Summary
هذا الفيديو يبين كيف للحث على التهاب النخامية في الفئران SJL الذاتية وكيفية تقييم شدة من خلال التشريح.
Abstract
ويمكن استنساخ التجربة الذاتية التهاب النخامية بواسطة حقن بروتينات النخامية مختلطة مع مساعد في الفئران المعرضة 1. نماذج الماوس تسمح لنا لدراسة كيفية تتكشف الأمراض ، وتوفير كثير من الأحيان نسخة جيدة من نفس العمليات التي تحدث لدى البشر. بالنسبة لبعض أمراض المناعة الذاتية ، مثل مرض السكري نوع 1A ، وهناك نماذج (الماوس NOD) التي تتطور بشكل عفوي مرض مماثل لنظيره الإنسان. لكثير من الأمراض المناعية الأخرى ، ومع ذلك فإن هذا النموذج يحتاج إلى أن يكون ذلك حافزا تجريبيا. هناك نهج مشترك في هذا الصدد هو لحقن الفأر مع مستضد المهيمنة المستمدة من الهيئة التي تجري دراستها. على سبيل المثال ، والمحققين مهتمون الدرقية الذاتية حقن الفئران مع ثايروجلوبولين 2 ، والمهتمين في الوهن العضلي الشديد ضخها مع مستقبلات أستيل 3. إذا لم تعرف مستضد ذاتي لمرض مناعي ذاتي خاص ، محققين حقن البروتين استخراج الخام من الجهاز المستهدف من رد فعل المناعة الذاتية. التهاب النخامية عن المناعة الذاتية ، والممرضة مستضد ذاتي (ق) لا يزال يتعين تحديدها 4 ، وبالتالي يتم استخدام البروتين الخام إعداد النخامية. في هذه المقالة الفيديو نظهر كيف للحث على التهاب النخامية الذاتية التجريبية في الفئران SJL.
Protocol
البروتوكول التجريبي
مرة واحدة مستعدة مستمنع النخامية (انظر المادة الرفيق) ، يتم حقنه تحت الجلد في الفئران SJL (ومختبرات جاكسون ، منظر 000686). يتم تكرار الحقن مطابقة أخرى بعد 7 أيام. ثم يتم استخدام الفئران لجمع المجراة ونتائج تشريح الجثة.
الخطوة 1. الحقن تحت الجلد من الغدة النخامية في الفئران مستمنع SJL
الفئران هي أول من حقن تخدير 0.5 مل من 20 ملغ / مل ، 2،2،2 ثلاثي بروم إيثانول (آفيرتين ، جزر تركس وكايكوس الأمريكية ، T - 1420) intraperitoneally. ثم يتم حقن الفئران تحت الجلد مع 100 ميكرولتر من مستحلب النخامية ، كما هو مبين في المادة 2181 إن الرب الرفيق ، ويحتوي على 1 ملغ من مستخلص الغدة النخامية و 0.25 ملغ من المواد المساعدة فرويند الكامل ل. يتم حقن مستحلب في المنطقة الظهرية اليسار الساق الخلفية ((50 ميكرولتر) والمنطقة الأربية الحق (50 ميكرولتر). يحقن مستحلب النخامية مرة أخرى في يوم 7 الى مواقع قبالة (50 ميكرولتر في حق المنطقة الظهرية والساق الخلفية ويتم رصد 50 ميكرولتر في المنطقة الأربية اليسار). الفئران يوميا خلال أول 3 أيام والأسبوعية ذلك الحين وحتى اليوم من التضحية ، والذي هو عادة 28 يوما بعد التحصين الأول.
الخطوة 2. مجموعة من نتائج في الجسم الحي : فحوصات الدم
النسيج الأكثر شيوعا لتقييم نتائج التجارب على الفئران في حين لا تزال على قيد الحياة والدم. ويوجه عادة في الدم بعد 14 يوما من التحصين الأول لقياس مستويات الأجسام المضادة في الدم من الغدة النخامية أو علامات أخرى مثل السيتوكينات وchemokines.
ويتم جمع الدم من الفئران الحية على النحو التالي. وتعقد الفئران بشكل آمن من قبل القفا من الرقبة ، ويقع في الجزء الخلفي من عظم الفك. مرة واحدة تقع في الجزء الخلفي من عظم الفك ، تستخدم المشارط 4 ملم لاختراق حزمة تحت الفك الأوعية الدموية. بعد جمع الدم ، والضغط على مكان في المنطقة باستخدام مسحة الكحول لتجنب حدوث ورم دموي. يتم طرد الدم التي تم جمعها في 2000 ز لمدة 20 دقيقة ، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها.
الخطوة 3. جمع نتائج تشريح الجثة : النخامية الهيستوباثولوجيا
عادة ما يتم التضحية الفئران بعد 28 يوما من التحصين الأول. الميزة الأساسية اللازمة لإنشاء تشخيص EAH هو تسلل من قبل خلايا الغدة النخامية وحيدة النواة المكونة للدم.
يصرح باستخدامها في الفئران عن طريق وضعها في غرفة مغلقة البلاستيكية التي يتم perfused مع CO 2. وتحفظ في غرفة الفئران لما مجموعه 8 دقائق. بعد القتل الرحيم ، ويتم جمع الغدة النخامية كما هو موضح في مقالة الرفيق. والغدة النخامية المريضة يظهر تورم وأكثر تمسكا راسخا لجافية المحيطة بها. يتم استخدام الملقط حادة لتخفيف السحايا المحيطة النخامية. حالما يتم اغتنامها يتحرك بحرية في الغدة النخامية العظم الوتدي ، واحدة من نهاية الغدة النخامية مع ملقط ورفع بعناية الغدة النخامية. ثم وضعت في أنبوب الغدة microcentrifuge تحتوي على 5 في Beckstead مثبت. يتم إصلاح الغدة النخامية بين عشية وضحاها ، ملفوفة في ورقة العدسة ، ووضعها في الكاسيت. ثم تتم معالجة الغدد باستخدام بروتوكول التالية :
| المحطة رقم | الكاشف | الوقت بالدقائق | درجة الحرارة (مئوية) |
| 1 | 70 ٪ كحول | 5 | 25 |
| 2 | 70 ٪ كحول | 15 | 25 |
| 3 | 95 ٪ كحول | 15 | 25 |
| 4 | 95 ٪ كحول | 15 | 25 |
| 5 | الكحول 100 ٪ | 15 | 25 |
| 6 | الكحول 100 ٪ | 7.5 | 25 |
| 7 | الكحول 100 ٪ | 7.5 | 25 |
| 8 | الزيلين | 20 | 25 |
| 9 | الزيلين | 20 | 25 |
| 10 | الزيلين | 25 | |
| 11 | البارافين | 30 | 58 |
| 12 | البارافين | 5 | 58 |
| 13 | البارافين | 5 | 58 |
بعد المعالجة ، هي جزء لا يتجزأ الغدد النخامية في البارافين وخفض ما لا يقل عن 5 أقسام nonconsecutive (5 ميكرون سميكة) من كل غدة. بعد sectioning ، ملطخة الغدد مع الهيماتوكسيلين ويوزين ، وتحليلها لتحديد تسلل وحيدات النوى. يتم تحديد المقطع مع تسلل أشد لتصحيحها. يتم تسجيل شدة استنادا إلى تقدير موضوعي لمدى استبدال الغدة النخامية الأمامية أو تدمير الخلايا المناعية : الصف 0 ، أي مرض ؛ الصف 1 ، 2 ٪ -20 ٪ تورط ؛ الصف 2 ، 20 ٪ -30 ٪ ، الصف 3 ، 30 ٪ -50 ٪ ، الصف 4 ، 50 ٪ -90 ٪ ؛ الصف 5 ، نسبة تفوق 90 ٪. يتم تسجيل جميع المقاطع من قبل اثنين من أفراد أعمى إلى مصدر من المقاطع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد تم الإبلاغ عن أربع تقنيات للحث على التهاب النخامية في حيوانات التجارب. تقنية الموضحة في هذه المقالة ، وهذا هو حقن بروتينات النخامية مختلطة مع مساعد فرويند ثانية ، هو أقدم واحد ، يرجع تاريخها إلى عام 1967 6 ، وتحسنت في الآونة الأخيرة 1. تقنيات أخرى هي حقن ذوبان جليكوبروتينات فيروس الحصبة الألمانية في عام 1992 7 ، حقن المجسم لاتش مباشرة في الغدة النخامية في عام 2002 8 ، وزرع الغدد النخامية من سلالة فئران واحدة تحت كبسولة الكلى من سلالة أخرى الفئران في 2010 9 . والميزة الرئيسية للنهج فرويند ليالي المساعد هو أنه أقل الغازية ، وأكثر اتساقا ، وقبل كل شيء ، أكثر دقة في إحداث المرض الذي يشبه نظيره في الإنسان. تقنية الموضحة في هذه المقالة الفيديو غلة نموذج يمكن استنساخه من التهاب النخامية ، والتي يمكن استخدامها من قبل المحققين لتحسين فهمنا لهذا المرض رائعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DK080351 إلى الكمبيوتر ، وهدية سخية من تيري وكريستين لعائلة آل غور.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SJL mice (The Jackson Laboratories) | stock 000686 | ||
| 2,2,2-Tribrom–thanol (Avertin) | TCI America | T-1420 | |
| Beckstead’s fixative |
References
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. , (2008).
- Twarog, F. J., Rose, N. R. The production of thyroid autoantibodies in mice. J Immunol. 101, 242-2450 (1968).
- Patrick, J., Lindstrom, J. Autoimmune response to acetylcholine receptor. Science. 180, 871-872 (1973).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
- Beckstead, J. H. A simple technique for preservation of fixation-sensitive antigens in paraffin-embedded tissues: addendum. J Histochem Cytochem. 43, 345-345 (1995).
- Levine, S. Allergic adenophypophysitis: new experimental disease of the pituitary gland. Science. 158, 1190-1191 (1967).
- Yoon, J. W., Choi, D. S., Liang, H. C., Baek, H. S., Ko, I. Y., Jun, H. S., Gillam, S. Induction of an organ-specific autoimmune disease, lymphocytic hypophysitis, in hamsters by recombinant rubella virus glycoprotein and prevention of disease by neonatal thymectomy. Journal of Virology. 66, 1210-1214 (1992).
- Davis, J. R., McMahon, R. F., Lowenstein, P. R., Castro, M. G., Lincoln, G. A., McNeilly, A. S. Adenovirus-mediated gene transfer in the ovine pituitary gland is associated with hypophysitis. J Endocrinol. 173, 265-271 (2002).
- Rotondo, F., Quintanar-Stephano, A., Asa, S. L., Lombardero, M., Berczi, I., Scheithauer, B. W., Horvath, E., Kovacs, K.
