Summary
हम प्राथमिक मानव fibroblast संस्कृतियों से भोले multipotent त्वचा व्युत्पन्न अग्रदूत (एसकेपी) कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट. हम तंतुप्रसू संस्कृतियों से निकाली गई इन SKPs को मानव त्वचा बायोप्सी से सीधे प्राप्त लोगों के लिए समान स्टेम सेल गुण है कि शेयर दिखा. इन कोशिकाओं को इस तरह Oct4 और Nanog रूप multipotent मार्करों के अलावा तंत्रिका शिखा मार्कर, nestin, व्यक्त करते हैं.
Protocol
1. प्राथमिक तंतुकोशिका संस्कृति से एसकेपी अलगाव
- सेल बैंकों से या सीधे त्वचा बायोप्सी से प्राप्त या तो fibroblast संस्कृतियों fibroblast वृद्धि मध्यम DMEM 15% भ्रूण बछड़ा सीरम, 2 मिमी glutamine, 10 मिलीग्राम / एमएल पेनिसिलिन, और 10 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त में संस्कृति में रखा जाता है.
मानव fibroblasts GMO3349C और GMO8398A मेडिकल रिसर्च के लिए Coriell संस्थान (कैमडेन, न्यू जर्सी) से प्राप्त किया गया और इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया.
- जनसंख्या दोहरीकरण से संस्कृति (पीपीडीएस) 20 से 35 से 80% की एक confluency पर एसकेपी संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया गया. एक 10 सेमी टिशू कल्चर पकवान (बी फाल्कन) लगभग 1.5x10 6 सेल शामिल हैं.
- 37 पर 1 घंटे के लिए 2 मिलीलीटर trypsin समाधान (0.25%, Invitrogen) के डिग्री सेल्सियस के साथ पीबीएस और सेते के साथ कोशिकाओं को धो लें
- 5 मिलीलीटर पीबीएस के साथ थाली से कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक 15 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण.
- 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं.
- DMEM-F12, 3:1 (वी / वी) और 40 एनजी / एमएल FGF2 (बी.डी. बायोसाइंसेज, 20 एनजी / एमएल EGF (बी.डी. बायोसाइंसेज), B27 के सीरम मुक्त पूरक 2% (Invitrogen), 1 ग्राम से मिलकर एसकेपी विकास मध्यम तैयार / एमएल Fungizone (Invitrogen) के और 25 माइक्रोन / एमएल Gentamycin (Invitrogen) के.
- गोली 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर कोशिकाओं और 4 मिलीलीटर एसकेपी मध्यम विकास में सीधे सेल गोली resuspend. एक 25 सेमी 2 टिशू कल्चर कुप्पी (बी फाल्कन) सेल निलंबन स्थानांतरण.
- 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं और 3 से 4 सप्ताह के लिए दैनिक क्षेत्र के गठन के लिए संस्कृति की निगरानी.
2. क्षेत्र संस्कृति शर्तें
- 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में एक 25 सेमी 2 फ्लास्क (बी फाल्कन) में संस्कृति कोशिकाओं.
- कुप्पी के नीचे का पालन करने के लिए कोशिकाओं से बचने के लिए सख्ती दैनिक फ्लास्क हिलाएँ. यदि आवश्यक हो, पक्षपाती कोशिकाओं को अलग कर एक नई कुप्पी संस्कृति स्थानांतरित करने के लिए एक 2 मिलीलीटर बाँझ विंदुक के साथ नीचे विंदुक ऊपर और.
- प्रथम क्षेत्रों 3 टी के भीतर निर्माण शुरूओ 4 दिन.
- मध्यम हर 3 दिन की कुप्पी और बदलाव के आधे के नीचे के क्षेत्रों तलछट चलो. विकास के कारकों में से एक ही अंतिम एकाग्रता रखने के हौसले से तैयार एसकेपी मध्यम विकास के लिए 2X वृद्धि कारकों जोड़ें.
- 4 मिलीग्राम अधिकतम मात्रा स्थिर रखें.
- क्षेत्रों ~ 200 मिमी के आकार तक वे जोरदार एक 2 मिलीलीटर विंदुक के साथ ऊपर और नीचे pipetting और से छोटे आकार के क्षेत्रों टूट द्वारा passaged किया जाना चाहिए.
- संस्कृति 2.4 चरण) में वर्णित के रूप में फीड कर रहे हैं दो 25 सेमी 2 बोतल (बी फाल्कन) और क्षेत्रों संस्कृतियों में विभाजित है.
- क्षेत्रों के 21 को सुबह 16 से स्क्रीनिंग स्टेम सेल मार्कर के लिए एकत्र होते हैं.
2.6) और 2.7) से प्रक्रिया के लिए क्षेत्रों का प्रचार वर्णन (1) एसकेपी मध्यम में शामिल nutriments और वृद्धि कारकों के प्रत्येक क्षेत्र के भीतर सभी कोशिकाओं का उपयोग करने की अनुमति देता है और (2) के पूर्व उपयोग एसकेपी क्षेत्र संस्कृति का विस्तार करने के लिए.
हमारे घन के तहत आमतौर पर क्षेत्र संस्कृतियोंLTURE शर्तों तीन महीने की अवधि में विकसित करने की क्षमता बनाए रखने के लिए और 3 से 4 बार के बीच passaged हैं.
3. स्टेम सेल मार्कर के लिए immunocytochemistry
- क्षेत्र संस्कृतियों दिन 16 से 21 के लिए पीबीएस में काटा जाता है. संस्कृतियों के 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर pelleted हैं.
- क्षेत्रों पीबीएस की एक छोटी मात्रा में resuspended हैं.
- माइक्रोस्कोप स्लाइड्स (फिशर ब्रांड) पर व्यास में लगभग 0.5 माइक्रोन का एक DAKO कलम के साथ दो हलकों ड्रा.
- हलकों में क्षेत्र के निलंबन के 50 μl जोड़ें.
- हर बूंद में क्षेत्रों की उपस्थिति के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा की जाँच करें.
- हुड के तहत बूँदें सूखी.
- या तो -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड फ्रीज या immunofluoresence धुंधला प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना.
- Immunofluorescence धुंधला के लिए, 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा मेथनॉल (100%) के साथ स्लाइड्स को ठीक.
- पीबीएस के साथ स्लाइड्स धो लें.
- PBS/10% भ्रूण गोजातीय सीरम / 0.02% ट्राइटन X100 के साथ स्लाइड ब्लॉककम से कम 1 घंटे के लिए.
- PBS/10% 4 में 2 कमरे के तापमान पर घंटे या रात भर के लिए एफबीएस डिग्री सेल्सियस: अवरुद्ध बफर में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे विरोधी nestin, विरोधी Oct4, विरोधी TG30, विरोधी Nanog एंटीबॉडी, टेबल 3) के साथ सेते
- अवरुद्ध बफर के साथ 3 बार धोएं और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं.
- पीबीएस के साथ बफर और 3 बार रोकने के साथ 3 बार धोएं.
- Vectashield बढ़ते मध्यम (वेक्टर इंक) के साथ माउंट स्लाइड.
- Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए नमूने का विश्लेषण करें.
4. स्टेम सेल मार्करों की अभिव्यक्ति के स्तर की रीयलटाइम पीसीआर विश्लेषण
- 21 को सुबह 18 से लगभग 2-3 मिलीलीटर क्षेत्र संस्कृतियों लो.
- गोली 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर क्षेत्रों और सभी मध्यम aspirate.
- RNeasy Minikit (क्विएज़न, वालेंसिया, सीए) का उपयोग क्षेत्रों से शाही सेना को अलग.
- स्पेक्ट्रोमेट्री और agarose जेल से शाही सेना पवित्रता का आकलन करें. </ ली>
- टेम्पलेट के रूप में कुल सेलुलर शाही सेना का उपयोग (Omniscript रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (Qiagen)) सीडीएनए synthesize.
- एक 20 μl में प्रत्येक प्राइमर के 375 एनएम और टेम्पलेट के 50 एनजी के एक एकाग्रता के साथ एक पावर SYBR ग्रीन पीसीआर Mastermix (एप्लाइड Biosystems) में स्टेम सेल मार्कर (तालिका 1 में दिखाया गया है) के लिए रीयलटाइम-पीसीआर का उपयोग प्राइमरों द्वारा स्टेम सेल मार्कर मान्य प्रतिक्रिया मात्रा. GAPDH अंतर्जात नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है.
- प्रवर्धन 20 सेकंड के लिए 5 सेकंड और 60 डिग्री सेल्सियस के लिए 95 से कम 40 चक्रों के बाद 2.5 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए 95 पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें.
- 2 (ΔΔCt) विधि 8 के साथ रन का विश्लेषण करें.
5. चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में निर्देशित भेदभाव
- सुबह 21 से 26 के लिए क्षेत्रों एसकेपी माध्यम में 6 अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन (बी फाल्कन) में चढ़ाया गया.
- कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए एसकेपी माध्यम क्षेत्रों से पालन और विकसित हो जाना करने की अनुमति दी गई.
- चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (एसएमसी) differentiatआयन 5% FBS, 5 एनजी / एमएल PDGF-बी.बी. (Invitrogen), और 2.5 एनजी / एमएल TGF-बी 1 (Invitrogen) युक्त उच्च ग्लूकोज है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (Invitrogen) से मिलकर एसएमसी भेदभाव मध्यम से मध्यम प्रतिस्थापित द्वारा शुरू शुरू .
- मध्यम संस्कृतियों में 3 से 4 सप्ताह की अवधि के लिए हौसले से तैयार एसएमसी भेदभाव मध्यम के साथ हर 3 दिन बदल गया था.
- एसएमसी मार्करों के लिए स्क्रीनिंग immunohistochemistry द्वारा 3 से 4 सप्ताह के बाद प्रदर्शन किया गया था.
- कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde समाधान के साथ तय किया गया.
- कोशिकाओं पीबीएस 30 मिनट के लिए 0.3% ट्राइटन X-100 युक्त साथ permeabilized थे.
- प्रकोष्ठों 1 कमरे के तापमान पर घंटा और आगे के रूप में 3.15 तक) 3.12 में वर्णित संसाधित) के लिए αSMA (MO851, Dako, 1:100), या calponin (M3556, Dako, 1:100) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे.
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Representative Results
हम हाल ही में 7 की सूचना के रूप में चुनिंदा EGF और FGF2 से मिलकर नियंत्रित विकास शर्त के तहत एसकेपी क्षेत्रों उत्पन्न करने के लिए विस्तार है कि कोशिकाओं की आबादी प्राथमिक त्वचीय fibroblast संस्कृतियों (चित्रा 1) में मौजूद हैं जो दिखाते हैं.
आमतौर पर सेल बैंकों से उपलब्ध प्राथमिक fibroblasts के उपभेदों के अनुरूप कि पीपीडीएस 15 से 25 से fibroblast संस्कृतियों के इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया. इस विधि में वर्णित 24 घंटे के लिए भोजन कमी के साथ ठंड तापमान उपचार से मिलकर डबल उपचार के लिए प्रस्तुत fibroblast संस्कृतियों के रूप में एक समान विकास विशेषताओं बांटने अस्थायी क्षेत्रों (भी embryoid शरीर ईबी के रूप में कहा गया है) युक्त reproducibly उत्पन्न संस्कृतियों सीधे प्राप्त SKPs के लिए पहले से वर्णित त्वचा के नमूने 7, 9 से.
यहाँ हम हम हाल ही में 7 की सूचना दी है कि विधि का उपयोग कर रहा है, हम CE की एक बड़ी आबादी को अलग दिखानेपृथक और neurosphere संस्कृति शर्तों 5, 10, 11 का उपयोग करते हुए मानव और माउस त्वचा में पहचान multipotent तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं के समान गुण है कि प्रदर्शन के प्राथमिक तंतुप्रसू संस्कृतियों से LLS. वे विस्तार किया है और इन विट्रो में तीन महीने के कम से कम एक अवधि (विधि अनुभाग को देखें) के लिए passaged किया जा सकता है के रूप में इन प्राथमिक मानव fibroblast संस्कृतियों से एसकेपी व्युत्पन्न स्वयं renewing शक्ति दिखाते हैं. क्षेत्रों संस्कृति में 18 से 21 दिनों के बाद व्यास में 150 से 200 माइक्रोन के आकार तक पहुँच गया है, वे यंत्रवत् व्यास में 50 माइक्रोन के एक औसत में टूट और एसकेपी माध्यम में निलंबन संस्कृति में फिर से विस्तार करने की अनुमति दी गई. इन टूटी हुई नीचे क्षेत्रों वे 200 माइक्रोन से पहले के रूप में विधि अनुभाग में वर्णित फिर passaged किया जा रहा है पर पहुंच गया जब तक बढ़ने की अनुमति दी गई. एसकेपी क्षेत्रों में कम से कम तीन बार passaged किया जा सकता है. इस अवलोकन क्षेत्रों के भीतर कोशिकाओं आत्म नवीकरण और ओ के रूप में neurosphere संस्कृति परिस्थितियों में विस्तार करने के लिए सक्षम थे कि इंगित करता हैthers और हम 5, 7 की सूचना दी.
इसके अलावा, तंतुप्रसू संस्कृतियों से निकाली गई इन एसकेपी कोशिकाओं तंत्रिका शिखा व्यक्त किया है और इसी तरह त्वचा से सीधे प्राप्त एसकेपी के रूप में अच्छी तरह से भ्रूण स्टेम सेल प्रतिलेखन कारक Nanog और Oct4 और pluripotent सेल सतह मार्कर TG30 (चित्रा 2) के रूप में न्यूरॉन स्टेम सेल मार्कर nestin, बायोप्सी 5, 7, 10. एसकेपी क्षेत्रों पर immunohistochemistry cytoplasm में nestin सकारात्मक संकेत संकेत अक्टूबर 4 punctuated परमाणु संकेत प्रदर्शन किया और Nanog (चित्रा 2) एक अधिक दूर तक फैला हुआ परमाणु संकेत दिखाया. इसके अतिरिक्त, pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं TG30 की कोशिका की सतह मार्कर एसकेपी क्षेत्र तैयारी (चित्रा 2) पर एक सकारात्मक साइटोप्लाज्मिक झिल्ली धुंधला दिया. वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करना, हम भी संस्कृति में सुबह 18 से एकत्र एसकेपी क्षेत्रों (चित्रा 3 से पृथक आरएनए तैयारी में mRNAs एन्कोडिंग nestin और Oct4 की उपस्थिति की पुष्टि की 5,10 से व्युत्पन्न SKPs के लिए सूचना दी multipotent स्टेम सेल मार्कर व्यक्त कि संकेत मिलता है. आगे तंतुप्रसू संस्कृतियों से निकाली गई एसकेपी के multipotency के परीक्षण करने के लिए, हम चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (चित्रा 4) में अंतर करने के लिए इन कोशिकाओं को प्रेरित किया. वृद्धि कारकों PDGF-बी बी और TGF-बी 1 में 12 से युक्त मध्यम में 3 सप्ताह प्रेरण के बाद, immunocytochemistry के एसएमसी मार्करों, αSMA, इन SKPs से व्युत्पन्न एसएमसी में calponin (चित्रा 4) की अभिव्यक्ति की पुष्टि की.
सामूहिक रूप से, इस पद्धति और निष्कर्षों को प्राथमिक तंतुप्रसू संस्कृतियों से अलग एसकेपी क्षेत्रों त्वचा बायोप्सी से व्युत्पन्न लोगों के लिए इसी तरह की संपत्ति का हिस्सा है और मानव त्वचा त्वचा के भीतर रहने वाले एक वयस्क स्टेम सेल जनसंख्या से प्राप्त करना आवश्यक है कि प्रदर्शित करता है.
| नाम | Entrez आईडी | प्राइमर अनुक्रम | Amplicon |
| GAPDH | 2597 | एफ सीटीसी टी जी सी टीसीसी टीसीसी TGT टीसीजी एसी | 144 बीपी |
| आर TTA एएए जीसीए जीसीसी CTG GTG एसी | |||
| Nestin | 10763 | एफ GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 बीपी |
| आर GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4 अक्टूबर | 5460 | एफ जी ए टी GGC जीटीए CTG TGG जीसीसी सी | 195 बीपी |
| आर TGG GAC टीसीसी टीसीसी GGG TTT टीजी |
तालिका 1. वास्तविक समय पीसीआर और qPCR के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों की सूची.
| प्रतिरक्षी | कंपनी | सूची संख्या | टिप्पणियां |
| विरोधी nestin | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| विरोधी Oct4 | abcam | ab19857 | 1/400 |
| विरोधी TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| विरोधी Nanog | abcam | ab21624 | 1/400 |
| विरोधी αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| विरोधी Calponin 1 | Dako | M3556 | 1/100 |
| एलेक्सा Fluor, 555 गधा विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| एलेक्सा Fluor, 555 गधा विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| एलेक्सा Fluor, 488 गधा विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| एलेक्सा Fluor, 488 गधा विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
तालिका 3. एंटीबॉडी मूल की सूची.
चित्रा 1. प्राथमिक तंतुप्रसू संस्कृतियों से SKPs का अलगाव. मार्ग 12 पर GMO3349C प्राथमिक त्वचीय fibroblast संस्कृतियों से शुरू एसकेपी क्षेत्र संस्कृति के लिए विधि उल्लिखित है. 0 दिन एसकेपी मध्यम विकास में शुरू तंतुप्रसू निलंबन से पता चलता है. 4 दिन दिखाई क्षेत्र के गठन से पता चलता है. 17 दिन एक ठेठ 3 डी एसकेपी क्षेत्र से पता चलता है. स्केल पट्टी: 50 मिमी और संकेत के रूप में 100 माइक्रोन.arge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. प्राथमिक तंतुप्रसू संस्कृतियों से निकाली गई एसकेपी क्षेत्रों की immunofluorescence धुंधला. इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण मानव प्राथमिक तंतुप्रसू संस्कृतियों (GMO3349C) से प्राप्त SKPs पर प्रदर्शन किया. सुबह 16 से क्षेत्र खुर्दबीन स्लाइड पर जमा और संकेत के रूप में विरोधी nestin, विरोधी TG30, विरोधी Oct4 और विरोधी Nanog एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे. नाभिक एक डीएनए दाग DAPI (नीला) के साथ counterstained थे. स्केल पट्टी:. 20 मिमी बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
4 चित्रा. चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से व्युत्पन्न प्राथमिक तंतुप्रसू संस्कृतियों से अलग एसकेपी क्षेत्रों से. प्राथमिक fibroblasts से व्युत्पन्न एसकेपी-क्षेत्रों चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (एसएमसी) में अंतर करने के लिए निर्देशित किया गया. (ए) चरण विपरीत इमेजिंग एसएमसी भेदभाव (ऊपरी पैनल) को एसकेपी क्षेत्र संस्कृति से अलग संस्कृति कदम recapitulating. (बी) एसकेपी क्षेत्रों से निकाली गई एसएमसी α-Smoot, संकेत एसएमसी मार्करों के लिए immunostained गयाज पेशी actin (αSMA) और calponin के रूप में संकेत दिया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
विधि का प्रयोग यहाँ बताया, भोले त्वचीय स्टेम कोशिकाओं प्राथमिक त्वचीय fibroblast संस्कृतियों से अलग किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम हाल ही में एक दुर्लभ आनुवंशिक सिंड्रोम, हचिंसन-Gilford progeria सिंड्रोम 7 के साथ रोगियों से ली गई तंतुप्रसू संस्कृतियों से वयस्क स्टेम सेल के अलगाव और लक्षण वर्णन की सूचना दी. के रूप में उन कोशिकाओं अग्रदूत व्यक्त स्टेम सेल मार्कर आत्म नवीकरण करने में सक्षम हैं और (कृपया Wenzel एट अल. द्वारा 4 संदर्भ लें चित्र, 2012) fibroblasts और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं 7 सहित विभिन्न सेलुलर प्रजातियों में अंतर करने के लिए निर्देशित किया जा सकता है इस के साथ साथ दिखा. यह पद्धति पहले से स्तनधारी त्वचा के नमूने 10 से SKPs के अलगाव के लिए सूचना दी विधि के लिए कई लाभ प्रदान करता है. एसकेपी या तो हौसले से त्वचा बायोप्सी से या पहले से ही मौजूद है कि प्राथमिक तंतुप्रसू संस्कृतियों से स्थापित कर रहे हैं कि प्राथमिक तंतुप्रसू संस्कृतियों से अलग किया जा सकता है और प्राप्त किया जा सकता हैदुनिया भर के सेल बैंकों. से इस नए दृष्टिकोण त्वचा के नमूने आसानी से उपलब्ध नहीं हैं, जिसके लिए विभिन्न आनुवंशिक और दुर्लभ रोगों के रोगजनन में वयस्क स्टेम कोशिकाओं के निहितार्थ अध्ययन करने के लिए संभावना प्रदान करता है. अंत में इस विधि वयस्क स्टेम कोशिका जीव विज्ञान का पता लगाने और शारीरिक और रोग राज्य के दौरान उनके प्रभाव को टुकड़े करने के लिए अवसर की एक खिड़की प्रदान करता है. अंत में इस दृष्टिकोण त्वचा व्युत्पन्न अग्रदूत साबित कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक उपन्यास और तेजी से रास्ता प्रदान करता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट फाउंडेशन (5090371), एलर्जी अनुसंधान और शिक्षा के लिए क्रिस्टीन Kühne केंद्र (सी देखभाल), और Bayerischen Staatsministerium (केडी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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