Overview
וידאו זה מתאר את הטכניקה של אספקת תרכובות לתוך הלב של זברה למבוגרים באמצעות הזרקה תוך-סרטית.
Protocol
1. הכנת הדג להזרקה תוך-תפורתית
- לתפוס דג זברה בוגר(דניו rerio)עם רשת ולהעביר אותו לתוך פתרון הרדמה.
- לאחר 1-2 דקות, כאשר דגים מפסיקים לשחות ואת התנועה של אופרקולום מצטמצם, לגעת בדג עם כף פלסטיק כדי לוודא שהוא אינו מגיב לכל מגע.
- מעבירים במהירות ובזהירות את הדג עם הכף לתוך החריץ של הספוג הרטוב, כשצד הגחון למעלה. ראש הדג צריך להצביע הרחק מהיד הדומיננטית של המפעיל.
2. מיקרו-נדיקציה לתוך קרום הלב
- תחת סטריאומיקרוסקופ, בזהירות להתבונן את התנועה של הלב הפועם מתחת לעור של הדג. קבעו באופן חזותי את נקודת ההזרקה מעל הלב הפועם ובאמצע המשולש שהוגדר על-ידי הלוחות הסחוסיים הגחוניים (איור 1D). הכנס את קצה הנימי בזווית של 30-45° ביחס לציר הגוף (איור 1E). חודרים בעדינות את העור עם קצה המיקרו-קפילארי לתוך קרום הלב (איור 1C). נקודת כניסה אופטימלית קרובה יותר לבטן מאשר לראש.
שים לב: אין להכניס את נימי עמוק מדי לתוך הגוף והלב, כמו זה יגרום לפגיעה באיבר. במקרה של ניקור לב, המחט בדרך כלל מתמלאת בדם. אם זה קורה, להסיר את נימי ולא לכלול את הדגים מהניסוי. - ברגע המחט היא בתוך קרום הלב, הזרקה מלאה על ידי לחיצה על הדוושה של מכשיר microinjector.
שים לב: היזהר לא להזריק אוויר לחלל בית החזה. - לאחר ההזרקה, בעדינות למשוך את נימי מבית החזה ומיד להעביר את הדג לתוך מיכל עם מי מערכת להתאוששות.
- לפקח על הדגים עד התאוששות מוחלטת מהרדמה.
- לאסוף את הלב בנקודת הזמן הרצויה ולהכין אותו לניתוח נוסף.
שים לב: במקרה הדג אינו לחדש את התנועה של האופרקולום בתוך 30 s, להחיות את הדגים על ידי סחיטת מים לתוך הזימים עם פיפטה פלסטיק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1: הזרקת פנים-ת'רקית (IT) בדגי זברה למבוגרים. (א) תצלום של נימי מיקרו-אינג'רטי משוך בקוטר 6 אינץ' 1.0 מ"מ וערכים של תוכנית משיכת המחטים בה נעשה שימוש. (ב) תצלום של נימי microinjection משך עם חוט (6", 1.0 מ"מ קוטר) מלא 2.5 μL של פתרון המכיל 10% פנול אדום. קצה המחט המושך הוא באורך מרבי של 7 מ"מ. (ג) ייצוג סכמטי של הליך הזרקת ה- IT. (ד) תצלומים של הליך הזרקת ה-IT. נתון זה שונה מ- Bise ואח '. המספרים בלוחות C ו- D תואמים לאותם שלבים של ההליך: (1) דגים ממוקמים בצד הגחוני למעלה על ספוג לח. אתר הניקוב (נקודה אדומה במשולש) ממוקם במרכז החזה ליד הזימים. (2) חדירת המחט לתוך קרום הלב. נקודה אדומה מציינת אתר ניקוב. (3) הזרקה מנוטרת על ידי התבוננות בהתפשטות הפתרון האדום בחלל קרום הים. (ה) ערכת הזרקת IT. הזווית בין נימי ההזרקה לציר הגוף צריכה להיות בין 30° ל -45° כדי למנוע ניקוב לב. (ו) תצלומים של בית החזה דגים בשעה אחת לאחר הזרקת IT של כרכים שצוינו. חצים לבנים מצביעים על הרקמה האדמדם, מה שעשוי להצביע על דימום פנימי
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Macroscope (binocular) | M400 | with Apozoom | |
| Micro-injector femtojet | Eppendorf | 5247 0034 77 | |
| Microloaders femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Micropipette glass needles type C | WPI | TW100F-6 | thin-wall capillary |
| Micropipette puller model P-87 | Flaming/Brown | 20081016 | filament box 2.5 mm x 4.5 mm |
| Sponge | any | any | dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm |
| Tricaine (Anestethic) | Sigma | E10521 |
