Summary
Мы представляем синтез сплит-интеин опосредованного белка гидрогеля. Строительные блоки этом гидрогель две белковые Сополимеры каждая из которых содержит субъединицу тримерного белка, который служит в качестве сшивающего агента и одной половине разделенной интеина. Смешивание двух сополимеров белка вызывает интеин реакцию транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок, объединяющаяся в гидрогеля. Этот гидрогель весьма рН и температуры стабильной, совместимый с органическими растворителями, и легко включает в себя функциональные глобулярных белков.
Abstract
Мы представляем синтез высокостабильного гидрогеля белка при посредничестве сплит-интеин катализируемой белком реакции транс-сплайсинга. Строительные блоки этом гидрогель две белковые блок-сополимеры, содержащие каждый субъединицу тримерного белок, который служит в качестве сшивающего агента и одной половине разделенной интеина. Высоко гидрофильный статистического клубка вставлен в один из блок-сополимеров для удержания воды. Смешение двух блочных белок сополимеров вызывает интеин реакцию транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок с сшивателей с обоих концов, что быстро объединяющаяся в гидрогеля. Этот гидрогель является очень стабильным при обеих кислотных и основных условиях, при температурах до 50 ° C, и в органических растворителях. Гидрогелевые быстро реформы после разрыва сдвига, вызванных. Включение в "Док-станция для пептида" в гидрогель строительного блока позволяет удобно включение «стыковки белка"-меченых белков-мишеней.Гидрогель совместим с роста среды культуры ткани, поддерживает диффузию молекул 20 кДа, и дает возможность иммобилизации биологически активных глобулярных белков. Применение интеин-опосредованного белком гидрогеля в качестве органического растворителя, совместимого биокатализатора была продемонстрирована путем инкапсуляции пероксидаза хрена фермента и подтверждающих его активность.
Introduction
Гидрогели, сделанные полностью из белков нести потенциал, чтобы значительно продвинуться таких различных областях, как тканевой инженерии, доставки лекарств и biofabrication 1. Они предлагают преимущества перед традиционными синтетические полимерные гидрогели включая биосовместимости и потенциал для неинвазивного поддержки включения биологически активных глобулярных белков.
В этой работе мы описываем развитие нового белка гидрогеля, образованного с помощью сплит-интеин опосредованного белка реакции транс-сплайсинга и его применение в качестве белка иммобилизации эшафот (рис. 1). Строительные блоки для этой гидрогеля два белка блок-сополимеры каждая из которых включает N-или С-концевой фрагмент раскола интеин (в и IC) и субъединицы мультимерного белка сшивателя. DnaE интеин от Nostoc punctiforme (НПУ) использовали в качестве раскола интеина 2,3 и небольшой тримера белка (12 кДа) CutA от Pyrococcus horikoshii </ EM> был использован в качестве сшивающего агента белка 4,5. Различные сшивающие агенты соединены через интеин катализируемой реакции транс-сплайсинга, что приводит к образованию высоко сшитого белкового (гидрогель). НПУ интеин был выбран из-за его быстро кинетики реакции (T 1/2 = 63 сек) и высоким выходом транс-сплайсинга (близко к 80%) 2,3. Белок CutA был выбран в качестве сшивающего агента из-за его высокой стабильности. CutA тримеры иметь температуру денатурации ближайшем 150 ° С и удерживать тримерную структуру четвертичного в растворах, содержащих целых 5 М гуанидина гидрохлорид 4,6. С субъединицы обмен между различными сшивателей является одной из основных причин физического гидрогеля эрозии поверхности 7, очень сильное взаимодействие взаимодействие субъединицы в CutA должны препятствовать такие обмены субъединиц, что приводит к более стабильной гидрогеля. Один из этих блоков содержит также высоко гидрофильный пептид S-фрагмент в качестве середине блока, чтобы облегчить водуУдержание 8.
Смешивание двух строительных блоков гидрогель инициирует реакцию транс-сплайсинга между IN и IC интеин фрагментов, создавая более длительный полипептидную цепь с сшивающими агентами на обоих терминалах. Сшивающие агенты из нескольких таких молекулярных единиц взаимодействуют друг с другом, образуя высоко сшитого сети гидрогеля (рис. 1А). Конкретный "док-станцией пептид" (DSP) включен в один из гидрогеля строительных блоков для облегчения стабильного иммобилизации "док" белка (DP)-меченый белок-мишень в гидрогеле. Использование раскола интеин опосредовать сборку гидрогеля не только обеспечивает дополнительную гибкость для синтеза белка гидрогель, но также обеспечивает высокую плотность, равномерную загрузку целевого белка в течение всего гидрогеля, как целевые белки загружены до образования гидрогеля.
Белок гидрогель интеин опосредованного весьма станцииBLE в водном растворе с небольшим до исключения любых эрозии после 3 месяцев при комнатной температуре. Стабильность сохраняется в широком диапазоне рН (6-10) и температурах (4-50 ° С), а гидрогель также совместим с органическими растворителями. Этот гидрогель используется для иммобилизации двух глобулярных белков: зеленый флуоресцентный белок (GFP) и пероксидазы хрена (HRP). Гидрогель улавливания последний белок используется для выполнения Биокатализ в органическом растворителе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Плазмиды Строительство
ПРИМЕЧАНИЕ: Все гены были усилены при стандартных реакций ПЦР с использованием Phusion High-Fidelity ДНК-полимеразы согласно спецификациям изготовителя. Праймеры, используемые для клонирования были описаны ранее 9. Все конструкции приведены в таблице 1.
- Для генерации CutA-NpuN (N, Таблица 1):
- ПЦР-амплификации CutA и NpuN гены от плазмид pET30-CutA-Tip1 10 и KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, соответственно, с использованием соответствующих праймеров.
- Дайджест эти фрагменты с соответствующими ферментами рестрикции и последовательно вставить эти фрагменты в вектор pET26b между промотором Т7 и С-концевой 6xHistidine тега, чтобы генерировать N (рис. 2а).
- Для генерации NpuC-S-CutA (С, Таблица 1):
- ПЦР-амплификации NpuC, CutA и S фрагментацият [AG 3 (ПЭГ)] 10 из плазмиды KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, pET30-CutA-Tip1 10 и 10 переменного тока pQE9 РППА 12, соответственно, с использованием соответствующих праймеров.
- Дайджест эти фрагменты с соответствующими ферментами рестрикции и последовательно вставить эти фрагменты в вектор pET26b между промотором Т7 и С-концевой 6xHistidine, чтобы генерировать C (фиг.2В).
- Для генерации NpuC-S-SH3 Лига-CutA (С-SH3 Лига, таблица 1):
- ПЦР-амплификации CutA с использованием праймеров, содержащих SH3 Лига (PPPALPPKRRR) и гибкий линкер (GGGGS) 2 генерировать фрагмент SH3 Лига-CutA.
- Замените ген CutA от C с фрагмент SH3 маяк-CutA.
- Для генерации SH3-GFP (табл. 1):
- Амплификации гена SH3 из плазмиды pJD757 13, используясоответствующие грунтовки.
- Предохранитель этот фрагмент с геном GFP и вставьте ее в вектор pET26b между промотором Т7 (рис. 2С) и С-концевой 6xHistidine тега.
2. Экспрессия белка
- Преобразование 50 мкл компетентного химически кишечной палочки BL21 (DE3) с соответствующей экспрессионной плазмиды.
- После трансформации серийно разбавленных эти клетки, и пластины их на Лурии-Бертани (LB) / агаровые пластинки, содержащие 50 мкг / мл канамицина.
- Инкубируют планшеты, содержащие трансформированные клетки при 37 ° С в течение ~ 15 часов.
- После инкубации выбрать пластину, содержащую 50-100 колоний и ресуспендируют всех колоний в 5 мл LB бульоне.
- Передача подвеска на 1 л LB бульоне, содержащем канамицин (50 мкг / мл) и клетки расти при 37 ° С при встряхивании при 250 оборотах в минуту. Монитор оптической плотности при 600 нм (OD 600). не расти культуру, пока OD 600 ~ 0,8.
- Для C и C-SH3 LIG, индуцируют экспрессию белка добавлением изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в культуре (1 мМ конечной концентрации) и инкубируют культуры при 37 ° С в течение 4 часов при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
- Для N и SH3-GFP, охладить культуру ~ 18 ° C путем погружения культуральной колбы на бане с ледяной водой для ~ 5 мин. Индуцируют экспрессию белка путем добавления IPTG к культуре (1 мМ конечной концентрации) и инкубируют культуры при 18 ° С в течение 14-18 часов при встряхивании со скоростью 250 оборотов в минуту.
- После экспрессии белка, центрифуге культуры в 6000 х г в течение 20 мин при 4 ° С, чтобы собрать осадок. Магазин клеточный осадок при -80 ° С до использования.
3. Protein Purification
- Очистка N (денатурирующих условиях)
- Ресуспендируют осадок клеток в буфере А (табл. 2) при 10 мл / г влажного гранул.
- Иммерсе пеллет суспензии на лед ной бане и разрушать клетки путем обработки ультразвуком (Amp 10, с 1 сек импульса и паузы 6 сек в течение 1 мин).
- Центрифуга лизата при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
- Удалите супернатант. Ресуспендируют гранул в буфере DA (содержащий 8 М мочевину) и центрифуги суспензии при 16000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С.
- Pass супернатанта через колонку с 5 мл Ni-нитрилотриуксусной кислоты (NTA), предварительно уравновешенную буфером DA.
- Столбец Промыть 30 мл буфера DA дополненной 45 мМ имидазола. Элюции очищенного белка с использованием 20 мл буфера с добавлением DA 150 мМ имидазола.
- Уменьшение концентрации мочевины в образце белка, чтобы <1 мм либо одним из следующих методов, указанных в 3.1.7.1 или 3.1.7.2:
- Диализировать белка в DPBS буфера (табл. 2) при 4 ° С в течение ночи с использованием трубки с <20 кДа отсечкой.
- Центрифуга очищенного белка в 30 & #160; кДа ультра-фильтрации колонка спин при 2800 х г, 4 ° С, пока объем не менее 1 мл. Добавить 14 мл DPBS буфера в колонну для разбавления образца белка. Повторите центрифугирования / разведение шаги еще три раза.
- После замены буфера добавить дитиотреитола (DTT) в очищенного белка (конечная 2 мм) и белкового концентрата до ~ 100 мг / мл центрифугированием через 30 кДа ультра-фильтрации колонку вращаются на 2800 мкг, 4 ° С.
- не Аликвотировать концентрированный белок и хранить при -80 ° С до использования.
- Очистка C и C-SH3 LIG (родной условие)
- Ресуспендируют осадок клеток в буфере B (рН 6,0) (табл. 2) с добавлением 1x коктейль ингибитора протеазы на 10 мл / г влажного гранул. С помощью кислотного буфера, чтобы минимизировать протеолитический распад белка-мишени.
- Лишить клеточной суспензии ультразвуком, как описано в п. 3.1.2. Центрифуга Lysели 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С и сохранить супернатант.
- Пропускают растворимый лизат через 5-мл колонке Ni-NTA, предварительно уравновешенную буфером В.
- Wash колонка с буфером B с добавлением 45 мМ имидазола, и элюирования целевого белка в 20 мл буфера В с добавлением 150 мМ имидазола.
- Для C, перейдите к шагу 3.2.6. Для С-SH3 LIG, провести дополнительную ионообменной стадию очистки для удаления частично деградированных белок, как указано в пунктах 3.2.5.1 для 3.2.5.3
- Снизить концентрацию NaCl в С-SH3 LIG к <1 мм в соответствии с процедурой, описанной в п. 3.1.7.
- Загрузка целевого белка на мл анионит бисером агарозном колонке 5 матрицы, предварительно уравновешенную фосфатным буфером натрия (50 мМ, рН 7,0).
- Элюировать целевой белок из колонки с помощью градиента работает из раствора, содержащего 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0 bufféR к раствору, содержащему тот же буфер с добавлением 1 М NaCl. Отбирают образцы в течение белка элюирования и образцы бассейна с высокой чистоты на основе додецилсульфат полиакриламидного гель-электрофореза натрия (SDS-PAGE).
- Буферного обмена очищенного белка в DPBS буфера, как описано в 3.1.7.
- Добавить DTT к очищенного белка (конечная концентрация 2 мМ) и концентрат белка до ~ 100 мг / мл с использованием ультрафильтрации спин колонки 30 кДа, как описано в 3.1.8. Аликвоты и хранят концентрированного белкового при -80 ° С до использования.
- Очистка SH3-GFP
- Ресуспендируют осадок клеток с использованием буфера А при 10 мл / г влажного гранул.
- Лишить гранул подвеску с помощью ультразвука, как описано в п. 3.1.2.
- Центрифуга лизата при 16000 х г в течение 20 мин при 4 ° С и собирают супернатант.
- Pass супернатанта (растворимый лизат) с помощью 5-мл колонке Ni-NTA, предварительно уравновешеннуюБуфер А.
- Промывной колонны 30 мл буфера А с добавлением 45 мМ имидазола. Элюции очищенного белка с использованием 20 мл буфера А с добавкой 150 мМ имидазола.
- Буферного обмена очищенного белка в DPBS буфера, используя подход, аналогичный тому, который описан в 3.1.7 и концентрат белка до ~ 150 мг / мл с использованием ультрафильтрации спин колонки 30 кДа, как описано в 3.1.8.
- Аликвоты и хранят очищенный белок при -80 ° С до использования.
- Анализ с помощью ДСН-ПААГ очищенных образцов, содержащих CutA
- Развести каждый очищенного белка в дважды дистиллированной воды, чтобы уменьшить концентрацию NaCl до ~ 1 мМ. При этой концентрации NaCl, большинство белков CutA тримера работать в качестве мономеров на ПААГ с ДСН.
- Смешайте образцы с 2x SDS буфере для образцов (0,5 М Трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерина, 10% вес / объем ДСН, 0,1% вес / объем бром-фенола синий, 2% β-меркаптоэтанола), инкубировали при 95 ° С в течение 5 мин.
- Загрузите СэмаPles на 12% SDS-PAGE гель. Провести электрофорез при постоянном напряжении 200 В для ~ 50 мин.
- Заметим, белок в геле при окрашивании кумасси бриллиантовым голубым R250 следующие стандартные протоколы (рис. 1с).
4. Гидрогель Формирование
Примечание: Пример гидрогели, сделанные в этом исследовании содержится 1,6 мМ каждого из гидрогеля строительного блока, если не указано иное. Эта концентрация белка дает мягкий и стабильный гидрогель. ВНИМАНИЕ: азид натрия (NaN 3) добавляют в гидрогеле до конечной концентрации 0,5% вес / об, чтобы предотвратить бактериальное заражение. NaN 3 является высокотоксичным и должны быть обработаны с особой тщательностью, как указано в паспорте безопасности продукта.
- Рассчитать объем для каждого из сконцентрированных белков, необходимых для достижения конечной концентрации 1,6 мМ в 100 мкл образца гидрогеля. Например:
Концентрация N:100 мг / мл
Молекулярная масса N: 26,3 кДа (см. таблицу 1)
Желаемый Объем: 100 мкл Желаемый Концентрация: 1,6 мм
- Чтобы сделать 100 мкл гидрогель (1,6 мм), перемешивают С (х мкл, объем рассчитывается по 4,1) с 5% NaN 3 (10 мкл), 100 мМ DTT (5 мкл) и N (Y мкл, объем вычисляются в соответствии с 4.1) внутри стеклянного флакона 2 мл.
- Добавить DPBS буфер ((85 - х - у) мкл) в пробирку для достижения конечного объема 100 мкл, и вручную смешивать все компоненты через вихревое движение с помощью пипетки. Примечание: раствор становится очень вязким при смешивании.
- Центрифуга смесь в течение 2 мин при 8000 мкг, чтобы удалить пузырьки воздуха.
- Выдержите смесь при комнатнойТемпература ночь, чтобы реакция интеин транс-сплайсинга достичь к завершению. Подтвердите образование гидрогеля, повернув трубку с ног на голову. Белки не будет течь, если гидрогель образуется.
- Расчетный выход интеин транс-сплайсинга, проверяя образцы (0,5 мкл каждый), собранных перед стадией 4,2 и 4,5 после шага на SDS-PAGE геле, как описано в 3,4 (рис. 1в).
5. Иммобилизация GFP через док-белка (DP) и док-станции пептид (DSP) Взаимодействие
- Чтобы 50 мкл GFP функциональными гидрогель с (1.2 мм), объединить С-SH3 Лига (х мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) и SH3-GFP (у мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) в молярном соотношении 1:1 в 1,7 трубки микроцентрифужных мл и инкубируют смесь при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Добавить 5% NaN 3 (5 мкл), 100 мМ DTT (2,5 мкл), (42.5 - х - <EM> у) мкл DPBS в той же пробирке. Добавить п (у мкл, рассчитанный в соответствии с 4.1) для достижения 1:01 молярное отношение N и С-SH3 LIG. Смешайте образец с помощью пипетки на вихревое движение.
- Центрифуга смеси при 8000 х г в течение 2 мин и инкубировать смеси при комнатной температуре в течение ночи в темноте. Гидрогель инкапсуляции SH3-GFP формы во время инкубации.
6. Использование 1,6 мм гидрогеля в качестве иммобилизации строительные леса для ферментативной реакции в органическом растворе
- Используйте HRP как модель фермента. Подготовка исходного раствора HRP (28 мг / мл или 0,63 мМ) в DPBS.
- Чтобы сделать 30 мкл гидрогель (1,6 мм) улавливания HRP, комбинат С (х мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) с HRP (2 мкл), 5% NaN 3 (3 мкл) и DVB-T (1,5 мкл 100 мМ) внутри 1,7 мл центрифужные пробирки.
- Добавить п (у </ EM> мкл, рассчитывается в соответствии с 4.1) и DPBS (23,5 - х - у) мкл. Смешайте с кончика пипетки с вихревое движение.
- Центрифуга смеси при 8000 х г в течение 2 мин и инкубировали при комнатной температуре в течение ночи.
ВНИМАНИЕ: регенты, используемые для следующей анализа активности являются высокотоксичными. Используйте конкретные рекомендации по обеспечению безопасности на соответствующие Сертификаты безопасности материалов. - Для ферментативной реакции, погрузите гидрогель в 1 мл коктейля реакции, содержащих N, N-диметил-п-фенилендиамина (5,8 мм), фенол (5,8 мм) и трет-бутилгидропероксид (2,9 мм) в н-гептана 14. Вручную нарушить гель с использованием пипетки, чтобы увеличить площадь контактной поверхности гидрогеля и растворителя.
- Обнаружение HRP продукт, в индофеноле типа красителя, путем измерения оптической поглощение образцов, взятых в разное время при 546 нм в ридере (рис. 5). </ Ол>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема для интеин-опосредованного формирования белок гидрогель представлен на фиг.1А. Строительные блоки гидрогеля являются белок сополимеры CutA-NpuN (N) и NpuC-S-CutA (C) (рис. 1А, таблица 1). NpuN / C являются N-/C-fragments из естественно разделить DnaE интеин от Nostoc punctiforme (НПУ). CutA является стабильным тримерный белок из Pyrococcus horikoshii 4,5. Смешивание очищенного N и С в присутствии восстанавливающего агента DTT индуцирует образование третьей белок - лигировали продукта (J: CutA-S-CutA) (фиг. 1A и 1C). По отдельности гидрогель строительные блоки N и C существовать как вязких жидкостей (рис. 1b). Смешивание N и С дает прозрачный полутвердый материал, который удерживается на дне стекл нный сосудик после инверсии, что свидетельствует о формировании гидрогеля 15,16 (фиг.1В) 18,19.
Это интеин-опосредованной белок гидрогель (1,6 мм) обладает высокой стабильностью раствора. Существует мало к без потери гидрогель сшитой строительных лесов после 21 дней при 22 ° С в буфере DPBS, как общее количество белка выделяется в буфере DPBS незначительно превышает теоретическое количество сращены интеин из гидрогеля (при условии, 100 % интеин эффективность транс-сплайсинга) (рис. 3А). Денситометрия показал, что во время формирования гидрогеля, транс-сплайсинга реакции были ~ 80% эффективнее (рис. 1С). Анализ гель SDS-PAGE показал, что только следовые количества транс-сплайсинга продукт присутствовали в окружающей буфера гидрогеля в (рис. 3В, группа J), подтверждая, что потеря сшитого гидрогеля эшафот эрозии является минимальным. Основной данный белок в окружающую буфера гидрогеля является вырезается интеин. Нет видимых признаки эрозии не наблюдалосьспокойно гидрогель погружают в водный раствор при комнатной температуре в течение более 3 месяцев (фиг. 3A впускных). Гидрогель также высокой стабильностью при 37 ° С (рис. 3C), и в обоих кислотных и основных буферов (рис. 3D).
Для облегчения иммобилизации белков, пара белка и его пептидный лиганд был использован для док интерес белков в гидрогель строительных лесов. Мы выбрали белок SH3, в Src гомологии 3 домен из адаптер белка CRK, как док-белка (DP) для слияния с белком интересов, и его лиганда (SH3 маяк) в качестве док-станция пептида (DSP) для включения в гидрогель эшафот. Эта пара взаимодействие было выбрано из-за относительно небольшого размера молекул (56 аа для SH3 и 11 аа для SH3 Лиг) и с высоким сродством (к д = 0,1 мкМ) 17,18. SH3 маяк встраивали между NpuC и CutA сформировать C-SH3 Лига(Табл. 1). Белок SH3 был слит с N-концом модель целевой глобулярного белка, зеленого флуоресцентного белка (GFP) с образованием SH3-GFP. Процесс, описанный в протоколе (раздел 5, фиг.4А) дает гидрогель, содержащий 1,2 мМ транс-сплайсинга гидрогель магистральных строительные блоки и 1,2 мм GFP. GFP-содержащие гидрогель выставлены аналогичную стабильность гидрогеля не хватает GFP (рис. 4, б) с ~ 35% полной потери белка через 21 дней в DPBS буфера. Большинство белков, присутствующих в буфере эрозии были расщепляется интеины. Скорость выщелачивания SH3-GFP из гидрогеля, содержащего Лига SH3 составляет ~ 30% после 3 недель, значительно меньше, чем из гидрогеля, лишенного SH3 Лига (> 70% потери белка в тот же период времени, фиг.4С). Иммобилизованный SH3-GFP в гидрогеле светится в ультрафиолетовом свете. Как видно на рисунке 4D, гидрогеля, содержащего станции Pepti докде SH3 маяк сохраняет большую часть флуоресценции GFP после 3 недель в то время как гидрогель хватает SH3 Лига становится существенно нефлуоресцентный. Ожидается, что использование более высокое сродство DP / DSP пары может еще больше снизить скорость выщелачивания с иммобилизованным белком.
В этом эксперименте GFP был использован в качестве белка-мишени, однако любой DP-меченый белок может быть удобно иммобилизованным в этой гидрогеля. Таким образом, интеин опосредованного белок гидрогель должен дать общее каркас для иммобилизации белков. Плотность иммобилизованным GFP продемонстрировать в этой работе составляет ~ 33% мол гидрогеля. Более высокая плотность иммобилизации может потенциально быть достигнуто, когда множественный DSP включены в гидрогель строительного блока.
Затем фермент HRP была включена в состав белка гидрогеля продемонстрировать свою способность поддерживать Биокатализ в органических растворителях. Активность фермента определяли путем мониторинга окислительного сочетания
_upload/51202/51202fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Интеин опосредованного белок гидрогель. (A) Схемы интеин транс-сплайсинга реакцию, которая вызывает образование длительного белковой цепи (J) с сшивающих белков на обоих концах. Crosslinker белки из нескольких J белковых цепей нековалентно ассоциированной и, по интеина опосредованного белка перевязки, индуцируют образование высоко сшитого сети белка со свойствами гидрогеля. NpuN / C: интеин N-/C-fragment. (B) Смешивание очищенный N и C (8,3% вес / об) приводит к образованию высоко сшитого гидрогеля сеть (1,6 мМ J). Анализ (C) SDS-PAGE очищенного н и С блоками до и после смешивания. "N + C" соответствует образце, взятом непосредственно с 1,6 мМ гидрогеля. "*" Обозначает интеин С-концевой декольте сиде продукт реакции. Интенсивность каждого диапазона количественно с помощью "модуль трассировки в программе" Количество One ". Интенсивность полосы делили на белок молекулярной массы для получения молярного эквивалента эффективности. Транс-сплайсинг (~ 80%) рассчитывали из количества продукта J и непрореагировавший N / C в той же полосе. Печатается с разрешения Журнале Американского Химического Общества. (DOI: 10.1021/ja401075s) Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Плазмидные карты белковых конструкций. (A) CutA-NpuN, (B) NpuC-S-CutA и (C) SH3-GFP (<сильный> Таблица 1), были клонированы в pET26b вектора под контролем промотора Т7. Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Стабильность интеин-опосредованных белковых гидрогели в DPBS. (А) Эрозия профиль гидрогеля 1,6 мм при 22 ° С. Пунктирная линия представляет собой теоретическую массу расщепленных интеинов. Впускной показывает спокойный гидрогель в DPBS в течение 3 месяцев при комнатной температуре. (В) анализ SDS-ПААГ окружающей буфера гидрогеля в. Все образцы буфера, в котором гидрогель был погружен в (А), объединяли (всего 7,5 мл) и концентрировали 75 раз через ультрафильтрации через 10 кДамембрана до геля загрузки J:. интеин транс-сплайсинга продукт N:.. непрореагировавшего CutA-NpuN NpuN: вырезается N-интеин фрагмент. Непрореагировавший C и сращены из NpuC не видны в геле из-за небольшого количества и малого размера (4 кДа), соответственно. Звездочка обозначает неопознанных полосы. (C) Эрозия профиль гидрогеля инкубировали при различных температурах. (D) Эрозия профиль гидрогелей инкубировали при двух различных значениях рН. Печатается с разрешения Журнале Американского химического общества. (DOI: 10.1021/ja401075s) Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 4. Интеин-опосредованной гидрогель поддерживает иммобилизация функциональных глобулярных белков. (А) Схема иммобилизации белков с помощью GFP в качестве модели глобулярного белка. DSP-содержащие гидрогель строительный блок сначала смешивают с DP-слитого белка-мишени для загрузки целевой белок на строительный блок. Дополнительный интеин фрагмента, содержащего гидрогель строительного блока добавляют к смеси при массовом гидрогель с иммобилизованным GFP. (B) Общий профиль эрозии белок из гидрогеля, содержащего 1:01 молярное отношение SH3-GFP. Пунктирная линия представляет собой теоретическую массу сращивания из интеинов. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение 2 независимых экспериментов. (C) Выщелачивание профиль SH3-GFP от гидрогеля с и без DSP. (D) Изображения GFP, содержащей гидрогели под воздействием УФ лучей сразу после формирования гидрогеля и после 21 дней. Печатается с разрешения Журнале Американского химического общества (DOI:. 10.1021/ja401075s) Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 5. Пероксидазой хрена (HRP)-ловушку интеин-срабатывает белок гидрогель облегчает HRP-катализируемой реакции в органическом растворителе н-гептана. (А) Модель реакция катализируется HRP в органических растворителях. (B) Фотография гидрогелей, содержащих инкапсулированный HRP после того, как нарушается на небольшие фрагменты, и инкубировали в реакционной коктейля в течение 10 мин и 30 мин (слева) и контрольном эксперименте с таким же количеством nonimmobilized HRP в DPBS буфера (справа). (C) Образование продукта контролируют по поглощению при 546 нм. Адаптировано с разрешения Журнале Америможет химического общества. (DOI: 10.1021/ja401075s) Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Таблица 1. Белковые конструкции, используемые в этом исследовании.
| Краткое название | Белок Последовательность | МВт (кДа) |
| CutA-NpuN (N) | CutA-EAC-(GGGGS) 2-AS-NpuN-HHHHHH | 26.3 |
| NpuC-S-CutA (С) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(АГ) 3 ПЭГ] 10 -ARMPYV-C UTA- HHHHHH | 26.1 |
| NpuC-S-SH3 маяк - CutA (C-SH3 Лиг) | NpuC-CFNKLYRDPMG-[(АГ) 3 ПЭГ] 10 -ARMPYVGS- PPPALPPKRRR-(GGGGS) 2-AS-CutA-HHHHHH | 28.3 |
| SH3-GFP | SH3-KL-(GGGGS) 2-AS-GFP-HHHHHH | 34.5 |
Печатается с разрешения Журнале Американского химического общества (DOI: 10.1021/ja401075s).
Таблица 2. Буфер композиции.
| Буфер | 500 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0 |
| Буфер Д.А. | 500 мМ NaCl, 8 М мочевины, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0 |
| Буфер B | 500 мМ NaCl, 50 мМ Напои, рН 6,0 |
| DPBS | Дульбекко PBS, 137,9 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1,5 мМ KH 2 PO 4, 8,1 мМ Na 2 HPO 4, рН 7,4 |
Печатается с разрешения Журнале Американского химического общества (DOI: 10.1021/ja401075s).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе мы показали, синтез высокостабильного интеин-опосредованной белка гидрогеля. Использование раскола интеин позволяет гидрогель быть условно образованный в ответ на смешении двух жидкофазных компонентов. В частности, раскол интеин ковалентно связывает два жидкофазных строительные блоки с помощью реакции транс-сплайсинга, уступая полипептидную блок в окружении сшивания блоков, что, в свою очередь самоагрегируется в гидрогеля. Смешивание вызванной формирование гидрогеля обходит технические трудности в синтезе однокомпонентных белковых гидрогели, где могут произойти гель-опосредованной засорение хроматографических колонок очистки. Кроме того, гидрогелевые формы в физиологических условиях без необходимости каких-либо посторонних химических индукторов и / или физических триггеров.
Интеин-опосредованной гидрогель сохраняет высокую стабильность в оба кислотных и основных буферов, и при физиологической температуре. Гидрогели могут образовывать Wiй так мало, как 0,8 мМ каждого строительного блока (данные не показаны), но более высокие концентрации белка (~ 1,6 мм) выход гидрогели с лучшей механической стабильности. Высокая стабильность гидрогеля приписывается к использованию 1) очень стабильный тример белка, CutA, в качестве сшивающего агента, и 2) интеин ковалентно присоединить различные сшивающие агенты. Денситометрический анализ гелей SDS-PAGE, показали, что ~ 80% из входных белков успешно прошел раскол интеин катализируемой реакции транс-сплайсинга.
Для формирования гидрогеля, отдельные строительные блоки сначала концентрируют до ~ 100 мг / мл. Восстанавливающий агент, такой как DTT, должен присутствовать на стадии концентрирования белка, чтобы предотвратить образование межмолекулярных дисульфидных связей. В отсутствие восстанавливающего агента, концентрированный индивидуальное строительство гидрогель блок может иногда образуют гидрогель как материал. Однако это гелеобразный материал быстро растворяется при погружении в буфер и / или в присутствиивосстановителя.
Чтобы получить гидрогель с максимальной стабильности, важно обеспечить, чтобы мольное отношение двух гидрогель строительных блоков составляет 1:1. Любое превышение строительный блок не будет сшитый и может повлиять на механические свойства гидрогеля в. Концентрированный белок должен быть на аликвоты и хранили индивидуально для минимизации повторных циклов замораживания-оттаивания.
Мы также продемонстрировали использование интеина-опосредованного белком гидрогеля в качестве органического растворителя, совместимого биокатализатора. В частности, гидрогели, включающие фермент HRP были погружены в н-гептане, содержащий подложку и успешное превращение субстрата в продукт наблюдалось. Белок гидрогель служит эффективным лесов для биокатализа в органическом растворителе, вероятно в связи с защитой от органических растворителей опосредованного денатурации предлагаемых высоко гидратированного среде гидрогеля.
Одним из ограничений гоэто фермент технологии иммобилизации является необходимость предохранитель целевой белок с док пептида (DP). Эта модификация может влиять на активность и растворимость некоторых целевого белка и поэтому требуют от случая к случаю оптимизацию DP-меченых белков конструкций. Кроме того, небольшое количество меченых белков вымывается из док-станцией пептида (DSP), содержащая гидрогель после 1 недели. Стабильность иммобилизованного белка зависит от аффинности пары DSP / DP. Для достижения большей эффективности иммобилизации, более высокое сродство DSP / DP пара будет необходимо. Наконец, это гидрогелевые экспонаты относительно слабым механические свойства из-за модуля низкий хранения плато (100-200 кПа) 9. Модуль накопления плато зависит от структуры как сшивающий агент и средний блок 19. В текущем гидрогеля, белок, тример был использован в качестве сшивающего агента. Использование сшивателя белка с более высоким мультимерного государства может потенциально увеличить гидрогеля плато йOrage модуль и его механические свойства.
Таким образом, мы сообщаем синтез и характеристику нового белка гидрогеля, что условно образуется при смешении двух жидкофазных строительных белок блоков, каждый из которых содержит половину доли интеин. Интеин-опосредованные белковые гидрогели представляют собой новый перспективный материал с потенциального применения в синтетических ферментативных реакций, органического синтеза, для инъекций доставки лекарств и тканевой инженерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Не существует конкурирующие между собой финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность д-р Дэвид Tirrell (Caltech) за его любезное дар плазмиды pQE9 переменного тока 10 ATRP 12, доктор Том Мьюир (Принстонский университет) за его любезное дар плазмиды KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Доктор Такэхиса Мацуда (Канадзава технологический институт, Хакусан, Исикава, Япония) за его любезное дар плазмиды pET30-CutA-Tip1 10, и д-р Джей Д. Keasling (UC Berkley) за его любезную дар плазмиды pJD757 13 . Эта работа была частично поддержана Национальным научным фондом карьеры, ВВС США Ип и программы Норман Hackman Advanced Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase |
New England BioLabs | M0530S |
|
| Competent Escherichia coli BL21 (DE3) |
New England BioLabs | C2527I |
|
| Luria Bertani |
VWR | 90003-350 |
|
| Bacto Agar Media |
VWR | ||
Kanamycin sulfate |
VWR | ||
| IPTG |
VWR | EM-5820 |
|
| Imidazole |
VWR | EM-5720 |
|
| Urea |
VWR | EM-9510 |
|
| Dithiothreitol (DTT) |
Fisher | BP172-5 |
|
| Protease Inhibitor cocktail |
Roche Applied Science | 11836153001 |
|
| DPBS |
VWR | 82020-066 |
|
| Brilliant Blue R |
Acros Organics | A0297990 |
|
| Sodium Azide |
Fisher | AC190380050 |
Caution, highly toxic |
| Horseradish peroxidase |
Sigma | P8125-5KU |
|
N,N-dimethyl-p-phenylene diamine |
Fisher | AC408460250 |
Caution, highly toxic |
| phenol |
Fisher | AC149340500 |
Caution, highly toxic |
tert-butyl hydroperoxide |
Fisher | AC180340050 |
Caution, highly toxic |
| n-heptane |
Acros Organics | 120340010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaker/Incubator |
Fisher Scientific | Max Q 6000 |
|
| Centrifuge |
Sorvall | RC 6 |
|
| Sonicator |
QSonica | Misonix 200 |
|
| Ultrafiltration Tubes |
Amicon Ultra | UFC903024 |
|
| Ni Sepharose High Performance HisTrap column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5248-01 |
|
| HiTrap SP Sepharose FF ion exchange column |
GE Healthcare Life Sciences | 17-5156-01 |
|
| Plate reader |
Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM |
References
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M.
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE intein from Nostoc punctiforme. FEBS Lett. 580, 1853-1858 (2006).
- Zettler, J., Schutz, V., Mootz, H. D. The naturally split Npu DnaE intein exhibits an extraordinarily high rate in the protein trans-splicing reaction. FEBS Lett. 583, 909-914 (2009).
- Tanaka, Y., et al. Structural implications for heavy metal-induced reversible assembly and aggregation of a protein: the case of Pyrococcus horikoshii CutA. FEBS Lett. 556, 167-174 (2004).
- Sawano, M., et al. Thermodynamic basis for the stabilities of three CutA1s from Pyrococcus horikoshii,Thermus thermophilus, and Oryza sativa, with unusually high denaturation temperatures. Biochemistry. 47, 721-730 (2008).
- Tanaka, T., et al. Hyper-thermostability of CutA1 protein, with a denaturation temperature of nearly 150 degrees C. FEBS Lett. 580, 4224-4230 (2006).
- Shen, W., Zhang, K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Tuning the erosion rate of artificial protein hydrogels through control of network topology. Nat. Mater. 5, 153-158 (2006).
- McGrath, K. P., Fournier, M. J., Mason, T. L., Tirrell, D. A. Genetically directed syntheses of new polymeric materials. Expression of artificial genes encoding proteins with repeating -(AlaGly)3ProGluGly- elements. J. Am. Chem. Soc. 114, 727-733 (1992).
- Ramirez, M., Guan, D., Ugaz, V., Chen, Z. Intein-triggered artificial protein hydrogels that support the immobilization of bioactive proteins. J. Am. Chem. Soc. 135, 5290-5293 (2013).
- Ito, F., et al. Reversible hydrogel formation driven by protein-peptide-specific interaction and chondrocyte entrapment. Biomaterials. 31, 58-66 (2010).
- Lockless, S. W., Muir, T. W. Traceless protein splicing utilizing evolved split inteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10999-11004 (2009).
- Shen, W., Lammertink, R. G. H., Sakata, J. K., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Assembly of an artificial protein hydrogel through leucine zipper aggregation and disulfide bond formation. Macromolecules. 38, 3909-3916 (2005).
- Dueber, J. E., et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat. Biotechnol. 27, (2009).
- Bruns, N., Tiller, J. C. Amphiphilic network as nanoreactor for enzymes in organic solvents. Nano Lett. 5, 45-48 (2005).
- Das, D., et al. Water gelation of an amino acid-based amphiphile. Chem. Eur. J. 12, 5068-5074 (2006).
- Cao, Y., Li, H. Engineering tandem modular protein based reversible hydrogels. Chem. Commun. , 4144-4146 (2008).
- Wu, X., et al. Structural basis for the specific interaction of lysine-containing proline-rich peptides with the N-terminal SH3 domain of c-Crk. Structure. 3, 215-226 (1995).
- Nguyen, J. T., Turck, C. W., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N., Lim, W. A. Exploiting the basis of proline recognition by SH3 and WW domains: Design of n-substituted inhibitors. Science. 282, 2088-2092 (1998).
- Olsen, B. D., Kornfield, J. A., Tirrell, D. A. Yielding Behavior in Injectable Hydrogels from Telechelic Proteins. Macromolecules. 43, 9094-9099 (2010).
