Iniezione intratoracica: consegna composta al cuore di zebrafish adulto

Overview

Questo video descrive la tecnica di fornire composti nel cuore del pesce zebra adulto utilizzando l'iniezione intratoracica.

Protocol

1. Preparazione del pesce per iniezione intratoracica

1. Prendi un pesce zebra adulto(Danio rerio)con una rete e trasferiscilo nella soluzione anestetica.
2. Dopo 1−2 minuti, quando il pesce smette di nuotare e il movimento dell'opercolo è ridotto, toccare il pesce con un cucchiaio di plastica per assicurarsi che non reagisca ad alcun contatto.
3. Trasferire rapidamente e accuratamente il pesce con il cucchiaio nella scanalatura della spugna bagnata, con lato ventrale verso l'alto. La testa del pesce dovrebbe puntare lontano dalla mano dominante dell'operatore.

2. Microiniezione nel Pericardio

1. Sotto lo stereomicroscopio, osservare attentamente il movimento del cuore pulsante sotto la pelle del pesce. Determinare visivamente il punto di iniezione sopra il cuore pulsante e al centro del triangolo definito dalle placche cartilaginee ventrali (Figura 1D). Inserire la punta del capillare con un angolo di 30−45° rispetto all'asse del corpo (Figura 1E). Penetrare delicatamente nella pelle con la punta del microcapillare nel pericardio (Figura 1C). Un punto di ingresso ottimale è più vicino all'addome che alla testa.
   NOTA: Non inserire il capillare troppo profondamente nel corpo e nel cuore, in quanto ciò causerà lesioni all'organo. In caso di puntura cardiaca, l'ago si riempie generalmente di sangue. In questo caso, rimuovere il capillare ed escludere il pesce dall'esperimento.
2. Una volta che l'ago è all'interno del pericardio, iniezione completa premendo il pedale del dispositivo del microiniettore.
   NOTA: Fare attenzione a non iniettare aria nella cavità toracica.
3. Dopo l'iniezione, ritirare delicatamente il capillare dal torace e trasferire immediatamente il pesce in un serbatoio con acqua di sistema per il recupero.
4. Monitorare il pesce fino al recupero totale dall'anestesia.
5. Raccogli il cuore nel momento desiderato e preparalo per ulteriori analisi.
   NOTA: Nel caso in cui il pesce non riprenda il movimento dell'opercolo entro 30 s, rianimare il pesce stringendo l'acqua nelle branchie con una pipetta di plastica.

Representative Results

Figura 1: Iniezione intratoracica (IT) nel pesce zebra adulto. (A) Fotografia di un capillare di microiniezione tirato con filamento (6", 1,0 mm di diametro) e valori del programma di trazione dell'ago utilizzato. (B) Fotografia di un capillare di microiniezione tirato con filamento (6", 1,0 mm di diametro) riempito con 2,5 μL di soluzione contenente il 10% di rosso fenolo. La punta tirata dell'ago è lunga al massimo 7 mm. (C) Rappresentazione schematica della procedura di iniezione IT. (D) Fotografie della procedura di iniezione IT. Questa cifra è stata modificata da Bise et al. I numeri nei pannelli C e D corrispondono agli stessi passaggi della procedura: (1) il pesce è posizionato sul lato ventrale su una spugna umidificata. Il sito di puntura (punto rosso nel triangolo) si trova al centro del torace vicino alle branchie. (2) Penetrazione dell'ago nel pericardio. Il punto rosso indica il sito di puntura. (3) L'iniezione è monitorata osservando la diffusione della soluzione rossa nella cavità pericardica. (E) Schema di iniezione ittica. L'angolo tra il capillare di iniezione e l'asse del corpo deve essere compreso tra 30° e 45° per evitare la puntura cardiaca. (F) Fotografie di torace di pesce a 1 ora dall'iniezione IT dei volumi indicati. Frecce bianche puntano al tessuto rossastro, che potrebbe indicare sanguinamento interno

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Macroscope (binocular)	M400		with Apozoom
Micro-injector femtojet	Eppendorf	5247 0034 77
Microloaders femtotips	Eppendorf	5242 956.003
Micropipette glass needles type C	WPI	TW100F-6	thin-wall capillary
Micropipette puller model P-87	Flaming/Brown	20081016	filament box 2.5 mm x 4.5 mm
Sponge	any	any	dim. carved sponge 7cm x 3 cm x 1 cm
Tricaine (Anestethic)	Sigma	E10521