Summary
Infektion av möss med ett adenovirus som uttrycker den viktigaste humana autoantigen cytokrom P450 2D6 (hCYP2D6) som erkänns av sera från patienter som lider av typ 2 autoimmun hepatit resulterar i en ihållande form av autoimmun-medierad leversjukdom som kännetecknas av omfattande hepatit, fibros och generering av en CYP2D6 -specifikt immunsvar.
Abstract
Autoimmun hepatit är en sällsynt men livshotande autoimmun sjukdom i levern av okänd etiologi 1,2. I de senaste många försök har gjorts för för att generera en djurmodell som återspeglar egenskaperna hos den mänskliga sjukdomen 3-5. Men i olika modeller induktion av sjukdomen var ganska komplex och ofta hepatit var bara övergående 3-5. Därför, har vi utvecklat en rättfram mus modell som använder det huvudsakliga humana autoantigen i typ 2 autoimmun hepatit (AIH-2), nämligen hCYP2D6, såsom en avtryckare 6. Typ 1 lever-njur-mikrosomala antikroppar (LKM-1)-antikroppar som känner igen hCYP2D6 är kännetecknande för AIH-2 7,8. Leverans av hCYP2D6 till vildtyp FVB eller C57BL / 6 möss var av en Adenovirus konstruktion (Ad-2D6) som garanterar en direkt leverans av utlösande antigenet till levern. Således genererar efterföljande lokal inflammation en bördig fält 9 för den efterföljande utvecklingen av autoimmunitet. En Combination av intravenös och intraperitoneal injektion av Ad-2D6 är den mest effektiva vägen för att inducera en långvarig autoimmun skada på levern (avsnitt 1). Här erbjuder vi ett detaljerat protokoll för hur autoimmun leversjukdom induceras i CYP2D6-modellen och hur de olika aspekterna av leverskada kan bedömas. Först serumnivåerna av markörer som visar hepatocyter förstörelse, såsom aminotransferaser, liksom titrarna av hCYP2D6 antikroppar bestämmas genom provtagning av blod retroorbitaly (avsnitt 2). Det andra anbringas det hCYP2D6-specifik T cellsvar som kännetecknas genom att samla in lymfocyter från mjälten och levern. För att få rena lever lymfocyter är levern perfusion av PBS via portalen ven (avsnitt 3), kokas i kollagen och renas över en Percoll gradient (avsnitt 4). Frekvensen av hCYP2D6-specifika T-celler analyseras av stimulering med hCYP2D6 peptider och identifiering av IFNy-producerande celler med flödescytometri (avsnitt 5). Tredje,cellulär infiltration och fibros bestäms av immunohistokemi av lever avsnitt (avsnitt 6). En sådan analys regimen måste utföras vid flera gånger efter initiering av sjukdomen i syfte att bevisa kroniska natur av modellen. Den magnitud av immunsvaret kännetecknas av den frekvensen och aktiviteten av hCYP2D6-specifika T och / eller celler B-och den grad av den leverskada och fibros ha som skall bedömas för en efterföljande utvärdering av möjliga behandlingar för att förhindra, försena eller upphäva de berörda autodestructive processen av levern.
Protocol
1. Intravenös injektion av Ad-2D6 i oftalmiska sinus
- Under sterila förhållanden, späd Ad-2D6-lösning virus lager till en koncentration av 5 x 10 9 pfu / ml i RPMI och hålla Ad-2D6 virus lösningen på is. Injektion av två doser av 5 x 10 8 pfu (intravenös och intraperitoneal) har visat för att resultera i den mest tillförlitliga utfallet av autoimmun hepatit i möss av den FVB-stammen.
- Bedöva mus med 4% isofluran i en narkos kammare. Kläm ihop bakbenet för att kontrollera att djuret bedövas.
- Håll musen genom nacken och dra den lösa huden på huvudet med tummen och långfingret. Så här, skjuter ut ögat en aning genom att den dragkraft till huden intilliggande till ögat.
- Placera nålen vertikalt i den mediala cantus (korsningen av ögonlock närmast djurets näsa) och injicera långsamt 100 ^ Ad-2D6 virus lösning. Det är viktigt att inte använda för mycket tryck,att undvika skador på fartyg och luftstrupe.
- Långsamt ut kanylen för att undvika spill och stänga ögonlocken.
- Injektion fungerade bra om viruset lösningen icke läcker ut tråget den näsan och ögat glider tillbaka till dess initiala position.
- Omedelbart efter intravenös injektion, utför en standard intraperitoneal injektion av den andra 100 pl av Ad-2D6 virus lösning.
Alternativt, kan den intravenösa injektionen skall exekveras via svansvenen. Emellertid är injektion via oftalmiska sinus mycket lättare att utföra och minimerar förlusten av virus lösning. Det har visats att dessa två tekniker kan användas omväxlande och att båda rutter är lika effektiva 10.
Infekterade möss övervakas för biverkningar och uppenbara tecken på lidande och smärta, såsom minskad aptit, viktminskning, minskad rörlighet, inte brudgummen, grov päls, böjdutseende, såväl som slickar, biter, repor eller skaka ett visst område (dvs. injektionsstället). Även om mössen uppvisar en massiv skada på levern i CYP2D6-modellen, mössen verkar friska och visar inga tecken på lidande, smärta eller stress. Ändå är indikatorer på allvarlig leversvikt, såsom serum aminotransferaser fastställs på ett regelbundet eller är en del av de utförda experimenten. Serum aminotransferasnivåerna på> 1000 U / l bör endast visas som en direkt följd av virusinfektion, men inte kroniskt. Om serum aminotransferasnivåerna är kroniskt över 1000 U / l (svårighetsgrad gräns) är mössen offras.
2. Mus-öga blödning
- Bedöva mus med 4% isofluran i en narkos kammare. Kläm ihop bakbenet för att kontrollera att djuret bedövas.
- Håll musen genom nacken och dra den lösa huden på huvudet med tummen och långfingret. Så här, sticker ögat något genomden dragkraft till huden intilliggande till ögat.
- Placera toppen av kapillärröret i nedre eller inre ögonvrån och försiktigt men bestämt gled längs ögongloben till oftalmiska venösa sinus. Den venösa kapillärer brister och den resulterande blödning fyller ögonhålan.
- En aning dra tillbaka det kapillärröret för att befria spetsen så att den ansamlade blod sugs in i röret.
- När tillräckligt med blod uppsamlas, är röret återkallas och ögonlocken stängda. Blödning stannar vid tillbakadragande av röret och återupprättandet av normala okulärt tryck på venösa komplex.
- Blod i kapillärröret överföres till en Microtainer tub och inkuberades under 30 min på is.
- Den Microtainer Röret centrifugeras vid 7500 xg under 2 min vid 4 ° C.
- Den överstående motsvarar den serumet, som överföres till ett färskt rör och lagrades vid -80 ° C.
- Serumet kan användas för att bestämma antikropp-titer genom ELISA. IndicaTors på leverskada såsom i serum leverenzymer alaninaminotransferas (ALAT / GPT) och aspartataminotransferas (ASAT / GOT) kan bedömas med hjälp av de enligt testremsorna från Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland) och en Reflotron Plus analysator ( Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland).
Alternativt kan blodprovstagning göras via svansvenen eller via ytliga temporala venen 11.
3. Mus-leverperfusion
Anmärkning: Detta steg är viktigt för att undvika en kontaminering av isolerade lever lymfocyter genom blodlymfocyter
- Euthanize musen, genom att dödliga doser av CO-2 följda av cervikal dislokation.
- Montera djuret om på rygg på frigolit ombord. Använd 23 G nålar till stift extremiteter.
- Moisturize och desinficera på musen med 70% EtOH
- Ca 1 cm avstånd från bakbenen, gör ett snitt genomhuden och den muskeln skiktet. Skära på båda sidor av det djur som arbetar upp till den diafragman.
- När membranet är nådd den huden kan vändas baklänges.
- Skär membranet bort från sliter skär den sedan i vena cava.
- Flytta den magen och tarmarna iväg till den sida, vilket exponerar den portala venen.
- I den portvenen skäret en 27 G nål ansluten till en 5 ml spruta fylld med kall PBS. Låt den PBS-långsamt tvätta det blod ut ur den levern.
- Dissekera levern genom att ta tag in på diafragman och skärning den diafragman bort från kroppen.
- Överföra det levern för att en petriskål och ta bort den diafragman, den gallblåsan och varje annan vävnad ansluten fortfarande till levern
- Överföra det levern att 10 ml PBS i ett 50 ml rör på is eller bädda in i OCT-förening.
4. Isolering av lever lymfocyter
- Framställa följande stamlösningar:
- Kollagenas IV lager (100 mg / ml) in PBS-. (Går att små alikvoter och lagra vid -20 ° C).
- DNas beståndet (25 mg / ml) i PBS. (Går att små alikvoter och lagra vid -20 ° C).
- Kollagenas buffert: PBS innehållande 0,2 mg / ml kollagenas IV-, 0,02 mg / ml DNas och 5% FCS; för 1 levern, blanda 9,5 ml is-kall PBS, 20 | il kollagenas IV-(100 mg / ml lump), 8 | il DNas ( 25 mg / ml förrådslösning), och 500 | il värme-inaktiverat FCS.
- 35% Percoll, blanda 175 ml Percoll, 20 ml 10 x PBS materiel, 305 ml PBS.
- RPMI fullständigt = RPMI innehållande 10% värme-inaktiverat FCS, 100 μ / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin.
- Överföra den perfunderade levern (se avsnitt 3) för att 10 ml av färsk PBS i en petriskål på is och skärs i små bitar med hjälp av sax.
- Överföra in i en 70 | im cellfilter och squeeze junks leverförändringar igenom med ett glas mortelstöt eller en mortelstöt från en 2 ml spruta. Tillsätt försiktigt 10 ml kall kollagenas buffert ochtrycker på igenom sil. Samla fjädring och filtrera genom sil två gånger mer.
- Överföra suspension till att färskt 50 ml röret på is. Process nästa lever.
- Inkubera suspensionen levern-cell vid 37 ° C under 60 min, blanda försiktigt var 15 min.
- Centrifugera vid 30 xg under 3 min vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till ett nytt rör och lämnar 5 mm vätskan över pellet
- Centrifugera vid 650 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten och lämnar 3 mm över pellet
- Återsuspendera pelleten i 20 ml PercoU-buffert
- Centrifugera vid 600 xg under 20 min vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten genom att snärta på röret.
- Tvätta pelleten 1 x med PBS.
- Tvätta pelleten 1 x med RPMI komplett
- Återsuspendera pelleten i 3 ml RPMI fylla i och räkna celler i en 1:10 utspädning.
- Återsuspendera celler vid ~ 10 7-celler / ml i RPMI fylla i och överföra tub till is. 5. Intracellulär cytokin färgning (ICCS)
- Förbereda leverförändringar lymfocyter vid ~ 10 7-celler per ml i RPMI fullständig som beskrivits. Plattan 100 xl (10 6 celler) / en bra bit in en platt 96-brunnars platta vilken inte är vävnads-kulturen behandlad.
- Lägga till 50 | il RPMI-slutföra innehållande 2μg/ml Brefeldin A och sedan lägga till 50 | il RPMI fullständigt innehållande 2 | ig / ml stimulerande CYP2D6-peptid (dvs. de immundominanta CD4-epitop CYP2D6-41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 eller den immundominanta CD8-epitopen CYP2D6-193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). Blanda genom pipettering.
- Inkubera i 5 h vid 37 ° C (optimal stimulering tid men inkubation över natten fungerar som väl).
- Framställa följande stamlösningar:
- FACS-buffert: PBS innehållande 1% fetalt kalv arerum (FCS).
- Fixation / Permeabilisering buffert: FACS--buffert innehållande 0,1% saponin och 4% paraformaldehyd
- FACS-/ saponin tvättbuffert: FACS--buffert innehållande 0,1% saponin
- FACS-/ PFA-buffert: FACS--buffert innehållande 1% paraformaldehyd (PFA)
- Överföra celler in i V-botten mikrotiterplatta (96-brunn) och snurra vid 460 xg under 3 min vid 4 ° C. Kasta medium och skaka plattan
- Tillsätt 150 | il FACS-buffert och centrifugera vid 460 xg under 3 min vid 4 ° C. Kasta medium och vortex platta. Upprepa tvätta steget.
- -Blocket yta-FcR om så är nödvändigt (när du använder sekundära antikroppar) med 1 | ig / ml αCD16/32 cocktail (FcR-blocket) i FACS-buffert under 15 min vid 4 ° C och tvätta 2 x med 150 | il-färgning-buffert (460 xg i 2 min vid 4 ° C).
- Färga för ytmolekyler: dvs. Anti-CD8a-FITC--mAb 10 | ig / ml i 50 | il FACS--buffert under 30 min vid 4 ° C i mörker.
- Lägga till 100 | il FACS-buffert och spinn vid 460 xg under 3 min vid 4 ° C.
- Tvätta celler 2 x med 150 | il FACS-buffert (460 OOOxg; 3 min; 4 ° C). Vortex platta.
- Fixera / permeabilisera-celler med 100 | il fixering / permeabilisering-buffert under 10 min vid RT.
- Snurra vid 460 xg under 7 min vid 4 ° C. Notera att det är viktigt att utsträcka centrifugering med tid att 7 min, eftersom det att upptagningen / permeabilzation stegen förändrar den totala densiteten av cellerna. Vortex platta.
- Tvätta 2 x med 150 | il FACS-/ saponinen tvättbuffert (460 OOOxg; 7 min; 4 ° C). Vortex platta.
- Färga för intracellulära molekyler: dvs. Anti-IFNy-PE--mAb 10 | ig / ml i 50 pl FACS-/ saponinen tvätt buffertsubstanser för 30 min vid 4 ° C.
- Tillsätt till 100 | il FACS-/ saponinen tvätt buffertfonder och spin vid 460 xg under 7 min vid 4 ° C.
- Tvätta celler 2 x med 150 | il FACS-/ saponinen tvättbuffert (460 OOOxg; 7 min; 4 ° C). Vortex platta.
- Tvätta celler 1 x med FACS-buffert (460 OOOxg; 7 min; 4 ° C). Vortex platta. Återsuspendera cellerna i 200 ul FACS / PFA buffert, överföring till rör, och förvara vid 4 ° C i mörker tills förvärvet av data flödescytometri. Vi använder normalt en FACSCanto II eller en FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland).
- Harvest lever, sänk ned i Tissue-Tek oktober i en engångs basform och snabb-frysning på torr is.
- Skär 7 jim sektioner levern vävnad med hjälp av en Leica kryostat inställd på -17 ° C och montera vävnadssnitten på SuperFrost Plus objektglas. Butikschefer objektglasen vid -20 ° C tills vidare användning.
- Fix kryosnitt i förskolan kyld EtOH under 15 min vid -20 ° C. Låt torka i 10 min.
- Tvätta 2 x i destillerat vatten under 2 minuter vid rumstemperatur (Följande steg, 6.1.5 - 6.1.13, utförs vid rumstemperatur).
- Fläcka i Meyer: s Hematoxylin lösning för8 min.
- Tvätta i varmt (30 ° C) kranvatten under 10 min. Ändra vatten flera gånger.
- Skölj i destillerat vatten.
- Skölj i 95% EtOH under 20 sek.
- Motfärga i Eosin G / Y lösning för 40 sek.
- Torka 2 x i 95% EtOH under 5 min per inkubation.
- Dehydratisera 2 x i 100% EtOH under 5 min per inkubation.
- Tydligt i xylen 2 x för 5 min per clearing.
- Montera i Roti-Histokitt.
- Harvest lever, fördjupa sig i Tissue-Tek oktober i en engångstyp bas gjutform och snabb-frysning på torr is.
- Skär 7 jim sektioner levern vävnad med hjälp av en Leica kryostat inställd på -17 ° C och montera vävnadssnitten på SuperFrost Plus objektglas. Butikschefer objektglasen vid -20 ° C tills vidare användning.
- Fixa kryosnitt i kallt EtOH under 15 min vid -20 ° C. Låt torka i 10 min.
- Tvätta 2 x i PBS under 2 min vid rumstemperatur. <li> Inkubera i PBS innehållande 0,3% H 2 O-2 och 0,1% Na--azid för 10 min vid rumstemperatur.
- Tvätta 2 x i PBS under 2 min vid rumstemperatur.
- Blockera med en avidin-biotin-blockerande kit enligt den tillverkarens riktlinjer.
- Blockera med 10% FCS i PBS (FCS / PBS) under 30 min vid rumstemperatur.
- Den primära antikroppen är en kanin-anti-mus-kollagen I-antikropp som spädes 1:200 i 10% FCS / PBS-. Inkubera avsnitt med sammanlagt primär antikropp under 2 h vid rumstemperatur.
- Tvätta sektioner 3 x i PBS under 4 min vid rumstemperatur.
- Späda ut biotinylerad anti-kanin-antikropp till 1:500 och inkubera över med de sektioner för 1,5 h vid rumstemperatur.
- Tvätta sektioner 3 x i PBS under 4 min vid rumstemperatur.
- Färg reaktion erhålls genom sekventiell inkubation med avidin-peroxidas-konjugat och diaminobensidin-väteperoxid enligt den tillverkarens riktlinjer.
- Motfärga i Meyer: s Hanmatoxylin lösning för 5 min, tvätta 2 x i PBS under 2 min vid rumstemperatur och montera i Aquatex.
5,1 Stimulering:
5,2. Färgning:
6. Immunohistokemi
6,1. H & E färgning för bedömning av allmän lever patologi:
6,2. Immunohistokemi för kollagen I deposition:
7. Representativa Resultat
Infektion av möss med Ad-2D6-inducerade två distinkta stadier av leverskada. Under de första dagarna efter infektion orsakar virusinfektion i levern en akut ökning av serum aminotransferasnivåerna, en indikator på hepatocyterna döden 6. Det här 1:e, akuta stadiet inträffar är oberoende av den expressionen av hCYP2D6 och kan också iakttas efter infektion med en tomt-kontroll-virus (Ad-Kontroll) eller en-virus som uttrycker grön fluorescens-protein (Ad-GFP-). I kontrast, är det andra skedet autoimmun-medierad och beroende av den uttrycket av den utlösande-molekylen hCYP2D6. Detta autoimmun steg sker inom 2-4 veckor efter infektion och kvarstår i flera månader 6.
Följande funktioner är karakteristiska för långlivade autoimmun hepatit utvecklas efter Ad-2D6-infektion av vildtyp FVB eller C57BL / 6 möss i CYP2D6-modellen: För det första visar levern en avvikande förändrats morfologi. I synnerhet levern loberna smält, hyperplasiska knölar visas spridda över hela levern och en massiv kapselfibros är synlig (figur 2).
Siffra 2. Lever morfologi. Typisk Ad-2D6-inducerad leverskada upptäcks som vid vecka 4 efter infektion. Notera att de individuella leverförändringar loberna är fuserade (pilspetsar). Hyperplasiska noduler verkar ha spridda öfver hela levern (pilar). Infektion med en-kontroll adenovirus som inte uttryckande hCYP2D6 har ingen effekt på levern morfologi.
Andra, omfattande och ihållande cellulära infiltrationer visas i peri-portalen och parenkymal regionerna i levern hos Ad-2D6-infekterade men inte Ad-Control-infekterade möss (figur 3A). Fibros utvecklar övervägande i det subkapsulära-regionen med några kollagenknippen utstickande in i den parenkymet (figuren 3B).
Siffra 3. Leverhistologi A:. H & E färgning av levervävnad del av FVB-möss infekterade med antingen Ad-Control eller Ad-2D6 vid vecka 4 efter infektion. Observera att betydande infiltration av mononukleära celler finns endast i Ad-2D6 infekterade möss (enkla pilarna). Triple pilar indikerar större cellulära infiltrationer i leverparenkym överbryggande mellan angränsande portal skrifter. B: Immunhistokemisk representation av leverfibros vecka 4 efter infektion med Ad-2D6 eller Ad-kontroll. De leversektioner har färgades för kollagen med användning av en-anti-kollagen I antikropp. Notera multipel skikt av kollagen sinnelag inom ramen för den levern kapsel (triple pilar) med några buntar utskjutande in i den parenkymet (enkla pilarna) och närvaron av stora kluster av infiltrerande celler (pilspetsar). Två representativa leverförändringar sektioner är visas för varje skick. Storlek staplar: 100 pm.
Ett tredje inslag är den generation av höga titrar av-anti-CYP2D6-antikroppar som inte har ett lik epitop specificitet till humana LKM-1-antikroppar 6,13. Sista, hCYP2D6-specifika CD4-och CD8 T-celler tas genereras som till övervägande del hem till levern. Sådana hCYP2D6-specifika T-celler kan detekteras genom stimulering med immunodomirande hCYP2D6 peptider och efterföljande mätningar av det IFNy uttryckning genom en intracellulär cytokin-färgning (CIEC) (figur 4). hCYP2D6-specifika CD8 T-celler kill Ad-2D6-infekterade målceller in vivo-12.
Klura 4. hCYP2D6-specifika T-celler. Flödescytometrisk analys av hCYP2D6-specifika T-celler. Lever lymfocyter har isolerats vecka 4 efter Ad-2D6-infektion och stimulerades med antingen de immundominanta CD4 eller CD8 hCYP2D6 epitop natten. Generation av IFNy detekterades genom intracellulär cytokin-färgning och analyserades genom flödescytometri med användning av en FACS-Canto-II-(BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). Den procentuella andelen av hCYP2D6-specifika CD4-och CD8 celler är indicerad.
Discussion
I tidigare studier har experimentell hepatit ofta rapporteras vara bara övergående och många aktuella modeller för autoimmuna leversjukdom beror på en ganska komplex protokoll sjukdomar induktion (för översikter se 3,5). Till exempel flera modeller använder transgena möss som uttrycker specifika mål antigener och adoptivt överförs målantigenet-specifika, de flesta TcR-transgena och T-celler 14,15. Ofta en ytterligare en infektion med livertropic virus, bakterier eller parasiter som är nödvändigt för att inducera sjukdom 16-18. Alternativt DNA-vaccination med plasmider som kodar för målantigener, inklusive CYP2D6 19, används för att inducera hepatit. Emellertid är en ytterligare en vaccination med plasmider som kodar för pro-inflammatoriska cytokiner, såsom IL-12, erfordras 20. Tyvärr, med några få undantag 15,20 hepatit är bara övergående.
CYP2D6-modellen 6,21 använder en enkel metod to inducerar autoimmun hepatit genom att helt enkelt infektera möss med ett adenovirus som uttrycker hCYP2D6, den stora autoantigen i AIH-2 7,8. Leverans av CYP2D6 med ett adenovirus konstruktion garanterar både en direkt inriktning på levern samt en lokal inflammation som främjar nedbrytningen av tolerans. Det är viktigt att notera dock att både den viruset-titer såväl som den administrationssättet är avgörande för denna modell. Å ena sidan, är Ad-2D6 en replikation bristfällig-virus, sålunda, en tillräcklig hög titer av-virus är skyldig att generera en kritisk mängd antigen inuti levern. Å den andra sidan kan det vara alltför hög en-titer resultera i en dödlig akut leversvikt. Som tillägg, har det demonstrerats tidigare att infektion av möss genom höga titrar av adenoviruset leder till en funktionell utmattning av immunsvaret 22. I vår modell, använde vi en kombination av intravenös och intraperitonal infektion i syfte att erhålla både kronisk cellulär infiltration såväl som anknensive fibros. Vi har observerat att intravenös infektion sig fortfarande orsakar massiv cellulär infiltration, men ingen fibros i subkapsulära regionen, vilket tyder på att bukhinneinflammation till följd av intraperitoneal injektion kan vara inblandade i det kontinuerliga subkapsulär ansamling av kollagen (Hintermann & Christen, manuskript under utarbetande). Emellertid är det viktigt att notera att den observerade hepatisk fibros är antigen-specifik, eftersom vi inte hade detektera aktivering av celler hepatiska stellatceller och kollagen avsättningshastigheter efter infektion med lika stora virus-titrar av Ad-GFP-eller Ad-Control 23.
CYP2D6 Modellen speglar många aspekter av mänsklig AIH 1,2, såsom kronisk hepatit kännetecknas av ihållande cellulär infiltration och lever fibros 6. Som tillägg, indikerar närvaron av hög-antikroppnivåvärden-anti-CYP2D6-antikroppar med lik epitop specificitet och sprider sig 13 för att LKM-1-antikroppar funna i AIH-2 patienter den förhandsfinansieringsinne av en vanlig kronisk autoimmun reaktivitet. CYP2D6 är den största antigen i AIH-2, men det är inte erkänd av patienter som diagnostiserats med den mer frekventa typ 1 AIH. Dessutom kan patienter som lider av andra leversjukdomar med autoimmun etiologi, såsom primär biliär cirros (PBC) eller primär skleroserande kolangit (PSC), generera Hallmark autoantikroppar med specificitet till olika lever autoantigener och deras lever visar olika patologiska funktioner inriktning på små (PBC ) eller stora (PSC) gallgångar. Ändå erbjuder CYP2D6 modeller möjlighet att analysera immunopathogenic mekanismer involverade i kronisk leverskada inflammatoriska processer som inträffar under autoimmuna leversjukdomar, för att identifiera viktiga aktörer som driver den autoimmuna förstörelsen av hepatocyter och för att utvärdera möjliga terapeutiska insatser för att bota sjukdomen.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Goethe Universitetssjukhuset Frankfurt och ett bidrag av den tyska Research Foundation till UC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
| 27½G needle | VWR international | 612-0151 | |
| 30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
| Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Group | 10 745 138 202 | |
| Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Group | 10 745 120 202 | |
| Anaesthesia Unit Univentor 400 |  AgnTho’s |
||
| Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR international | 720-0208 | |
| Cell strainer 70mm | VWR international | 734-0003 | |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1850 UV | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher Scientific | 3123987 | |
| Microscope slides Superfrost Plus | Menzel-Glaser | J1800AMNZ | |
| Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
| Microtiter plates, V-bottom | VWR international | 391-1924 | |
| Reflotron Plus | Roche Group | Determiniation of serum AST / ALT | |
| Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon International | AB765P | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | VC-BA-1000-MC15 | |
| FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | SouthernBiotech | 1550-02 | |
| PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Aquatex | VWR international | 1.08562.0050 | |
| Avidin/Biotin Blocking kit | Vector Laboratories | VC-SP-2001-KI01 | |
| Brefeldin A | Sigma-Aldrich | B6542 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138-100MG | |
| DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector Laboratories | VC-SK-4100-KI01 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Elite ABC Reagent | Vector Laboratories | VC-PK-7100-L050 | |
| Eosin G/Y solution | Carl Roth Gmbh | X883.1 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
| Isofluran | Forene | B506 | |
| Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
| OCT Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| PBS-buffered formaldehyde 10% | Carl Roth Gmbh | A146.3 | |
| Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
| Roti-Histokit | Carl Roth Gmbh | 6638.1 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 |
References
- Manns, M. P. Diagnosis and management of autoimmune hepatitis. Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).
- Czaja, A. J., Manns, M. P. Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis. Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).
- Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. New animal models for autoimmune hepatitis. Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).
- Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. Animal models for autoimmune hepatitis. Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).
- Czaja, A. J.
- Holdener, M. Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection. J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).
- Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase. J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).
- Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).
- von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile. Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S.
- Forbes, N. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).
- Ehser, J. Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis. , Forthcoming (2011).
- Hintermann, E. Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model. J. Autoimmun. , Forthcoming (2011).
- Ando, K. Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo. J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).
- Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis. Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).
- Limmer, A. Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment. Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).
- Voehringer, D. Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis. J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).
- Derkow, K. Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis. Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).
- Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens. Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).
- Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis. J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).
- Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty. J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).
- Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus. J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).
- Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis. Manuscript Submitted. , (2011).
