ved å kutte den. - Bruk fotbryteren til gradvis å injisere vaksineløsningen i muskelen. Vær oppmerksom på injeksjonen gjennom mikroskopet: fenolrød er synlig når den kommer inn i muskelvevet. Juster pulsens varighet om nødvendig.
MERK: Alternativt kan du bruke pulsinitiatorknappen på frontpanelet på den pneumatiske pumpen til injeksjonen. Bruken av en ekstern fotbryter gjør det imidlertid mulig å bruke den andre hånden til å justere pulslengden med det 10-dreiede hjulet. Unngå å injisere løsningen for fort, da dette kan forårsake overdreven vevsskade. Pass på at du ikke injiserer luft. - Elektroporate fisken umiddelbart etter injeksjonen. Pass på at fisken fortsatt er under anestesi. Hold fisken på svampen og sett fisken mellom pinsett-type elektroder, slik at elektrodene er plassert på hver side av injeksjonsstedet. Ikke trykk elektrode pinsettene for stramt, men hold begge elektrodene i kontakt med fisken.
- Trykk på startknappen på elektroporatoren for å gi seks pulser på 40 V og 50 ms.
- Overfør fisken forsiktig til utvinningstanken.
- Rengjør elektrodene etter hver elektroporasjon ved å sveipe dem med 70% etanol.
MERK: Overvåk fiskens velvære nøye etter vaksinasjonen. Euthanize noen fisk som viser tegn på ubehag (en langsom utvinning fra anestesi, avvikende svømming, gisping) i 0,04% trikain. Etter utvinning, overfør fisken til gjennomstrømningsenheten og mate den normalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
Microscope | Olympus | ZS61 | |
ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
Plastic spoon | |||
Sponge | |||
Styrofoam workbench |