Summary
Gebelik maternal dokuların yağlı asit bileşimine önemli değişikliklere yol açmıştır. Lipid profilleri sıçanlarda, kimlik ve tek tek lipid sınıflarında yağlı asitlerin ölçümü gebelik sırasında çeşitli yüksek ve düşük yağlı diyetler beslenmiştir izin vermek için gaz kromatografisi ile elde edilebilir.
Abstract
Gaz kromatografisi (GC), yüksek hassasiyet ve yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ile sonuçlar alındı, dokular, hücreler ve plazma / serum Lipidlerin yağlı asit içeriğini belirlemek ve ölçmek için kullanılan bir çok hassas bir yöntemdir. Metabolik ve beslenme çalışmaları GC sağlar müdahaleleri aşağıdaki yağ asidi konsantrasyonlarında veya gebelik gibi fizyolojik durumuna değişiklikleri sırasında değişikliklerin değerlendirilmesi. Aminopropil silis kartuşları kullanılarak katı faz ekstraksiyon (SPE) sağlar Triasilgliserollerin, farklı fosfolipidler ve kolesteril esterleri (CE) de dahil olmak üzere başlıca lipid sınıflarının ayrılması. SPE ile birlikte GC çeşitli yüksek ve düşük yağlı diyetler ile beslenmiş olan bakir ve hamile sıçanların karaciğerlerinde CE fraksiyonun yağ asidi bileşimi değişiklikleri analiz etmek için kullanıldı. Karaciğer CE omega-3 ve omega-6 yağ asit içeriği üzerine önemli beslenme / gebelik etkileşim etkileri hamile kadın diyet manipulat farklı bir tepki olmadığını belirten vardırdaha iyon bakire kadınlarda görülür.
Introduction
Gaz kromatografisi (GC) takviyesi veya fizyolojik obezite gibi koşullarda (ve diyabet gibi ilişkili hastalıklar) veya gebelik süresince 3 lipid havuzları ve hücre zarları 1,2 yağ asitlerinin dahil edilmesini belirlemek ve ölçmek için kullanılan bir köklü bir tekniktir - 5. Ayrıca, gıdalarda türleri ve yağların miktarları analiz için uygundur. Deneysel diyetler karakterize yanı sıra, gıda sanayi yönetmeliklerine uygunluğunu sağlamaya yararlıdır. Örneğin, GC etiketleme doğru olan ve düzenlemelerin, 6,7 yapıştırılır sağlamak için bir besin takviyesi olarak bir ürün içinde kimlik ve yağ asitlerinin miktarını doğrulamak için kullanılabilir. Yağ asitlerinin Analizi sağlığı ve hastalıkları, diyet değişikliği etkisi ve fizyolojik durumuna 8 değişikliklerin etkisi lipid metabolizması içine değerli bilgiler sağlayabilir. Gebelikte örnekleri çalışmak için GC kullanımı önemli sağladıyağ asidi ve kompleks lipid homeostazı 3 değişiklikler hakkında bilgi.
Kromatografik ayırma öncesinde, yağlar, genellikle kloroform ve metanol çözücü karışımları lipidlerin çözünürlüğünü kullanarak numuneden ekstre edilmiştir. Sodyum klorür fazları 9,10 ihtiva eden sulu ve organik lipid olarak karışımın ayrılmasını kolaylaştırmak üzere eklenir. Ilgi Kompleks lipid sınıfları, katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile, toplam lipid ekstreden ayrılabilir. Bu ayırma işlemi, teknik polaritelerine veya bağlanma afinitesine bağlı olarak lipid sınıfları çözülür. Triacyglycerols (TAG) ve kolesteril esterleri (CE) kombine bir fraksiyon, bundan başka sınıfları, fosfatidilkolin (PC) gibi ilk önce elüte edilir, fosfatidiletanolamin (PE) ve esterleşmemiş yağ asitlerinin (NEFA) yıkama çözücünün artan polarite ile taşınacağı . CE gelen TAG ayrılması sadece taze bir SPE cartri için TAG bağlanma yararlananDGE, CE elüt edilmesi için izin verir. TAG daha sonra elüsyon solvent 9,10 polaritesinin artırılması ile elüte edilebilir. Bu yöntem, daha yüksek bir verim ile eş zamanlı olarak ayrılması için çok sayıda örnek, nispeten küçük boyutlu örnekler (örneğin <100 ul plazma ya da serum, <100 mg doku) 11,12 analiz edilebilir, yani, ince tabaka kromatografisi ile elde edilmesine izin verir.
GC ilk olarak 1950 de tarif edilen bir köklü bir tekniktir, bu daha sonra, sıvı-sıvı sistemlerinde, mobil faz, buhar ile değiştirilebilir önerildi. Bu, ilk olarak petrol analizi için kullanılabilir, ancak bu tür hızlı bir şekilde, amino asit analizi ve büyük ilgi halen lipid biyokimya gibi başka alanlara genişletilmiştir. Örneğin daha önce kullanılan paketlenmiş sütunlar kılcal sütun gelişme olarak GC ekipman ve teknolojisindeki gelişmeler, yağ asitleri için mümkün olduğu mevcut tekniklere açmıştırGC rutin araştırmalar 13 arasında geniş bir aralıkta yağlı asitleri belirlemek ve ölçmek için kullanılan ile sonuçlanan daha düşük sıcaklıklarda daha verimli bir şekilde ayrılır.
GC bunlar termal ayrışma olmadan, makul sıcaklıklarda elüt için yeterince uçucu olabilir bu sırayla türetilebilir için yağ asitleri gerektirir. Bu analiz için, genellikle esterler, tiyoesterler veya amidleri oluşturmak için hidrojen içeren fonksiyonel bir grubun ikamesi içerir. Metil esterleri yaygın metilasyon tarafından üretilen türevleri, incelenmiştir. Bu yöntemde, kompleks lipidler içindeki ester bağları yağlı asit metil esterleri (FAME) oluşturmak için transmethylated olan serbest yağ asitlerini, serbest bırakmak için hidrolize edilmektedir. GC ile belirlendi FAME profili elde edilen, yağlı asit bileşimi olarak adlandırılır ve kolay bir şekilde farklı deney grupları 9,10 arasında karşılaştırılabilir. Teknik olanak Tek sıralamada oranlarını hemual yağ asitleri ve bunların konsantrasyonları, ölçülecek.
Beslenme çalışmalarında ve gıda endüstrisi içinde yağ asitleri analiz etmek için GC kullanımına ek olarak, teknik, analitik alanlarda geniş bir aralığında kullanılabilir. Örneğin, GC kullanılarak çevre analizleri böcek ve toprak su kirlenmesini ölçme içerir chlorobenzene içeriğini ölçme analiz eder. Toksikoloji, GC de idrar ve bireylerin kan örneklerinde yasadışı maddeleri tanımlamak için kullanılır olmuştur, bu tür bir spor performans artırıcılar 12 ve hidrokarbonların kompleks karışımlarını ayırmak için yeteneği petrokimya analizi 12 için petrol sektöründe bu tekniği popüler hale getirir.
Gebelik, özellikle omega-3 içeriği maternal dokuların yağlı asit bileşimine önemli bir değişiklik, (n-3) ve omega-6 (n-6) çoklu doymamış yağ aci ile ilişkilids (PUFA) 3. Mevcut çalışmada, farklı yağ kaynakları ile, düşük ve yüksek yağlı diyet ile beslenmiştir bakir ve hamile sıçanlardan alınan karaciğer dokusu yağlı asit bileşiminin analizinde kullanımını açıklayan yağ asitlerinin ölçümünde GC kullanımını örnekler. Burada sağlanan deneysel diyetler, düşük yağlı soya yağı bazlı diyet, yüksek yağlı soya yağı bazlı diyet (130.9 g toplam yağ / kg toplam yağ) veya yüksek yağ bezir yağı bazlı diyet (130.9 g toplam yağ / kg idi 20 gün için sağlanan beslenme). Bu diyetler tam besin ve yağlı asit bileşimi, daha önce 14 tarif edilmiştir. Soya fasulyesi yağı diyeti linoleik asit (18:2 n-6) açısından zengindir ve keten tohumu yağı diyeti, α-linolenik asit açısından zengin iken, bir α-linolenik asit (18:03 n-3) içerir. Bu yüksek-yağlı diyetler, linoleik α-linolenik asit için (sırasıyla, 8:01 ve 01:01 arasında katyonları), farklı yem oranlarını temsil eder. Bireysel lipid sınıfları ve GC ile analiz izolasyonu için bir yöntem olup bizll oluşturulmuş ve valide, ve daha önce 10 ama burada bulunan ayrıntılı teknik açıklama olmadan yayımlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hayvan Prosedürleri
- Tüm hayvan çalışmaları Home Office Hayvanlar (Scientific Procedures) Act (1986) göre yapılmalıdır.
- Tekeşli ıslah tarafından eski 10 hafta arası Wistar sıçan Mate, ve vajinal tamponun görünümü ile gebelik onaylayın. Gebelik günü 1 olarak kaydedin, ve deneysel diyet başlar. Bakire kadın için, tek tek her bir sıçan ev ve deneysel diyet başlar.
- 20 gün boyunca deney diyetlerinin besleme sonra servikal dislokasyon takiben CO2 ile boğularak sıçan euthanize.
- Karın boşluğu ortaya çıkarmak ve diyaframa karaciğer bağlamak bağ, karın ön duvarı, mide ve onikiparmak bağırsağı keserek karaciğer çıkarılması için diseksiyon forseps ve makas kullanın. -80 ° C'de depolamadan önce PBS içinde karaciğer yıkayın ve sıvı azot içinde dondurularak
2. Bir Toplam Lipid hazırlanması ekstrakte 9
- Molekül Eklear elekler 'kuru' solventler oluşturmak için tüm solventler (çözücü kabın 1/10 doldurmak için). davlumbaz içindeki tüm solvent çalışmaları yürütmek.
- Yaklaşık 100 mg donmuş karaciğer kesin ve tartın. Bir buz kovası bir tüp içine doku yerleştirin ve 0.8 ml buz gibi soğuk% 0.9 NaCI ekleyin. Doku homojenize.
- Kuru kloroform içinde 1 ml / mg içerisinde çözündürüldü iç standartları ekleyin: metanol (2:1, v / v) butile hidroksitoluen (BHT, 50 mg / l) ihtiva eden bir anti-oksidan olarak. Rat karaciğer 100 mg standart CE 100 mikrogram eklemek için (Kolesteril 17:00 heptadekanoat) Dikkat:. Kloroform ve BHT tehlikelidir.
- 5,0 ml kuru kloroform ekleme: metanol (2:1, v / v), BHT (50 mg / L) ihtiva etmektedir.
- , 1.0 ml 1 M NaCl ekle karışım formasını görünüyor kadar vorteks ile iyice karıştırın. Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
- 10 dakika oda sıcaklığında düşük fren 1000 xg'de santrifüj.
- Alt toplayınbir cam Pasteur pipet kullanılarak faz, 40 ° C'de nitrojen altında, yeni vidalı kapaklı cam tüp ve kuru transfer Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
3. Katı Faz Ekstraksiyon tarafından Lipid Sınıflar ayrılması (SPE) 10
- Bir vakum pompasına SPE tankı bağlayın ve tank aminopropil silis SPE kartuşu yerleştirin.
- İlk fraksiyon toplamak için sütunun altında tankı rafa yeni vidalı kapak cam tüp etiketli TAG ve CE yerleştirin.
- 1.0 ml kuru kloroform ve girdap toplam lipid ekstresi çözülür.
- , Bir cam Pasteur pipet kullanılarak kolona örnek uygulanır ve yerçekimi altında vidalı kapaklı bir tüp içine üzerinden akmasına izin verilir. Başka damlar düştüğünde, vakum kalan sıvı çıkarın.
- Kuru kloroform içinde 2 x 1.0 mi yıkama ile sütun yıkama, vakum altında TAG ve CE fraksiyonu Zehir.
- Tüm sıvı kaldırıldığında, TAG ve CE fractio kuru40 ° C'de azot altında n Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
- Sütununda tankı tepsisine yeni vidalı kapak cam tüp etiketli PC yerleştirin.
- 2 x 1.0 ml kuru kloroform ilavesiyle, vakum altında PC fraksiyonu Zehir: metanol (60:40, v / v) tüm sıvı sütundan çıkarılır kadar.
- 40 ° C'de nitrojen altında çıkarın ve kuru PC fraksiyon Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
- Tank tepsiye yeni bir vidalı kapak cam tüp PE etiketli yerleştirin ve vakum altında 1.0 ml kuru metanol ilavesiyle PE fraksiyonu elüte.
- 40 ° C'de nitrojen altında çıkarın ve kuru PE fraksiyon Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
- Tank tepsiye yeni bir vidalı kapaklı cam tüp etiketli NEFA koyun ve kuru kloroform içinde 2 x 1.0 ml yıkama eklenmesiyle vakum altında NEFA fraksiyonu elüte: metanol: glasiye asetik asit. (100:2:2, v / v / v) Dikkat: Buzlu asetik asit tehlikelidir.
- 40 ° C'de nitrojen altında toplandı NEFA fraksiyonu ve kuru kaldırma Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
- SPE tank üzerine yeni bir ammopropil silika SPE kartuşu yerleştirin ve atık toplamak için kartuşun altına tankı tepsisine bir vidalı kapak cam tüp yerleştirin.
- 3, vakum altında kuru heksan ile yıkama ve yer çekiminin etkisi altında daha sonra 1.0 ml nihai bir yıkama ile sütun yıkayın. . Kartuş (hekzan düzeyi kartuş matris yakınken bir kapalı konuma kartuş kolon kanalları açmak) Dikkat kuru olmasına izin vermeyin: Hekzan tehlikelidir.
- Yeni vidalı kapak cam tüp etiketli CE ile atık borusunu değiştirin.
- Kuru heksan ve girdap 1.0 ml (adım 3.6 hazırlandı), kurutuldu ve TAG CE fraksiyonu çözündürülür. , Bir cam Pasteur pipet kullanılarak kolona uygulanır ve bu gr altmda damla izinRavity.
- Başka bir damla düştüğünde, vakum altında kalan sıvı boşaltılır.
- Vakum altında, 40 ° C'de nitrojen altında kuru CE ve toplanan fraksiyonun elüsyonu için kuru heksan 2 x 1.0 mi yıkama ile sütun yıkayın Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
- Kuru heksan 2 x 1.0 ml yıkama ilavesi ile tank tepsi ve elute TAG yeni vidalı kapaklı cam tüp etiketli TAG Sıra: metanol: etil asetat (100:5:5), vakum altında.
- 40 ° C'de nitrojen altında kuru fraksiyon toplandı . Numuneler bir hafta kadar Dikkat kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de muhafaza edilebilir: Etil asetat tehlikelidir.
4. FAME hazırlanması CE 10
- . Ayrılmış CE fraksiyonu (adım 3.19 toplanan) ve girdap Dikkat kuru toluen içinde 0.5 ml ilave edilir: Toluene tehlikelidir.
- % 2 (v ile metilasyon reaktifi hazırlayın (kuru metanol/ V), 1.0 ml numune başına gerekli olduğu H 2 SO4). Cam veya kapaklı uygun bir plastik kap içine kuru metanol hacmi dağıtın ve SO 4 damla damla sonra Dikkat ters çevirme ile karıştırın H 2'nin gerekli miktarda ekleyin:. Sülfürik asit tehlikelidir.
- Kuru toluen içinde çözüldü numunelere metilleme reaktifi 1.0 ml ilave edilir, güvenli bir şekilde tüpler kapak, yavaşça karıştırın.
- 50 ° C'de 2 saat boyunca ısıtılır örnekleri
- 2 saat sonra ısı tüpleri kaldırmak. . Potasyum bikarbonat ve potasyum karbonat zararlı: Bir kere soğuk çözeltisi (0.25 M KHCO 3 0.5MK 2 CO 3) Dikkat nötralize 1.0 ml.
- 1.0 ml kuru heksan ve vorteks ekleyin.
- 2 dakika, oda sıcaklığında düşük bir fren boyunca 250 x g'de santrifüjleyin.
- FAME içeren üst faz, toplamak ve yeni bir non-vidalı kapak atılabilir cam tüp içine aktarın.
- Altında toplanan FAME Kuru40 ° C'de azot Numuneler bir hafta için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
5. CE FAME 14 Free Kolesterol Kirlilik giderimi
(Free Kolesterol örnek kontamine edebilir, ve serbest kolesterol çıkarmadan örnek kromatografının izleri bkz. Şekil 1).
- SPE tanka atık tüp yerleştirin ve tankın üzerine bir silika jel SPE kartuşu yerleştirin.
- Vakum altında kuru heksan, 3 x 1 ml yıkama ve yerçekimi altında 1 x 1 ml 'si ile sütun yıkayın.
- Atık yıkar çıkarın ve depoya yeni atık tüp ekleyin.
- 1 ml kuru heksan, girdap CE FAME çözülür.
- , Bir cam Pasteur pipet kullanılarak kolona uygulanır ve yer çekiminin etkisi altında boyunca akmasına izin verilir.
- Vakum altında heksanın 3 x 1 mi yıkama ile sütun yıkayın.
- Atık yıkar çıkarın ve tank etiketli CE FAME yeni olmayan vidalı kapak tüp yerleştirin.
- Zehir2 x 1 ml kuru heksan ile CE FAME: dietil eter (95:5 v / v) yıkama.
- 40 ° C'de nitrojen altında kuru . Numuneler bir hafta kadar Dikkat kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de muhafaza edilebilir: Dietil eter tehlikelidir.
6. GC Otomatik Numune şişenin içine FAME transferi
- , Vorteks örnek ve bir GC otomatik numune şişesine transfer etmek için 75 ul kuru hekzan ekleyin.
- , Örnek vorteks ve aynı GC otomatik numune şişesine aktarmak için bir başka 75 ul kuru hekzan ekleyin. Numuneler, bir ay kadar için kapatılmış ve bu aşamada -20 ° C'de saklanabilir.
7. Gaz Kromatograf 14 ile Analiz
- Bir gaz kromatografisinde FAME analiz. Örnek kurmak: 30 mx x 0.25 mm 0.25 mikron BPX-70 sıcaklık protokolü ile erimiş silika kapiler kolon:
Başlangıç sıcaklığı 115 ° C, 2 dakika tutma, rampa 10 ° C / dk ila 200 ° C, 245 ° C 18.5 dk, rampa 60 ° C / dk süreyle, hEski 4 dk.
Sütun: Helyum gazı, akış hızı 1.0, basınç 14.6 ve hız 29.
Enjektör: Sıcaklık = 300 ° C
Dedektör: Hidrojen akış 40.0, hava sıcaklığı = 300 ° C, 45,0 akış, gaz Helyum makyaj, 184,0 akış - (CE FAME analiz için örneğin 25:1) uygun olarak ayarlayın split oranı.
- Uygun bir yazılım kullanarak her bir tepe noktasının altındaki alanın belirlemek ve standartlar ile karşılaştırılarak tespit FAME. Örnek Kromatogramlarda için Şekil 2'ye bakınız.
- Toplam yağ asitlerinin bir yüzdesi olarak tek tek yağlı asitlerin katkı hesaplamak için zirve veri altındaki alanı kullanın.
- Miktarı ile iç standardın alanına bölünmesi ile yağ asitlerinin mutlak konsantrasyonlarını hesaplamak ilave edildi. Kullanılan doku miktarı içinde her yağ asidi mutlak konsantrasyonları elde etmek için, bu sonuç, her bir yağ asidinin alanı bölün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntemin başarısı tam protokolü takip ve "gürültü" ve kromatogramda görünebilir kirlenmesini azaltmak amacıyla temiz çözücüler ve reaktifler kullanılarak bağlıdır. Kirlenmiş örnekleri eğri hesaplamaları altındaki alanın doğruluğunu düşürücü, analiz etmek için daha zor bulunmaktadır. Açık protokol simetrik, iyi tanımlanmış zirveler ve minimal arka plan gürültüsü ile başarılı bir kromatogramını takip edilirse, Şekil 3'te gösterildiği gibi elde edilmelidir. Kirlenme meydana gelmiş ise kromatogramıdır ek tepe noktaları gösterir ve Şekil 4 'de gösterildiği gibi, simetrik olmayan (eğik) tepe noktaları sergilerler. Kolesterol çıkarılmadıkça Protokol 5'te tarif edildiği gibi) (bkz. Şekil 1 (CE türetilmiş FAME çalışırken, serbest kolesterol kirlenme meydana gelir.
Hazırlanmış bir kalibrasyon karışımı kullanımı, th FAME tanımlanması için izin verire örnek. Kalibrasyon karışımı kromatogram, Şekil 2'de gösterildiği gibi doğru bir şekilde, tutma süreleri ile belirlenmiştir ve numune tepe göre böylece, örnek olarak aynı cihaz ayarlarını kullanarak çalıştırılır.
Tepe alanı içindeki belirli toplam yağlı asitlerin yüzdesini hesaplamak için kullanılır. Veri toplanmıştır sonra, Şekil 5'te gösterildiği gibi aykırı olup olmadığını kontrol için yararlıdır. Aykırı örnekler ilerki araştırılmalı ve gerekirse çıkarma ve / veya analiz tekrarladı.
(Protokol aşama 2.3 'de tarif edildiği gibi) örnekleri için bir iç standart ekleme iç standart tepe ilgilenilen pikinin alanına göre ve bilinen miktarda alanını kullanarak hesaplamalar ile numune içindeki yağlı asitlerin ölçümü düzeltmesine izin verir Orijinal örnek hacmi veya ağırlık. Tablo 1, sıçan karaciğer CE içinde FAME bir olarak tarif edilirCE, karaciğer içindeki toplam yağlı asitlerin (g/100 g toplam yağ asit) oranında. Bu veriler, üç farklı diyetler üzerinde 20 gün boyunca beslenen saf veya gebe farelerin karaciğerinde CE yağ asitleri tarif eder. Iki faktörlü ANOVA (faktörleri: beslenme, hamile bakire vs) kullanılarak istatistiksel analizi çeşitli yağ asitlerinin oranı, hem de önemli bir diyet x gebelik etkileşimler (Tablo 1) üzerine diyet ve gebelik önemli etkiler ortaya koymaktadır. Gebe sıçanlara karaciğer CE içeriği daha bakire kadınlarda daha diyet etkilenir, bir örnek olarak, Şekil 6, arakidonik asit (20:4 n-6 AA) olduğunu göstermektedir.
Şekil 1.. Sıçan karaciğer dokusunda serbest kolesterol kaldırılması önemini gösteren özdeş örnekleri Karşılaştırmalı gaz kromatogramlandır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Hazırlanmış bir kalibrasyon karışımını kullanarak sıçan karaciğer dokusundan örnek CE FAME tanımlamak için kullanılan yöntemin Şekil 2.. Örnek. Bir prepared kalibrasyon karışımı kromatogramlar numune içindeki yağ asitlerini belirlemek için karşılaştırılabilir böylece numune aynı olan alet ayarları kullanılarak çalıştırılır. Kalibrasyon karışımı için birlikte kromatogramı karışımında FAME etiketlenmesine izin verir. Bu etiketlenmiş iz sonra kolayca tanımlanabilir büyük Tepeler daha sonra, uygun şekilde etiketlenmiş kalibrasyon karışımına kişilerce kendi tutma süreleri ile karşılaştırılabilir numuneden kromatogram ile karşılaştırılabilir. Örneğin iz vurgulanmış. 16:00 yağ asitlerinin doğru etiketlenmesini sağlayan aşağıda örnek izleme yağ asitlerinin yukarıda kalibrasyon karışımı tutma kez karşılaştırma göstermek için. olan büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 4. Insan plazmasından elde edilen bir kirli gaz NEFA kromatogramın örneği. Gerçek tepe entegrasyonunu etkileyebilir numunenin başında daire gibi birçok beklenmedik tepe, vardır. Towar görüldüğü gibi zirveleri kesilir ve tanımsız daire olarak örnek sonunda ds ve eğimli bir hale gelmiştir. Bu eğri hesaplamaları ve bu yağ asitlerinin miktarının altındaki alanın doğruluğunu etkileyecektir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 5,. Bakire sıçanlarda karaciğer CE yağlı asit bileşimi arasında aykırı değer verilerinin tanımlanması, bir yüksek yağlı diyet soya fasulyesi yağı (n = 6). Bu analiz yağlı asitlerin yüzde verileri belirsiz sonuçlar belirlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir beslenir. Bu veriler örnek 125 bir uç değer olabileceğine işaret ve daha fazla araştırma gerektirmektedir. CE içindeki beş ana yağ asitleri (16:00, 18:00, 18:01 n-9, 18:2 n-6, 20:4 n-6) gösterilmemiştir.. Jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 6,. Bakire ve hamile sıçanlarda, karaciğer CE araşidonik asit içeriği, Değerler ± SD araçlardır. Deneysel diyetler beslenen n = 6. Ortak bir mektup olmadan gelir, P <0.05 farklıdır. * Eşleştirilmiş diyet grubunda, p <0.05 olan bakir kadınlarda farklıdır. Bu bu aynı diyetler beslenen gebe farelere kıyasla çeşitli diyetler beslenen bakire sıçanların karaciğer CE içeriğinde farklılıklar gösteren Tablo 1'den sonuç görsel bir sunumudur. Farklar bakire ve hamile sıçanlar arasındaki her besin grubunda görülebilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Tablo 1. Bakir ve gebe farelerin sıçan karaciğer kolesteril esterlerin yağ asidi bileşimi, Değerler ortalama (SD) bulunmaktadır. Deney diyeti ile beslenen n = 6. ND (<% 0.1 ortalama) tespit olmadığını gösterir. Bakire ya da gebe kadınlarda içinde ortak bir mektup olmadan gelir, P <0.05 farklıdır. * Eşleştirilmiş diyet grubunda, p <0.05 olan bakir kadınlarda farklıdır. Bu tablo, bakir ve hamile farelerde beslenen düşük ve değişken bir yüksek yağlı diyetler karaciğer dokusunda mevcut n-3 ve n-6 yağ asitleri, ortalama değerleri gösterir. Sonuçlar istatistiksel olarak P anlamlılık düzeyinde <bakire ve hamile sıçanlar arasındaki farklar için 0.05 ile varyans (ANOVA) kullanılarak analiz edildi, beslenme ve diyet x gebelik etkileşim türü. ANOVA sonuçlar bakire ve m içinde hamile farelerde arasında arakidonik asit düzeylerinde anlamlı farklar (20:4 n-6) vardır önermekatched diyet grupları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gaz kromatografisi yağlı asit analizi için kullanılacak doğru bir tekniktir, ve yüksek tekrarlanabilirliği klinik analizler için müsait bu tekniği görmektedir. Uygun GC sütun mevcut sütun durağan faz, kolon uzunluğu ve iç çapı polaritesine varyasyonlara sahip olan, ilgi konusu olan yağlı asitleri tanımlanmasını sağlamak için kullanılmalıdır. Bu analiz yönteminde, bir kaynaşık silika kılcal kolonunun kullanılması, iyi bir termal stabilitesi ve yüksek yüzey inertlik ve iyi çözünürlük 8 nedeniyle tutma kez yüksek tekrarlanabilirlik sağlamaktadır.
Bu protokol kapsamında kritik adımlar alt ve üst faz toplama adımları (protokol 2,7 ve 4.8 adım) içerir. Bu doğru fazın çok istenmeyen herhangi bir faz ile kirlenme olmadan, mümkün olduğu toplanan önemlidir. Bir numune içinde kirleticilerin varlığı istenmeyen bir kromatografik çıkış neden olurŞekil 2'de gösterildiği gibi. SPE boyunca CE toplama zaman kartuş sütun numune TAG gelen CE başarı ile ayrılmasına izin vermek üzere sütun nüfuz sağlamak için heksan ile yıkama takip çözücü (basamak 3.15) ile doyurulmuş tutulması zorunludur. Serbest kolesterol kaldırmak için CE ayrıca ayrılması, Şekil 1 'de gösterildiği gibi kromatografi izlerini görünen kirlenmesini önlemek için önemlidir. Vakum altında sıvının çıkarılmasını gerektiren adımları tüm sıvı tamamen iyi bir verim sağlamak için sütundan çıkarılır ve ardından çok hassas olmasını sağlamak için de önemlidir.
GC ana sınırlama bu tür fosfolipidler ve triacyglycerols gibi kompleks lipidler analizden önce FAME oluşturmak üzere türetilmesinden önce saponifiye edilmesi, bu yüzden bu yağların ve yağlı asitlerin tipik kombinasyonlarının özel yapılar modülleri 10 kaybolur ihtiyaç vardır. Tüm adımlarBu protokol, bu yöntem, bu yöntem içeri gerçekleştirilebilir çevresinin uygunluğunu sınırlar çözücüler kullanımı nedeniyle duman başlığı içinde gerçekleştirilmelidir da numune az sayıda analiz etmek için zaman alıcı olabilir, tipik olarak iki çalışma günü alarak tam otomatik işlemleri kullanılmadığı sürece, veri çıkışı ilgilendiren örnek olsun. Numunelerin daha fazla sayıda işlerken Ancak, her aşamada diğer kullanıcılara ekipman bu teknik ve kullanılabilirlik zaman etkinliğini maksimize etmek için gruplar halinde yapılabilir. Protokolü içerisindeki bazı teknikler sorunlu eklemler ile kişi veya kim tekrarlayan hareketlerin olumsuz etkilerine eğilimli bir sorun olabilir, (2,7 ve 4.8 adım) gibi üst ve alt faz ekstraksiyon gibi uygulama ve el becerisi gerektirir.
Bu yöntem içinde Adım kolayca numunesinin geniş bir aralığı için ilave veya farklı fraksiyonların toplanmasını kolaylaştırmak için çıkarılabilirs, plazma analiz edilirken, örneğin PE toplama gerekli olmayabilir, ama hücre ve doku örneklerinin 10 ilgi çekmektedir. Bu yöntem, aynı zamanda, arzu edildiği takdirde SPE adımları ihmal edilebilir toplam lipid özler, hücrelerin analizi için modifiye edilebilir. Böyle bir değişiklik, toplam lipid çıkarma adımı atlar gibi SPE 15 adım kırmızı kan hücreleri için tarif edildiği gibidir. Mevcut protokol aksine, bu çalışmada kullanılan yöntem, bir metilleme reaktifi 250 ul 250 ul heksan ve 100 ˚ C'de 10 dakika boyunca ısıtıldı ile birlikte kırmızı hücrelerin doğrudan ilave edilir (% 14 boron triflorit) kullanır Nötralizasyon aşaması atlanmıştır ve bunun yerine, su ve heksan ilave edilir, örnek daha sonra santrifüj edilir ve heksan üst faz toplandı ve bir GC otomatik örnekleyici şişe içine doğrudan transfer nitrojen altında kurutmadan ve heksan içinde yeniden çözülmesi.
GC çok yönlü bir yöntemdir ve rel sağlarMevcut modifikasyonlar 15 ve bir dizi iable sonuçlar örneklerinin çeşitli analiz etmek için kullanılabilir. Atomik kütle karşıt olarak etiketlenmesi için bir tutma süresine kullandığı gibi yapısal olarak benzer yağ asitleri ayırt etmek mümkün olduğu gibi n-6 ve n-3 yağlı asit metabolizması analiz zaman kütle spektrometresi üzerinde avantajlara (MS) sahiptir. MS bir örnek içindeki yağ asitleri tespit edebilmek, ancak stereo-çift bağ pozisyonlarını ayırt edemiyor ve dışında bazı yağ asitleri anlatmak nedenle değiştiremiyor. Gerekirse, her iki yöntem, GC-MS 16 tarafından art arda kullanılabilir. Bu teknik, lipid metabolizması ve lipidomics alanında işlev araştırma sırasında kullanılır. Bu GC farklı sabit faz kullanımıyla yağ asidi kimlik manipülasyon yağ asitleri arasında ayrım sağlar gibi MS ile birlikte GC kullanımı büyük ilerlemelere yol açmıştır yalnız MS olamaz. GC da elektron darbesi kütle spektrometrisi ile kombinasyon halinde kullanılabilirBu tür pikolinil esterler gibi alternatif bir kimyasal türevleri ile birleştirildiğinde yağ asitlerinin tanımlanması için gereklidir (EI-MS),. Bu tekniğin kullanımı genişler ve bu fizyoloji, klinik biyolojik algılama ve patoloji, hem de lipid biyokimya 17 gibi alanlarında aralığında bir araştırma yöntemi olarak lipit profil geliştirmeye devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.
Acknowledgments
Yazarlar sıçan çalışmaya Meritxell Romeu-Nadal katkısını kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| BHT | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns - 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns - 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6 mm |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 |
References
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- American oil chemists society. Gas chromatographic analysis of molecular species of lipids. , The Oily Press, Inc. Available from: http://lipidlibrary.aocs.org (2013).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. Quantitative chromatographic analysis. , Marcel Dekker. New York, NY. Part. (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P.
- Childs, C. E. The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , University of Southampton, School of Medicine. Available from eprints.soton.ac.uk 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Rohwedder, W. K. Mass spectrometry of lipids (USDA). Northern Regional Research Laboratory ARS. , Available from: ddr.nal.usda.gov/bitstream/10113/29457/1/CAIN769045540.pdf (2013).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
