Overview
यह वीडियो एक वयस्क जेब्राफिश की पृष्ठीय मांसपेशियों में यौगिकों को वितरित करने के लिए इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन की तकनीक का वर्णन करता है।
Protocol
1. डीएनए वैक्सीन और इलेक्ट्रोपॉरेशन का इंजेक्शन
- इस प्रोटोकॉल के अनुसार प्रतिरक्षण के लिए, स्वस्थ, 6 से 12 महीने पुराने वयस्क जेब्राफिश का उपयोग करें। मछली को 14/10 घंटे के प्रकाश/डार्क साइकिल के साथ फ्लो-थ्रिक सिस्टम में रखें, जिसमें अधिकतम सात मछलियां प्रति 1 एल पानी की होती हैं ।
- मछली को एनेस्थेटाइज करने के लिए टैंक के पानी में 0.02% 3-अमीनोबेन्जिक एसिड एथिल एस्टर (ट्राइकेन) समाधान (पीएच 7) तैयार करें। 10 सेमी पेट्री डिश या कुछ इसी तरह का इस्तेमाल करें।
- स्वच्छ प्रणाली के पानी के 3 एल के साथ एक 5 एल बीकर भरकर एक वसूली टैंक तैयार करें।
- टीकाकरण के दौरान मछली को एक निश्चित स्थिति में रखने के लिए टीकाकरण पैडिंग तैयार करें। 2 से 3 सेमी मोटी स्पंज का 5 x 7 सेमी 2 टुकड़ा लें। एक स्केलपेल ब्लेड या तेज कैंची के साथ स्पंज में एक नाली काटें।
नोट: एक ही टीकाकरण पैडिंग का उपयोग कई प्रयोगों में किया जा सकता है। प्रयोगों के बीच स्पंज को 70% एथिल अल्कोहल में भिगोकर कीटाणुरहित करें और सूखने दें। - सिस्टम के पानी में स्पंज को अच्छी तरह से भिगो दें और स्पंज को पेट्री डिश पर सेट करें।
- टीकाकरण से पहले मछली 24 घंटे तेज करें।
- एनेस्थेटाइज एक ज़ेब्राफिश को पेट्री डिश पर रखकर जिसमें 0.02% ट्राइकेन होता है। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि मछली स्पर्श उत्तेजना का जवाब न दे और जब तक कि गिलों का कोई आंदोलन न हो। एक समय में एक ही मछली को एनेस्थेटाइज करें।
- एक प्लास्टिक चम्मच का उपयोग करके, एनेस्थेटाइज्ड जेब्राफिश को गीले स्पंज पर स्थानांतरित करें और मछली के वेंट्रल साइड को नाली में नीचे सेट करें। सही स्थिति में, सुनिश्चित करें कि मछली के सिर और शरीर के अधिकांश नाली के अंदर हैं और पृष्ठीय पंख और पूंछ नाली से बाहर निकल रहे हैं।
- माइक्रोस्कोप के तहत, माइक्रोमैनीपुलेटर पर एक्स-और वाई-एक्सिस फाइन ट्यूनिंग पहियों का उपयोग करके, जेब्राफिश की पृष्ठीय मांसपेशी के करीब लगभग 45 डिग्री कोण में सुई को ध्यान से रखें।
- पृष्ठीय फिन के सामने तराजू के बिना छोटे स्थान का पता लगाएं, जहां सुई को धक्का देने से बल की मांग नहीं होती है। यदि प्रतिरोध महसूस किया जाता है, तो एक आसन्न स्थान का प्रयास करें। रीढ़, पृष्ठीय पंख, या तराजू को घायल करने से बचें।
नोट: धक्का देते समय अगर सुई झुकती है तो उसे काटकर सुई को थोड़ा छोटा कर लें। - धीरे-धीरे मांसपेशियों में वैक्सीन समाधान इंजेक्ट करने के लिए पैर स्विच का उपयोग करें। माइक्रोस्कोप के माध्यम से इंजेक्शन का निरीक्षण करें: फेनोल लाल दिखाई देता है क्योंकि यह मांसपेशियों के ऊतकों में प्रवेश करता है। यदि आवश्यक हो तो नाड़ी की अवधि को समायोजित करें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, इंजेक्शन के लिए वायवीय पंप के सामने पैनल पर पल्स सर्जक बटन का उपयोग करें। हालांकि, एक रिमोट फुट स्विच का उपयोग 10-टर्न डायल व्हील द्वारा पल्स लंबाई को समायोजित करने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करने की अनुमति देता है। समाधान को बहुत तेजी से इंजेक्ट करने से बचें, क्योंकि इससे अत्यधिक ऊतक क्षति हो सकती है। सुनिश्चित करें कि किसी भी हवा को इंजेक्ट न करें। - इंजेक्शन के तुरंत बाद मछली को इलेक्ट्रोपरेट करें। सुनिश्चित करें कि मछली अभी भी संज्ञाहरण के तहत है। मछली को स्पंज पर रखें और चिमटी-प्रकार के इलेक्ट्रोड के बीच मछली सेट करें, ताकि इंजेक्शन साइट के प्रत्येक तरफ इलेक्ट्रोड स्थित हो। इलेक्ट्रोड चिमटी को बहुत टाइट न दबाएं बल्कि दोनों इलेक्ट्रोड को मछली के संपर्क में रखें।
- छह 40 वी, 50 एमएस दालें देने के लिए इलेक्ट्रोपोरेटर पर स्टार्ट बटन दबाएं।
- धीरे-धीरे मछली को रिकवरी टैंक में स्थानांतरित करें।
- प्रत्येक इलेक्ट्रोपाउरेशन के बाद इलेक्ट्रोड को 70% इथेनॉल के साथ स्वाइप करके साफ करें।
नोट: टीकाकरण के बाद मछली की भलाई पर सावधानी से नजर रखें। 0.04% ट्राइकेन में असुविधा के लक्षण (संज्ञाहरण, गुमराह तैराकी, हांफते से धीमी गति से वसूली) दिखाने वाली किसी भी मछली को इच्छामृत्यु दें। वसूली के बाद, मछली को प्रवाह-थ्रिवर यूनिट में स्थानांतरित करें और इसे सामान्य रूप से खिलाएं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenol red sodium salt | Sigma-Aldrich | 114537-5G | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt) | Sigma | A5040-100g | anestesia and euthanasia solution |
| Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits | BTX Harvard apparatus | BTX 450165 | tweezer type electrodes |
| Aluminosilicate capillaries | Harvard apparatus | 30-0108 | |
| Micromanipulator | Narishige | MA-153 | |
| Microscope | Olympus | ZS61 | |
| ECM Electro Square Porator | BTX Harvard apparatus | BTX ECM 830 | |
| Plastic spoon | |||
| Sponge | |||
| Styrofoam workbench |
