Summary
כאן אנו מתארים פולשני שני הפוטונים (2P) הגישה מיקרוסקופיה ללמוד ליקוציט ביות ב שודד את העכבר. אנו דנים בהיבטים הטכניים של ההכנה שלנו רקמות הדמיה ללכת את הקורא דרך בניסוי אופייני הראשונית להגדיר לאוסף ביצוע ונתונים.
Abstract
שני הפוטונים (2P) מיקרוסקופיה היא הדמיה ברזולוציה גבוהה טכניקה הותאם באופן רחב על ידי ביולוגים. הערך של מיקרוסקופיה 2P היא שזה מספק מידע עשיר spatiotemporal לגבי התנהגויות בתוך רקמות תאים שלמים של עכברים חיים. גיוס ליקוציט משחק תפקיד משמעותי בהגנה מפני זיהומים מארח וכאשר מסומנת, יכול לתרום מחלות דלקתיות אוטואימוניות. לימוד גיוס לויקוציטים in vivo מבחינה טכנית מאתגרת מאז התאים עוברים במהירות בתוך כלי הנמצא עמוק בתוך רקמות פיזור אור. עד כה, מחקרי הדמיה intravital ביותר דורשים הכנה כירורגי כדי לחשוף את כלי הדם והרקמות. כדי למנוע נזק לרקמות ודלקת הנגרמת על ידי הניתוח עצמו, כאן, אנחנו מתארים פולשני תא בודד הדמיה הגישה כי ניתן להשתמש כדי ללמוד סחר ליקוציט ב שודד את העכבר הפלנגות. אנו דנים בהיבטים הטכניים של ההכנה שלנו 2P הדמיה ללכת את הקורא דרך בניסוי אופייני הראשונית להגדיר לאוסף ביצוע ונתונים.
Protocol
1. בעלי חיים הכנה:
פרוטוקול זה משתמש הנקבה הבוגרת LysM-eGFP עכברים בוגרים, בהם נויטרופילים מקרופאגים הם שכותרתו fluorescently ידי הביטוי של eGFP 1.
- סימון כלי הדם:
כדי להמחיש את כלי הדם, 15μl הלא ממוקד נקודות קוונטיות (655nm) הם מדולל לתוך μl 100 של PBS ו מוזרק לווריד תוך דקות את העכבר 10-30 לפני הדמיה. - הרדמה:
- מניחים את העכבר בתא אינדוקציה של מערכת הרדמה וטרינרי משאיפת (נובל לרפואה Service, Inc).
- הגדר את מאדה כדי% 3-4 Isoflurane והספק של 100% חמצן גז קצב הזרימה ל ~ 1 L / min. כדי למנוע מינון יתר מקרי הרדמה, לעקוב מקרוב אחר בעלי חיים עד רפלקס אחורי קמצוץ הבוהן הולך לאיבוד.
- הרדמה נשמר 1.5 ~ 2% Isoflurane ו בסדר מכוון במהלך הדמיה כדי למזער את החפצים נשימה לפי הצורך. קצב הנשימה של העכבר הוא במעקב צמוד לאורך כל הפגישה הדמיה כדי להבטיח מטוס נאותה הרדמה.
- משחה Puralube וטרינרי מוחל על העיניים כדי למנוע התייבשות.
- העכבר ממוקם על 36 מעלות צלזיוס מוסדר כרית חימום (Braintree Scientific) במהלך זריקות הדמיה כדי למנוע היפותרמיה.
- כדי למנוע התייבשות, העכבר מקבל 100 μl של PBS sc כל 1-2 שעות.
- מתן גירוי דלקתי לגרום גיוס לויקוציטים:
- מניחים את העכבר על הבמה ניתוח ספוגית שודד דרכים עם אתנול 70%.
- כופף את המחט של מזרק אינסולין ~ 90 מעלות ליד שפוע כדי להקל על הזרקת ולשפר את הדיוק של עומק הלידה.
- טען את המזרק עם 0.5 מיקרוגרם של E.coli bioparticles מדולל 1μl PBS. ניתן לעשות זאת במכסה של צינור microfuge כדי להקל על העומס רביב.
- החזק את הבוהן עם מלקחיים מעוקל להכניס את המחט דרך העור בעדינות עם שפוע פונה כלפי מעלה עד שהוא ממש מתחת לעור.
- הזרק באיטיות ולהחזיק במקום למשך 5 שניות כדי למנוע סומק בחזרה.
2. הדמיה שלב ההתקנה:
פלטפורמת הדמיה מורכבת צלחת אלומיניום עם חור עגול לחתוך למרכז. זכוכית לכסות גדול מודבק בתחתית הצלחת גומי O-Ring מודבק על גבי כדי ליצור תא נוזל חזק הפסקה כדי להכיל את כפה האחורית. צלחת אלומיניום הוא חימם עד 36 ° C באמצעות שני גופי חימום המחוברים העליון של הצלחת.
- הנח את העכבר על שלב טרום חימם את ההדמיה ולשמור על הגוף הליבה של העכבר טמפרטורה באמצעות 36 ° C כרית חימום.
- אבטח את כפה coverglass של חדר הדמיה עם הסרט דקה של דבק מגע.
- שטפו את כפה פעמיים כדי להסיר כל חתיכות צפות של דבק ולאחר מכן למלא את התא עם PBS טרי (מחומם מראש ל -36 ° C).
עכברים ניתן הדמיה של עד 4 שעות ללא המהווים הכדאיות של החיה. כף הרגל ניתן לשחרר בעדינות עם כמות קטנה של אצטון עכברים לתחייה ללימודי הדמיה האורך. עם זאת, במקרה זה, אנו ממליצים על תקופת הדמיה <2 שעות ההמתנה 24-48 שעות בין אימון כדי למזער את הסיכון של הרדמה ממנת יתר או התייבשות.
3. הדמיה רכישה
מיקרוסקופ שני הפוטונים (מיקרוסקופ 2P) משמש פרוטוקול זה שהותקן כפול לייזר וידאו שער המערכת המורכבת מיקרוסקופ זקוף. המערכת מצויד בשתי טי: לייזרים ספיר, ארבעה חזיתית Bi-אלקלי PMTs לרכישות 3 ו -4 סימולטני ערוץ 20x טבילה במים אובייקטיבי (אולימפוס, 20x/0.95 NA).
- Tune XR Chameleon טי: ספיר לייזר (קוהירנט בע"מ) עד 890-900nm.
- שימוש במראות dichroic 480nm ו 560nm (SemRoc) להפריד שלושה ערוצים: כחול (<480 ננומטר, הדור השני אות הרמוני), ירוק (480-560nm, LysM-eGFP נויטרופילים חיובי) ואדום (> 560 ננומטר, נקודה קוונטית כלי הדם שכותרתו ). לחלופין, מסנן 560nm ניתן להחליף מסנן 570nm להבחין E. coli bioparticles (576nm bioparticles יופיעו כתום) מ 655nm נקודות קוונטיות (יופיעו אדום עמוק).
- בזהירות להוריד את המטרה לתוך PBS ולהתמקד כלי של הבוהן.
- עם ההפעלה הרכישה מהירות תמונה בקצב-video (30f/sec) ושימוש אות הרמוני second הנובעות קולגן כציון דרך רקמות, סקר במהירות את הרקמה (במהירות וידאו שער הרכישה) כדי לאתר כלי דם של עניין (אחד עם lysM-eGFP נויטרופילים גלוי).
- התאם את הרווח על PMTs כדי לייעל הפרדת צבעים ולמזער את כמות לייזר הנדרש כדי להשיג אות מספיק על הרקע (להיותלהיזהר לא להרוות את התמונה!).
- ברגע האזור שטח של האינטרסים נמצא, להתחיל זמן לשגות הדמיה. זמן לשגות הדמיה ניתן לבצע עם שתי החלטות הזמני שונים. עבור מתגלגל הדמיה התא הידבקות בזמן אמת בתוך כלי הדם, אנו רוכשים 30f/sec על מטוס-z יחיד. לתיעוד extravasation התא הגירה parenchyma אנו מבצעים הדמיה 3D זמן לשגות. פרוטוקול רכישה טיפוסית תכלול ממוצעים של 15 מסגרות לצעד-Z כל רכישת 21 2.5μm רציפים Z-צעדים בהיקף של 200-225 50μm ב 30 מרווחי שניות.
- לאחר קבצי הנתונים מאוחסנים בשרת המעבדה, תוכנה או Imaris Volocity ניתן להשתמש כדי לבצע רב מימדי עיבוד התא מעקב 2, 3.
4. נציג תוצאות
1.Real בזמן (30f/sec) מדמיינת של נויטרופילים מתגלגל לאורך כלי ב 200x. זמן לשגות הדמיה מראה נויטרופילים, בירוק, מתגלגלים לאורך האנדותל של כלי הדם על 10mins לאחר זיהום חיידקי ליסטריה עם, באדום. סיבי הקולגן ברקמת החיבור מופיעים בכחול. אנא לחץ כאן כדי לראות את הסרטון.
2.Time לשגות 3D הדמיה של דינמיקה נויטרופילים גיוס 200x. גיוס נויטרופילים אופיינית מהמחזור והגירה דרך רקמה דלקתית מוצג. אנא לחץ כאן כדי לראות את הסרטון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול הווידאו הזאת אנחנו מדגימים את ההליכים עבור הדמיה בלתי פולשנית 2P גיוס לויקוציטים בתגובה לדלקת.
שודד הוא אתר קלאסי פיזיולוגיים לחקר דלקת כגון מחלה, אלרגיה דלקת אוטואימונית 4-7. 2P הדמיה מספק תמונה מפורטת של צעדים ברורים מסלולים סחר ליקוציט, החל מתגלגל הידבקות של כלי הדם כדי chemotaxis לאתרים של הפונקציה מפעיל. מצאנו כי הגיוס ליקוציט משתנה בתגובה סוגים שונים של גירויים דלקתיים. המינון של הגירוי יש לבחור בקפידה כל ניסיון עשוי לשחזר עלבון פיזיולוגיים. אם המינון גבוה מדי או נמסר לאתר הלא פיזיולוגי, הגירוי יכול להכריע את המארח או להוביל ממצאים ניסיוניים לייצר תופעות חריגות. אנו ממליצים על מינונים טיטרציה של גירויים לניסויים טייס לזווג עם שלט מתאים באמצעות מחט התכופף כדי להגדיל את הדיוק של נפח הן נמסר ועומק הזרקה. הוא גם חיוני כי האתר של הזרקה ניתן לאתר בקלות, במיוחד עבור ניסויי הדמיה סדרתי. ניתן להשיג זאת על ידי הזרקת במיקום מסוים (כלומר, השני על ספרה השלישי של בוהן רגלו האחורית מימין) או על ידי קעקוע העור הזרקת הסמוך.
2P הדמיה מספק הזדמנות ייחודית לדמיין סחר ליקוציט ותפקוד מפעיל in vivo. רוב הדמיה intravital גישות בשימוש ללמוד גיוס לויקוציטים דורשים ניתוח לחשוף את רקמות כלי הדם בעכברים מורדמים 8-10. הניתוח עצמו גורם לדלקת אשר ישפיעו התנהגות ליקוציט. עם זאת, 2P הדמיה מאפשר leukocytes להיחקר הלא פולשני, ברזולוציה תא יחיד עמוק בתוך הסביבה רקמות יליד 3D. יתר על כן, מאז ההליך הדמיה עצמו אינו פוגע העכבר, הוא בחירה מצוינת עבור ביצוע מחקרים ארוכי טווח עבור דגמים של סרטן ודלקת פרקים. 2P הדמיה יש את הפוטנציאל לספק ולהציג חסר תקדים של תהליך המחלה תחילת המחלה התקדמות לפתרון, בתוך כל נושא בעל חיים בודדים. גישה זו היא כלי רב ערך להשגת תובנה מנגנוני תאית ומולקולרית העומדים בבסיס החסינות הסלולר לזיהום וכיצד התגובות הללו זהה, אם מוסדר כראוי, עלולה לגרום מחלות דלקתיות אוטואימוניות. בסופו של דבר, תמונה מפורטת של התנהגות ליקוציט in vivo יהיה לסייע בפיתוח של הרפוי חדשה לטיפול במחלות דלקתיות זיהומיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל הניסויים בוצעו על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת מחקרים בבעלי חיים של אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק R01-3155-53502 ו-אוניברסיטת וושינגטון פייזר הסכם Biomedical Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | |
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles | Invitrogen | E2862 | |
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | ||
| Quick gel | Duro | ||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Insulin syringes | BD Biosciences | 08290-3284-38 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30256.02 |
References
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Zinselmeyer, B. H., Lynch, J. N., Zhang, X., Aoshi, T., Miller, M. J. Video-rate two-photon imaging of mouse footpad - a promising model for studying leukocyte recruitment dynamics during inflammation. Inflamm Res. 57, 93-96 (2008).
- Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. Chapter 16. Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics. Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).
- Gray, D. F., Jennings, P. A.
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77, 5190-5201 (2009).
- Smith, C. J., Zhang, Y., Koboldt, C. M., Muhammad, J., Zweifel, B. S., Shaffer, A., Talley, J. J., Masferrer, J. L., Seibert, K., Isakson, P. C.
- Wipke, B. T., Allen, P. M. Essential role of neutrophils in the initiation and progression of a murine model of rheumatoid arthritis. J Immunol. 167, 1601-1608 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. in vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2604-2609 (2003).
