Summary
Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende> 6 maanden.
Abstract
Borst ductaal carcinoma in situ (DCIS), per definitie, is de proliferatie van neoplastische epitheelcellen binnen de grenzen van de borst kanaal, zonder dat de collagene basaal membraan. Terwijl DCIS is een niet-obligate voorloper van invasieve borstkanker, zijn de moleculaire mechanismen en celpopulaties die progressie mogelijk invasieve kanker niet volledig bekend. Om te bepalen of voorlopercellen kunnen invasie bestond in het DCIS celpopulatie, ontwikkelden we een methode voor het verzamelen en kweken steriele menselijk borstweefsel ten tijde van de operatie zonder enzymatische verstoring van weefsel.
Steriele borstweefsel met ductaal segmenten wordt geoogst van chirurgisch weggesneden borstweefsel volgende routine pathologisch onderzoek. Weefsel dat DCIS wordt in voedselrijk antibioticum-bevattende serumvrij medium, en naar de weefselkweek laboratorium. Het borstweefsel is verder dissected te isoleren van de verkalkte gebieden. Meerdere borstweefsel stukken (organoids) worden in een minimaal volume van serumvrij medium in een kolf met een afneembaar deksel en gekweekt in een bevochtigde CO2 incubator. Epitheliale en fibroblast celpopulaties komen uit de organoïde na 10-14 dagen. Mammospheres spontaan op en rond de epitheliale cel monolaag. Specifieke celpopulaties kunnen direct uit de fles worden geoogst zonder verstoring van naburige cellen. Onze niet-enzymatische weefselkweek systeem betrouwbaar onthult cytogenetisch abnormale, invasieve stamcellen uit verse menselijke DCIS laesies.
Introduction
Proliferatie van epitheelcellen binnen de grenzen van de borst leidingen en alveoli (ductaal carcinoma in situ) wordt erkend als een obligaat voorloper van invasief ductaal en lobulair mammacarcinoom. Niettemin worden de moleculaire mechanismen en dynamiek celpopulatie die progressie mogelijk invasieve kanker slecht begrepen. Ophelderen van de survival mechanismen die door pre-invasief mammacarcinoom cellen, of een pre-invasieve tumor, kan therapeutische strategieën te onthullen voor het doden of zelfs voorkomen, pre-invasieve tumoren 1. Er zijn echter eenvoudige goedkope methoden voor functionele studie van de menselijke pre-invasieve laesies ontbroken. Hoewel in vitro monolaag kweek van getransformeerde cellijnen is een gevestigde laboratoriummethode, het fenotype en genotype van deze geïmmortaliseerde cellijnen niet de moleculaire toestand van primaire humane tumorcellen 2 recapituleren. Bovendien, ook de niet-tumorverwekkend MCF-10A cellijn, die recapitulates 3-D borstklier architectuur, niet de functionele fenotype en moleculaire kenmerken van pre-invasieve borstlaesie individuele patiënt 3,4 voldoende mate overeenkomen.
Om te bepalen of stam-achtige neoplastische cellen dat invasie bestaan binnen de ductale carcinoma in situ (DCIS) celpopulatie, ontwikkelden we een methode voor het verzamelen en kweken steriele menselijk borstweefsel ten tijde van de operatie (figuur 1) 5. Onze ex vivo borst organoïde cultuur systeem maakt geen gebruik van enzymatische weefsel verstoring, basaalmembraan uithaalmatrix, of fibroblast uitputting, voor het isoleren en het uitdragen-mammosphere vormende cellen uit verse menselijke borst carcinoom weefsel 6-8. Ons nieuwe systeem is gebaseerd op het principe van de cel streaming / migratie 5. De waarneembare borstkanalen en omliggende stroma worden ondergedompeld in een minimum volume van serum-vrij voedingsbodem (gewoon enough dekking het kanaal fragmenten) gas uitwisseling te maximaliseren, met het uiteinde van de buis blootgesteld aan het kweekmedium, maar in willekeurige oriëntatie in de kolf (Figuur 1E-F). Deze cultuur systeem maakt het mogelijk cellen te migreren uit het kanaal en in / op de autologe stroma en cultuur kolf. Het voedingsmedium aangevuld alleen epidermale groeifactor (EGF), insuline, en antibiotica, ondersteunt de groei van gemengde celpopulaties afkomstig uit de organoïde. De weefselkweek kolf heeft een afneembare, hersluitbare deksel waardoor de organoids en / of cellen zonder verstoring van de gehele kolf of naburige organoids om geoogst te worden, met behoud van een steriele bevochtigde omgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijk borstweefsel werd verzameld van patiënten die deelnamen aan een onderzoek, met schriftelijke informed consent, na het Ministerie van Defensie, George Mason University, en Inova Health System Institutional Review Board goedgekeurde protocollen.
1. Bereid Nutrient Rich Medium met groeifactoren en antibiotica
- Bereid voorraadoplossingen van insuline, epidermale groeifactor (EGF), streptomycine sulfaat en gentamicinesulfaat.
- Reconstitueren insuline in steriel gefilterd water tot een eindconcentratie van 10 mg / ml. Zuig 10 ml Type 1 reagens kwaliteit water in een steriele 10 ml wegwerpspuit. Bevestig een 0,22 urn filter polyethersulfon de spuit. Doseer het steriel gefilterd water in een steriele 15 ml conische buis.
- Voeg 10 ml steriel gefilterd water om een 100 mg flacon van insuline. Meng de inhoud kort op een vortex mixer. Bewaar de insuline flacon op ijs. Doseer 450 ul van de insuline voorraad solutie in geëtiketteerde steriele microcentrifuge buisjes en bewaar bij -20 ° C. Insuline voorraad oplossing is stabiel tot aan de vervaldatum op de flacon.
- Bereid voorraadoplossing van epidermale groeifactor (EGF): Voeg 500 ul steriel water met 500 mg EGF (voorraad 1 ug / ul). Meng de inhoud kort op een vortex mixer. Houd het EFG flacon op ijs.
- Bereid een werkvoorraad oplossing van EGF: Voeg 100 ul van de voorraad EFG oplossing tot 900 ul voedingsbodem (werkvoorraad zal 0,1 ug / ul zijn). Meng de inhoud kort op een vortex mixer. Pipetteer 50 ul van de EGF werkvoorraadoplossing in geëtiketteerde steriele microcentrifuge buisjes en bewaar bij -80 ° C.
OPMERKING: EGF voorraadoplossing (1 ug / ul) is stabiel gedurende 1 jaar bij -80 ° C; werkvoorraadoplossing (0,1 ug / ul) is stabiel gedurende 2 maanden bij -80 ° C.
- Bereid een werkvoorraad oplossing van EGF: Voeg 100 ul van de voorraad EFG oplossing tot 900 ul voedingsbodem (werkvoorraad zal 0,1 ug / ul zijn). Meng de inhoud kort op een vortex mixer. Pipetteer 50 ul van de EGF werkvoorraadoplossing in geëtiketteerde steriele microcentrifuge buisjes en bewaar bij -80 ° C.
- Weeg 40 mg streptomycine sulfaat op een analytische balans. Plaats het streptomycine sulfaat into een steriele 15 ml conische buis. Voeg 4 ml voedingsmedium. Meng de inhoud kort op een vortex mixer. De oplossing moet een beetje roze zijn. Bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht. Streptomycine sulfaat oplossing is 7 dagen.
- Weeg 20 mg gentamicinesulfaat op een analytische balans. Plaats de gentamicinesulfaat in een steriele 15 ml conische buis. Voeg 2 ml van de voedingsbodem. Meng de inhoud kort op een vortex mixer. De oplossing moet geel zijn. Bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht. Gentamicinesulfaat oplossing is 7 dagen.
- Bereid twee 200 ml porties van voedingsmedium aangevuld met humaan recombinant EGF (10 ng / ml eindconcentratie.), Insuline (10 ug / ml eindconcentratie.), Streptomycine sulfaat (100 ug / ml eindconcentratie.) En gentamicinesulfaat (20 ug / ml eindconcentratie.).
- Voeg 200 ml voedingsmedium een vacuum filter kolf uitgerust met een 0,2 urn filter polyethersulfon kolf en een 250 ml fles ontvangt. Voeg 20 &# 181; l werkvoorraad EGF, 200 ul voorraad insuline, 2 ml bouillon streptomycine sulfaat, en 400 ul voorraad gentamicinesulfaat aan de 200 ml voedingsbodem. Bevestig de filter kolf met een vacuüm. Filter de medium. Gooi het filter en het etiket van de fles als "voedselrijk medium". Bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 14 dagen.
2. Tissue Verwerving en Grossing
- In de operatiekamer suite, onderhouden steriele techniek na de aanschaf van de borstweefsel. Plaats het borstweefsel in een steriele schaal en dek de schaal met steriele plastic wrap.
- Vervoer het weefsel in de overdekte bak naar Radiologie / Pathologie zoals vereist door uw instelling. Sluit de lade niet openen. Transport tijden variëren binnen instellingen. Weefsel kan in deze overdekte dienblad bij kamertemperatuur gedurende maximaal 45 min na excisie levensvatbaar blijven. Echter, snelle verwerking van het weefsel in voedselrijk medium biedt optimale omstandigheden voor de daaropvolgende organoïde cultuur.
- Bruto weefsel dissectie om gebieden van DCIS te identificeren binnen het borstweefsel: Gebruik steriele handschoenen, messen, scalpels, weefsel markering kleurstoffen, en azijn tijdens weefseldissectie om weefsel steriliteit te behouden.
- Reinig de werkruimte met 70% ethanol of 1% bleekmiddel. Open de steriele handschoenen en leg de handschoen wrapper op het werkvlak. Plaats de steriele binnenkant van de handschoen wrapper naar boven. Doe de steriele handschoenen.
- Reinig het oppervlak van de monsterhouder met 70% ethanol. Verwijder de plastic verpakking van het weefsel specimen container en zet het model op de handschoen wrapper.
- Dompel twee wattenstaafje wattenstaafjes in het weefsel markering kleurstof. Breng de kleurstof aan het oppervlak van het weefsel door het rollen van de swabs over het weefseloppervlak.
OPMERKING: Elke afdeling pathologie heeft een gestandaardiseerde kleurstof kleur / weefsel oriëntatie protocol. Weefsel wordt gelabeld met kleurstof om het weefsel te oriënteren met betrekking tot zijn positie in de patiënt. De kleurstof wordt uitgewist ofgeschilderd op het weefsel. Giet de kleurstof over het weefsel. Het gieten van de kleurstof kan ertoe leiden dat de kleurstof te lopen / infuus in weefsel spleten verwart aldus de oriëntatie van de chirurgische marges. Weefseloriëntatiedetectoren verschaft de chirurg en patholoog anatomische oriëntatiepunten om a) beschrijven het weefselspecimen, en b) bepalen de plaats van de chirurgische marges ten opzichte van de tumor. - Giet gedestilleerd witte azijn (5% azijnzuur) op steriele gaasjes. Dep de geverfd weefsel met de azijn gedrenkt gaasje. Gooi het gaas. Azijn wordt gebruikt om het weefsel markeerinrichting kleurstoffen vast.
- Snijd het borstweefsel in verticale plakjes van ongeveer 5 mm dik. Snij niet helemaal door het weefsel (figuur 2). Observeer / betasten het weefsel voor de gebieden van verkalking. Identificeer DCIS laesies door hun karakteristieke stevige, bleke verschijning omgeven door roodachtig, rubberachtige grenzen die gritty voelen (als gevolg van calcium spicules).
OPMERKING: In sommige gevallen kan comedo (puistje-achtige) gebiedengezien als witte stippen, die necrotisch materiaal uit grote diameter DCIS laesies. - Knip gebieden van DCIS / verkalkt borstweefsel, inclusief een kleine hoeveelheid van de omliggende borstweefsel. Plaats het borstweefsel in een steriele 50 ml buis met 20-30 ml voedselrijk medium bereid in stap 1.
- Meng het weefsel en middelgrote door voorzichtig het buisje meerdere malen. Gooi het medium en voeg vers medium. Plaats de buis met het weefsel en medium in een geïsoleerde houder en transporteren weefsel weefselkweek lab.
- Reinig de werkruimte met 70% ethanol of 1% bleekmiddel. Open de steriele handschoenen en leg de handschoen wrapper op het werkvlak. Plaats de steriele binnenkant van de handschoen wrapper naar boven. Doe de steriele handschoenen.
3. Tissue Culture
- Werken in een biologische veiligheidskast, giet het weefsel en een kleine hoeveelheid van het voedingsmedium in een steriele petrischaal. Met een steriel scalpel weggesneden en het bindweefsel te verwijderen. Snijd het borstweefsel in stukken (organoids) ongeveer 3 mm 2 (figuur 1C-D). Probeer om het weefsel te snijden, zodat elk orgaanOID bevat ten minste één waarneembaar ductsegment met omringende stroma.
- Open het deksel van de weefselkweek kolf. Met behulp van een steriele pincet of tang, plaatst de organoids in de kolf. Sluit het deksel. Gooi de petrischaal.
- Voeg 11 ml serum-vrij voedselrijk medium (bereid in stap 1) de weefselkweek kolf. Sluit de kolf en schud de kolf, zodat de organoids middelgrote en gelijkmatig verdeeld zijn over de kolf oppervlak (Figuur 1E-F).
- Incubeer de kolf bij 37 ° C in een bevochtigde 5,0% CO2 atmosfeer gedurende 2 dagen. Laat de kolf niet bewegen in deze tijd.
- Op dag 2 na de incubatie, verwijder de kolf uit de incubator te controleren op mogelijke bacteriële / schimmel besmetting. Vermijd plotselinge, scherpe bewegingen, of wervelende van de kolf. Plaats de fles op een omgekeerde microscoop podium.
- Let op de voedingsbodem voor bacteriën, gist en / of schimmels. Als er geen besmetting is geconstateerd, terug de kolf naar de incubator voor een addnele dag. Als contaminatie wordt opgemerkt, gooi de kolf en de inhoud in een geschikte container.
- Op dag 3 na de incubatie, vervang het geconditioneerde medium met vers medium.
- Plaats 11 ml medium in een steriele buis bij 37 ° C gedurende 20-30 min. Verwijder de weefselkweek kolf uit de incubator. Zonder verstoring van de organoids, te verwijderen en het medium in de kolf met een steriele serologische pipet weggooien.
- Met een nieuwe steriele serologische pipet wordt 11 ml van de voorverwarmde vers medium. Heel voorzichtig draai de kolf met het medium over de kolf oppervlak verdelen.
- Incubeer de kolf bij 37 ° C in een bevochtigde 5,0% CO2 atmosfeer.
4. Onderhoud van Opgericht organoïde / epitheelcellen Colonies
- Bereid vers medium om de 2 weken en vervang de media in de weefselkweek kolf 3 keer per week.
- Plaats 11 ml medium in een steriele container bij 37° C gedurende 20-30 min. Verwijder de kolf uit de incubator. Met behulp van een steriele serologische pipet, te verwijderen en het geconditioneerde medium gooi uit de kolf, zorg dat u de organoids niet te verstoren.
- Met een nieuwe steriele serologische pipet wordt 11 ml van de voorverwarmde vers medium. Heel voorzichtig draai de kolf met het medium over de kolf oppervlak verdelen. Incubeer de kolf bij 37 ° C in een bevochtigde 5,0% CO2 atmosfeer.
- Na 10-14 dagen in cultuur, verwijder eventuele stukjes weefsel in de kolf die niet aanhanger zijn.
- Periodiek oogst cellen en / of organoids van de kolf voor vermeerdering in nieuwe kweekflessen voor xenograft transplantatie of voor fenotypische en / of moleculaire analyse.
- Verwijder de weefselkweek kolf uit de incubator. Spray de kolf met 70% ethanol. Veeg het overtollige ethanol op de kolf met een schone papieren handdoek die is bespoten met 70% ethanol.
- Organoïde propagatie: <ol>
- Open het deksel van de kolf en plaats het deksel open in de biologische veiligheid kast. Onder microscopische visualisatie, zoek het organoïde (s) te worden geoogst. Gebruik steriele pincet of tang om pick-up een organoïde.
- Om de organoïde in een nieuw kweekkolf propageren, plaatst de organoïde in de nieuwe fles. Voeg 11 ml verse, warme medium. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 atmosfeer zoals beschreven in stap 3.3 - 3.6.3. Vervang het celkweekmedium in de weefselkweek kolf drie keer per week.
- Het oogsten van cellen:
- Onder directe microscopische vixualization, voorzichtig schrapen en zuig cellen en mammospheres gebruik van een 1000 ul pipet met steriele wegwerp pipet tips. Zuig de cellen en omringende medium. Doseer de cellen / medium in een steriele microcentrifugebuis.
- Spin de cellen kort in een mini-centrifuge bij 12.100 xg gedurende 5 sec. Verwijderen en het medium te verwijderen. <ol>
- Voor DNA analyse, onmiddellijk invriezen celpellet op droog ijs, in een klein volume medium (10 ui), met langdurige opslag bij -80 ° C.
- Voor proteoomanalyse lyseren van de cellen in 10 ul 8 M ureum voor massaspectrometrie of 2x SDS Tris-glycine buffer voor western blotting / omgekeerde fase eiwit microarrays. Als alternatief draaien cellen in een cytocentrifuge te celuitstrijkjes voor immunohistochemische analyse te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Workflow voor de aanschaf en het kweken van steriele borst ductaal carcinoma in situ weefsel
Borstweefsel steriliteit wordt gehandhaafd vanaf de operatiekamer aan de celkweek laboratorium via kleine veranderingen in typische ziekenhuis pathologie workflow (figuur 1). Weefsel wordt getransporteerd in een steriele container met een kunststof folie die radiologische evaluatie mogelijk maakt met behoud weefsel steriliteit. Bruto weefsel verwerking van een borst lumpectomy of mastectomie monster wordt uitgevoerd met steriele handschoenen, messen, en weefsel markering kleurstoffen. Bruto morfologische uiterlijk van de borst ductaal carcinoma in situ lijkt bleke, licht verhoogde gebieden met een zanderige / stevige textuur, omgeven door roodachtig / geel rubberachtige weefsel. Gebieden van ductale hyperplasie en DCIS kan "gritty" en stevig aanvoelen als gevolg van verkalking. Deze gebieden van borstweefsel verschijnen vaak tan of een iets andere kleur dan de omringende borstweefsel. Echter, ADH ceen pas te onderscheiden nadat weefsel verzamelen en pathologische beoordeling van de gebrandschilderde coupes. Borstweefsel levensvatbaar blijft door onderdompeling van het weefsel en / of ductale organoids in serumvrij voedingsmedium aangevuld met humaan recombinant EGF (10 ng / ml), insuline (10 ug / ml), streptomycine sulfaat (100 ug / ml) en gentamicinesulfaat (20 ug / ml) 5. Celkweek kolven met afneembare / hersluitbare deksels toestaan periodiek oogsten van cellen / organoids (Figuur 1E-F). Dit model succesvol gekweekte menselijke borst pre-invasieve laesies meer dan 20 patiënten met atypische ductale hyperplasie (n = 2) en ductaal carcinoom in situ (n = 18).
Spontane mammosphere vorming in vitro en in vivo
Mammospheres en 3-D structuren ontstaan spontaan uit meerdere, onafhankelijke mens DCIS duct weefselfragmenten van verschillende patiënten met atypische ductale hyperplasia of ductaal carcinoom in situ (figuur 3 en 4) 5,9. Enzymatische verstoring van het borstweefsel werd niet uitgevoerd voorafgaand aan weefselkweek, waardoor een soort gemengde celkweek. Noch serum, basaalmembraan extract, noch gelachtige matrices nodig waren voor spontane mammosphere vorming (Figuur 4). De mammospheres gegenereerde mammaire xenograft tumoren in NOD / SCID muismodel met hetzelfde groeipatroon als die van invasieve kanker (figuur 5) 5. Deze resultaten demonstreren dat progenitorcellen met invasiepotentieel vooraf bestaan binnen de menselijke borst DCIS duct maar blijkbaar in toom gehouden door het ductale niche en kan worden overgehaald te ontstaan in organoïde cultuur. Deze cellen vormen een nieuwe categorie borst stamcellen-achtige cellen die vóór de openlijke manifestatie van het invasieve fenotype 5,9,10 bestaan.
Bevestiging van epitheliale afgeleid mammospheres en xenografts
De mammospheres en xenotransplantaten afgeleid van de mammospheres werden bevestigd door immunofluorescentie als hebbende epitheliale oorsprong. Epitheliale celadhesiemolecuul (EpCAM) is een membraan glycoproteïne aanwezig op epitheelcellen 11. Immunofluorescentie met een muizen monoklonaal antilichaam reactief is humaan EpCAM (groen) en een nucleaire kleurstof (DAPI, blauw) liet EpCAM positieve cellen in de mammospheres in kweek (Figuur 6A) en het centrum van NOD / SCID xenograft (Figuur 6B).
Verificatie van intacte basale membraan grenzen
De mammosphere Vormen, neoplastische epitheliale cellen in deze cultuur systeem werden afgeleid van pre-invasieve borstkanker laesies die verstoken zijn van frank invasie of microinvasion waren, zoals bevestigd door onafhankelijke pathologische analyse onder zorgstandaard histopathologische diagnose. Meerdere organoïde structuren van dezelfde patiënt gegenereerde mammosphere voorming kolonies die bleken tumorigene zijn. Bovendien histopathologisch onderzoek van het weefsel voor organoïde kweek confluent geopenbaard intraductal letsels met intacte basaalmembraan grenzen (figuur 7B) 5. Derhalve kan worden geconcludeerd dat de spontane mammospheres gevormde kweeksysteem alleen afgeleid van pre-invasieve neoplastische ruimtes geen product van zeldzame gebieden van microinvasion 5.
Figuur 1. Workflow voor het behoud van weefsel steriliteit tijdens radiologische beeldvorming en grove weefsel dissectie. (A) In de operatiekamer wordt borstweefsel (lumpectomie sample getoond) geplaatst in een steriele schaal en afgedekt met steriele plastic wrap. Het weefsel kan direct worden afgebeeld in het plastic bakje. (B) Tissue een brutowinst te identificeren gebieden van DCIS. Eenmalig gebruik weefsel oriëntatie kleurstoffen zijn geschilderd op het weefsel oppervlak met behulp van steriele wattenstaafje swabs. Huishoudelijke gedestilleerd witte azijn wordt direct gestort op het weefsel en uitgewist met steriel gaasje. (C & D) Borstweefsel wordt getransporteerd naar de weefselkweek laboratorium in voedselrijk medium aangevuld met antibiotica. Weefseldissectie, te isoleren op het gebied van DCIS, wordt uitgevoerd met behulp van steriele handschoenen en messen / scalpels / schaar. De DCIS weefsel wordt gesneden in meerdere organoids voor cultuur. (E & F) In vitro kweek van borstkanker organoids. Menselijke DCIS weefsel direct geplaatst in weefselkweek kolven met dekseltjes zonder enzymatische digestie van het weefsel. Een minimale hoeveelheid serumvrij kweekmedium aangevuld met epidermale groeifactor en insuline ondersteunt cellulaire groei met behoud van een lucht-vloeistof grensvlak rond de organoïde.6fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Afbeelding van de bruto weefselverwerking voor borst DCIS weefsel. De lumpectomie of mastectomie weefsel wordt in dunne secties gesneden door het snijden van het weefsel verticaal zonder te snijden helemaal door het monster. Deze dissectie methode wordt vaak aangeduid als "brood brood techniek", omdat de cut weefsel lijkt op een brood. Het gebied (en) waarvan wordt vermoed dat DCIS zijn uitgesneden en gesneden in 2 - 3 mm segmenten voor diagnostische pathologie en organoïde cultuur.
Figuur 3. Een type gemengde celkweekonderhoudt vertegenwoordiger in vivo cel populaties. (A) fase contrast imago van gemengde celkweek gegenereerd uit borst DCIS laesies dan 11 weken (4x vergroting). (B & C) In vitro organoïde teelt met succes gepropageerd DCIS afgeleid epitheelcellen met verankering onafhankelijke groei, gedefinieerd als opwaarts groeien en uitbreiden mammospheres en gelobde, buis-achtige 3D-formaties, in serum-vrij medium aangevuld met EGF, insuline, streptomycine en gentamicine (10x vergroting). (D) Voorbeeld mammosphere gevormd na 11 weken in de cultuur (40x vergroting). Klik hier om te bekijk een grotere versie van deze figuur.
Figuur 4. Spontanevorming van mammospheres in serum vrije organoïde cultuur. Een voorbeeld mammosphere formatie na 33 dagen van de cultuur (10x vergroting, 20x inzet). Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. NOD / SCID muis xenograft model. Xenograften werden gegenereerd door het injecteren van epitheliale cellen verkregen van een patiënt gediagnosticeerd met DCIS (muis rechts uiervet pad) of uit een patiënt gediagnosticeerd met invasieve DCIS (linker muis uiervet pad). Xenograften afgeleid van zowel pure DCIS en invasieve DCIS onthulde een gelijkaardig groeipatroon en tarief. Klik hier om een grotere versie van t bekijkenzijn figuur.
Figuur 6. Mammospheres bevestigd van epitheliale oorsprong. Immunofluorescentie met anti-EpCAM geconjugeerd aan FITC werd gebruikt om de epitheliale oorsprong van mammospheres muis xenotransplantaten gegenereerd borstkanalen bevattende DCIS bevestigen. (A) EpCAM-FITC positieve cellen (pseudo- gekleurde groen, 488 nm) werden alleen gezien in mammospheres van de gemengde celkweken die uit borst organoids (DAPI (pseudo-kleur blauw, 408 nm) nucleaire kleuring). (B) In formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefselsecties muis xenograft, EpCAM positieve cellen werden alleen gedetecteerd in het midden van het xenograft tumor. (20x vergroting) Klik hier om een grotere versie van deze Figu bekijkenre.
Figuur 7. Collageen IV immunohistochemie openbaart kelder intacte membranen rond kanalen. Normaal borstkanalen (A) worden omgeven door intacte basale membranen verrijkt met collageen IV (diaminobenzidine = bruine kleuring). Na organoïde cultuur, borstweefsel bevat ook intact basaalmembranen bevestigt dat de mammospheres zijn afgeleid van gebieden van DCIS en niet van invasieve kanker (collageen IV immunohistochemie, paneel een 4x vergroting, paneel B 10X). Klik hier voor een grotere versie van te bekijken dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cultuur systeem dat hier wordt beschreven vormt een nieuw model voor het genereren van het leven pre-invasieve neoplastische cellen borst voor fundamenteel en translationeel onderzoek studies. In het verleden heeft premaligne progressie borstkanker typisch bestudeerd met drie verschillende methoden. De eerste methode is histopathologische en genetische analyse van gemicrodissecteerde bevroren of vaste menselijke preparaten 12-14. De tweede methode maakt gebruik muismodellen hyperplastische alveolaire nodules (HAN laesies) bevatten die geacht op humane pre-invasieve borstlaesies 15 zijn. Het derde model maakt gebruik van gevestigde borstcarcinoomcellijnen zoals MCF7 sublijnen (MCF10A) dat sterk gedifferentieerde DCIS morfologie 3,4 hebben. Hoewel deze drie modellen moleculaire aanwijzingen borstkanker progressie hebben ontvangen, geen van deze methoden kan beoordelen maligne potentie of moleculaire fenotype in laesie (s) van een individuele patiënt. Histopathologic analyse geeft geen informatie over de functionele fenotype van de cellen in de pre-invasieve laesies. De muis-model van borstkanker progressie kan niet exact de histomorphology en de diversiteit van de menselijke atypische ductale hyperplasie, lobulair carcinoma in situ, en ductaal carcinoma in situ 16-18. Bovendien is de stromale micromilieu en de afzetting van extracellulaire matrix omliggende muis voorloper laesies aanzienlijk verschillen van de menselijke tegenhanger 16. Spontane muizen precursorlaesies kan een zeer geringe progressie vertonen invasie en metastase. De derde methode, gekweekte cellijnen, kan alleen functioneel fenotypische informatie als getransplanteerd in het immuunsysteem onderdrukt hosts 3,4. Naast de genetische afwijkingen van een lange gepasseerd cellijn kan niet die spontane progressie van borstkanker bij de mens 2. Tenslotte is het bekend dat neoplasma elke patiëntheeft een unieke combinatie van genetische en epigenetische afwijkingen die het tempo van de groei, gedifferentieerde toestand, en de progressie rijden naar invasie en metastase 13,14,17. Human pre-invasieve laesies zijn multifocale en heterogene in cel samenstelling en histomorphology. Bovendien is de biologische maligne potentieel onbekend voor pre-invasieve laesies individuele patiënt.
Onze primaire weefselkweek overwint de tekortkomingen van eerdere modellen van menselijke pre-invasieve borstkanker en geeft de volgende voordelen: 1) Het organoïde kweeksysteem ondersteunt groei van neoplastische cel populaties in het natieve weefsel micro die spontaan groeien en genereren mammospheres die produceren invasieve tumoren in muizen xenotransplantaatmodellen. De cellen vormen het genotype en fenotype van een individuele patiënt en daarbij informatie te verstrekken voor een gepersonaliseerde therapie, of een individuele prognose. 2) De organoïde kweeksysteem onderhAins de natieve cel subpopulaties en verschaft een middel om niet-kwaadaardige epitheliale cellen, stromale cellen en immuuncellen oorspronkelijk in de primaire borstweefsel cultiveren, en binnen het organoïde in cultuur uitgevoerd. De geringe omvang van de media in de cultuur systeem ondersteunt zuurstof uitwisseling stimuleren van spontane mammosphere vorming en gedifferentieerde duct en alveoli achtige structuren, zonder de noodzaak van een kunstmatige driedimensionale steigers. 3) De primaire celcultuur is vrij van wijzigingen en selectie gegenereerd door enzymatische dissociatie of exogene genetische modificatie. Voorts het voedingsmedium is goedkoop en eenvoudig te bereiden. 4) Moleculaire en genetische analyse kunnen worden uitgevoerd op specifieke celpopulaties en / of organoids uit de kweek op verschillende tijdstippen zonder verstoring van de gehele kweek. 5) Het organoïde kweeksysteem maakt de groei gedifferentieerde morfologie en cel-cel interacties van de natieve celpopulaties die kunnenbestudeerd voor en na introductie van therapeutische middelen in het kweekmedium.
Hoewel primaire weefselkweek heeft bepaalde voordelen, het is niet zonder beperkingen. De organoïde cultuur ondersteunt de groei van gemengde celculturen zonder overmatige groei van elk type één cel. Echter, de specifieke verhouding van celtypen niet worden gecontroleerd en kan dus niet herhalen de exacte cellulaire verhoudingen in vivo. Succesvolle organoïde teelt vereist steriele verzameling en verwerking, die beide zijn niet routinematige procedures in veel gemeenschap ziekenhuis pathologie laboratoria. Goede communicatie tussen de klinische onderzoekers, chirurgische personeel en pathologie medewerkers zijn essentieel voor het behoud van het monster steriliteit binnen het continuüm van zorg voor de patiënt.
Een verdere beperking van organoïde cultuur is het effect van substraat standvastigheid cellulaire fenotype en genexpressie 16,19. Differentiatie van stamcellen in kweekkan worden geïnduceerd door toevoeging van serum-bevattend medium of kan het gevolg langere tijd in kweek. Een stam fenotype werd gehandhaafd na verscheidene maanden in deze niet-enzymatische, serumvrije organoïde kweeksysteem 5. Echter, op een gegeven moment kunnen de cellen differentiëren die morfologisch zichtbaar - de cellen kleinere, dichtere en niet mammospheres vormen. Om mogelijke problemen te voorkomen met veranderingen in cel fenotype tijd, moleculaire experimenten, zoals transfecties of knock down assays worden uitgevoerd met jonge culturen plaats met oude culturen (meer dan 6 maanden).
De sleutels tot succesvolle organoïde cultuur worden met een geschikte volume medium in de kolf, en het toestaan van de organoids tijd om zich te houden aan de weefselkweek kolf. Overtollige medium in de kolf grenzen zuurstofdiffusie, remmen mammosphere formatie. De eerste 3-7 dagen van weefselkweek zijn cruciaal voor de organoids om aan een tisaanklagen kolf. In het algemeen is een organoïde niet is bevestigd op dag 14, het waarschijnlijk geen levensvatbare DCIS ductale segmenten bevat en niet hechtend worden. Organoids die niet hechtend op dag 14 moet worden verwijderd uit de cultuur. Het ontbreken van levensvatbare borst DCIS leidingen kunnen volgende cultuur worden gecontroleerd door vaststelling van de organoïde in 10% formaline en het verwerken van de weefsel in paraffine blokken voor weefselkleuring en microscopische evaluatie.
Onze niet-enzymatische, serum-vrije cultuur systeem bevindingen ondersteunen de hypothese dat genetisch abnormale neoplastische precursoren met invasieve potentieel bestaan binnen pre-invasieve menselijke borst laesies 5,9,20. Deze bevinding is in lijn met het eerdere werk van Sgroi et al., Die genetische analyse van menselijke borst pre-invasieve laesies en Damonte et al uitgevoerd. Die de borstklieren intra-epitheliale neoplasie uitgroei bestudeerd (Mino) muizenmodel van borstkanker progressie 12,14 , 21. Genomen together met de conclusies van anderen, onze cultuur model van de individuele patiënt pre-invasieve laesies ondersteunt het concept dat de agressieve fenotype van invasieve borstkanker van een patiënt kan zijn grotendeels vooraf bepaald op het pre-invasieve stadium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door (1) het Ministerie van Defensie Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Activity) award # W81XVVH-10-1-0781 om LAL en VE, en (2) de Susan G. Komen Foundation subsidie IR122224446 Lal en VE. Pathologie ondersteuning en weefsel brutowinst werd vriendelijk door Inova Fairfax afdeling Pathologie, Dr. Hassan Nayer, Dr. Geetha A. Menezes, en Dr. Charles Bechert. Toestemming van de patiënt en het monster aanbesteding werd vakkundig geleid door Inova Fairfax ziekenhuis klinisch onderzoek coördinatoren Holly Gallimore, Heather Huryk, en Emil Kamar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C.
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D'amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
