Overview
يصف هذا الفيديو تقنية توصيل المركبات إلى قلب سمك الحمار الوحشي البالغ باستخدام الحقن داخل الصدر.
Protocol
1. إعداد الأسماك للحقن داخل الصدر
- قبض على حمار وحشي الكبار (دانيو rerio) مع شبكة ونقله إلى حل مخدر.
- بعد 1-2 دقيقة، عندما تتوقف الأسماك عن السباحة وتنخفض حركة الأوبركولوم، المس السمك بملعقة بلاستيكية للتأكد من عدم تفاعله مع أي اتصال.
- بسرعة وبعناية نقل الأسماك مع ملعقة في الأخدود من الإسفنج الرطب، مع الجانب البطني حتى. يجب أن يشير رأس السمكة بعيدا عن اليد المهيمنة للمشغل.
2. الميكروينجيكتيون في التامور
- تحت المنظار المجسم ، لاحظ بعناية حركة القلب النابض تحت جلد السمك. تحديد بصريا نقطة الحقن فوق القلب النابض وفي منتصف المثلث المحدد من قبل لوحات البطين (الشكل 1D). أدخل طرف الشعرية بزاوية 30−45 درجة بالنسبة لمحور الجسم (الشكل 1E). تخترق الجلد بلطف مع غيض من الشعيرات الدموية الدقيقة في التامور (الشكل 1C). نقطة الدخول المثلى هي أقرب إلى البطن من الرأس.
ملاحظة: لا تقم بإدخال الشعرية بعمق شديد في الجسم والقلب ، لأن هذا سيسبب إصابة للجهاز. في حالة ثقب القلب ، تملأ الإبرة بالدم بشكل عام. إذا حدث هذا، قم بإزالة الشعرية واستبعاد الأسماك من التجربة. - مرة واحدة الإبرة داخل التامور، والحقن الكامل عن طريق الضغط على دواسة الجهاز microinjector.
ملاحظة: يجب الحرص على عدم حقن الهواء في تجويف الصدر. - بعد الحقن، سحب الشعرية بلطف من الصدر ونقل الأسماك على الفور إلى خزان مع مياه النظام للتعافي.
- مراقبة الأسماك حتى الشفاء التام من التخدير.
- جمع القلب في نقطة الوقت المطلوب وإعداده لمزيد من التحليل.
ملاحظة: في حالة الأسماك لا تستأنف حركة operculum في غضون 30 s، إحياء الأسماك عن طريق الضغط على الماء في الخياشيم مع ماصة بلاستيكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1: الحقن داخل الصدر (IT) في سمك الحمار الوحشي الكبار. (أ) صورة من الشعرية microinjection سحبت مع خيوط (6" ، 1.0 ملم في القطر) وقيم برنامج سحب الإبرة المستخدمة. (ب) صورة من الشعرية microinjection سحبت مع خيوط (6", 1.0 مم في القطر) مليئة 2.5 ميكرولتر من محلول يحتوي على 10٪ الفينول الأحمر. الطرف سحبت من الإبرة هو أقصى طول 7 ملم. (ج) التمثيل التخطيطي لإجراء حقن تكنولوجيا المعلومات. (د) صور فوتوغرافية لإجراء حقن تكنولوجيا المعلومات. وقد تم تعديل هذا الرقم من بيس وآخرين. أرقام في لوحات C و D تتوافق مع نفس الخطوات من الإجراء: (1) يتم وضع الأسماك الجانب البطني حتى على اسفنجة مرطبة. يقع موقع الثقب (النقطة الحمراء في المثلث) في وسط الصدر بالقرب من الخياشيم. (2) اختراق الإبرة في التامور. نقطة حمراء تشير إلى موقع ثقب. (3) يتم رصد الحقن من خلال مراقبة انتشار المحلول الأحمر في تجويف التامور. (ه) نظام حقن تكنولوجيا المعلومات. يجب أن تكون الزاوية بين الشعيرات الدموية بالحقن ومحور الجسم بين 30 و45 درجة لتجنب ثقب القلب. (واو) صور لثوراكس السمك في 1 ساعة بعد حقن تكنولوجيا المعلومات من المجلدات المشار إليها. تشير الأسهم البيضاء إلى الأنسجة الحمراء ، مما قد يشير إلى نزيف داخلي
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
| Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
| Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
| Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 mm x 4.5 mm |
| Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 |
