Summary
Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids> 6 ay için geçerli kalır.
Abstract
In situ (DCIS) Meme duktal karsinom, tanımı gereği, kollajenöz bazal membran ihlal etmeden, meme kanalının sınırları içinde neoplastik epitel hücrelerinin proliferasyonudur. DCIS invaziv meme kanserleri olmayan bir zorunlu habercisi iken, invaziv kansere ilerlemesinin izin moleküler mekanizmalar ve hücre popülasyonları tam olarak bilinmemektedir. Işgalinin yeteneğine progenitör hücrelerin DCIS hücre popülasyonu içinde mevcut olup olmadığını belirlemek için, doku enzimatik bozulma olmadan, ameliyat sırasında steril insan meme dokusu toplanması ve kültürü için bir yöntem geliştirdi.
Duktal segmentleri içeren steril meme dokusu rutin patolojik incelemede aşağıdaki cerrahi olarak çıkarıldı meme dokusu hasat edilir. DCIS ihtiva eden doku, doku kültürü laboratuara besin yönünden zengin, antibiyotik içeren, serumsuz ortama yerleştirilebilir, ve nakledilir. Meme dokusu daha dissecte olduğunud kalsifiye alanları izole etmek. Birden fazla meme dokusu parçaları (organoids) nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde çıkarılabilir bir kapak ve kültürlenmiş olan bir şişe içinde, serum barındırmayan ortam içinde en az bir hacim içinde yerleştirilir. 14 gün - epitel ve fibroblast hücre popülasyonları 10 sonra organoid ortaya. Kendiliğinden oluşan ve epitel hücre tek tabaka etrafında Mammospheres. Özgül hücre popülasyonları arasında, komşu hücreleri bozmadan şişeden doğrudan hasat edilebilir. Bizim enzimatik olmayan doku kültürü sistemi, güvenilir taze insan DCIS lezyonlarında gelen sitogenetik anormal, invaziv ata hücreleri ortaya koymaktadır.
Introduction
Meme kanalları ve alveollere (in situ duktal karsinom) sınırları içinde epitel hücrelerinin çoğalması invaziv duktal ve lobüler meme kanserine bağlı zorunlu bir habercisi olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, invaziv kansere ilerlemesinin izin moleküler mekanizmalar ve hücre popülasyon dinamiği tam olarak anlaşılamamıştır. Önceden istilacı meme karsinomu hücreleri veya herhangi bir ön-invaziv tümör tarafından kullanılan hayatta kalma mekanizmalarını, açıklık getirecek öldürme, ya da, ön-invazif neoplazmaların 1 önlenmesi için tedavi stratejileri ortaya çıkarabilir. Ancak, işlevsel okuyan insan pre-invaziv lezyonlar için düşük maliyetli basit yöntemler eksik edilmiştir. Dönüştürülmüş hücre çizgileri in vitro tek tabakalı kültürü oluşturulmuş bir laboratuar yöntemi olup, bu ölümsüz kılınmış hücre kuşaklarının fenotip ve genotip olsa da, birincil insan tümör hücreleri 2 moleküler durumunu özetlemek için başarısız olur. Bunun da ötesinde, Tümörjenik MCF-10A hücre hattı, burada recapitulates 3-D meme bezi mimarisi, yeterince fonksiyonel fenotip ve bireysel bir hastanın pre-invaziv meme lezyonu 3,4 moleküler özelliklerini yansıtmamaktadır.
Işgalinin yeteneğine kök benzeri neoplastik hücrelerin in situ (DCIS) hücre popülasyonunda duktal karsinom içinde mevcut olup olmadığını belirlemek için, (Şekil 1) 5 toplanması ve cerrahi sırasında steril insan meme dokusu kültürü için bir yöntem geliştirdi. Bizim ex vivo meme organoid kültür sistemi izole ve taze insan meme duktal karsinoma dokusunun 6-8 mammosphere oluşturan hücrelerin çoğaltılmasına yönelik, enzimatik doku bozulması, bazal membran ekstresi matris veya fibroblast tükenmesine dayanmaz. Yeni sistem, hücre akış / göç 5 esasına dayanır. Fark meme kanalı, ve çevresindeki stromal serumsuz Besleyici ortam (sadece e ait minimum bir hacmi içinde batıkKültür ortamının etkisine maruz kalan kanal kesme yüzeyi ile, gaz alış-verişini en üst düzeye çıkarmak, ama şişenin (Şekil 1E-F) belli bir yön olarak) kanal parçalarını kapsayacak şekilde nough. Bu kültür sistemi hücreleri otolog stroma ve kültür şişesi üzerine kanalın dışına ve / 'a taşımasına olanak tanır. Sadece Epidermal Büyüme Faktörü (EGF), insülin ve antibiyotikler ile takviye edilmiş bir besin ortamı, organoid çıkan karma hücre popülasyonlarının büyümesini desteklemektedir. Doku kültürü şişesi Steril nemlendirilmiş bir ortamı muhafaza ederken, organoids ve / veya hücreler tüm şişe veya komşu organoids bozmadan hasat edilmesine olanak tanıyan çıkartılabilir, tekrar kapatılabilen bir kapak yer alır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İnsan meme dokusu Savunma Bölümü, George Mason University, ve Inova Sağlık Sistemi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından kabul protokollerini takip, bilgilendirilmiş yazılı onayı ile, bir araştırma çalışmasına dahil hastalardan toplanmıştır.
1. Büyüme Faktörleri ve Antibiyotikler Besin Zengin Orta hazırlayın
- Insülin stok çözeltileri, epidermal büyüme faktörü (EGF), streptomisin sülfat ve gentamisinsülfat hazırlayın.
- 10 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar steril filtre edildi su içinde insülin sulandırın. Steril 10 ml tek kullanımlık şırınga Tip 1 reaktif dereceli su aspire 10 ml. Şırıngaya 0.22 mikron polietersülfon filtre takın. Steril bir 15 ml'lik konik bir tüp içine steril filtrelenmiş su koyun.
- Insülin 100 mg'lık bir şişeye, steril filtre edilmiş su, 10 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Buz üzerinde insülin flakon tutun. Insülin stok Solu 450 ul dağıtmak-20 ° C'de etiketli, steril mikrosantrifüj tüpleri ve deposuna yon. İnsülin stok solüsyonu şişenin üzerindeki son kullanma tarihine kadar stabildir.
- Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve bir stok çözelti hazırlayın: 500 ug, EGF (stok 1 mg / ml) 500 ul steril su ekle. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Buz üzerinde EGF şişesini tutun.
- EGF çalışan bir stok solüsyonu hazırlayın: 900 ul besin ortamında (çalışma stok / ul 0.1 ug olacaktır) için stok EGF çözüm 100 ul ekleyin. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. -80 ° C de, EGF çalışma stoğu etiketli, steril mikrosantrifüj tüpleri içine çözeltisi ve mağaza 50 ul koyun.
Not: EGF stok çözeltisi (1 ug / ul) -80 ° C'de 1 yıl stabildir; stok çözeltisi (0.1 ug / ul) çalışma -80 ° C 'de, 2 ay boyunca stabildir.
- EGF çalışan bir stok solüsyonu hazırlayın: 900 ul besin ortamında (çalışma stok / ul 0.1 ug olacaktır) için stok EGF çözüm 100 ul ekleyin. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. -80 ° C de, EGF çalışma stoğu etiketli, steril mikrosantrifüj tüpleri içine çözeltisi ve mağaza 50 ul koyun.
- Bir analitik terazi üzerinde streptomisin sülfat, 40 mg tartılır. Streptomisin sülfat int yerleştirinoa steril 15 ml konik tüp. Besleyici ortam 4 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Çözelti, hafif pembe olmalıdır. 4 ° C'de saklayın ışıktan korunmalıdır. Streptomisin sülfat çözeltisi 7 gün süreyle stabildir.
- Bir analitik terazi üzerinde gentamisin-sülfat ve 20 mg tartılır. Steril bir 15 ml'lik konik bir tüp içine gentamisin sülfat yerleştirin. Besleyici ortam 2 ml ilave edilir. Vorteks mikserde kısaca içeriği karıştırın. Çözelti sarı olmalı. 4 ° C'de saklayın ışıktan korunmalıdır. Gentamisin sülfat çözeltisi 7 gün süreyle stabildir.
- (20 (. 100 ug / ml nihai konsantrasyon), (. 10 ug / ml nihai kons), (. 10 ng / ml nihai kons) streptomisin sülfat insülin, insan rekombinant EGF ile takviye edilmiş bir besleyici ortam içinde iki adet 200 ml'lik toplu hazırlayın ve gentamisinsülfat ug / ml final kons.).
- 0.2 um polietersülfon filtre şişesi ile donatılmış bir vakum filtre şişesi ve 250 ml'lik bir alıcı şişeye 200 mi besin ortamı ilave edin. Ekleme 20 ve181. l çalışma stoğu, EGF, 200 ul stok insülin, 2 ml stok streptomisin sülfat ve besleyici ortam içinde 200 ml 400 ul stok gentamisin sülfat. Bir vakum filtre balon takın. Orta Filtre. Filtreyi atın ve "zengin besin ortamı" olarak şişesi etiket. 14 güne kadar, 4 ° C'de depolayın.
2. Doku Toplama ve Çok Satılan Uygulamalar
- Ameliyathanede, meme dokusu sağlandıktan sonra steril tekniği korumak. Steril bir tepsiye meme dokusunu yerleştirin ve steril plastik wrap ile tepsiyi örtün.
- Kurumunuz tarafından gerekli şekilde Radyoloji / Patoloji için kapalı tepsiye doku taşıyın. Tepsiyi açmayın. Ulaşım süreleri kurumlar içinde değişebilir. Doku kadar 45 dakika sonrası eksizyonu RT'de bu kapalı tepsiye canlı kalabilir. Ancak, besin açısından zengin ortama doku istemi işleme sonraki organoid kültürü için en uygun koşulları sağlar.
- Brüt doku diseksiyonu meme dokusu içinde DCIS'lı alanları tanımlamak için: doku kısırlık korumak için doku diseksiyonu sırasında steril eldiven, bıçak, neşter, doku işaretleme boyaları, ve sirke kullanın.
- % 70 etanol veya% 1 çamaşır suyu ile çalışma alanını temizleyin. Steril eldiven açın ve çalışma yüzeyine eldiven sarıcı yerleştirin. Eldiven sarıcı yüzü yukarı steril içini yerleştirin. Steril eldiven giyin.
- % 70 etanol ile örnek kabın yüzeyini temizleyin. Doku örneği kaptan plastik kaplamayı çıkarın ve eldiven sargı üzerinde numune yerleştirin.
- Doku işaretleme boyası içine iki pamuk uçlu bezlerden batırın. Doku yüzeyi boyunca bezlerden yuvarlayarak doku yüzeyine boya uygulanır.
NOT: Her patoloji bölüm standart bir boya renk / doku yönlendirme protokolü vardır. Doku hastada konumu ile ilgili olarak doku yönlendirmek için boya ile etiketlenir. Boya lekelendi ya dadoku üzerine boyanmış. Doku üzerinde boya dökmeyin. Boya Dökme boya böylece cerrahi sınırların yönünü kafa karıştırıcı doku boşluklarına / çalıştırmak damla neden olabilir. Doku yönelim cerrah ve bir anatomik yerler ile patolog) doku örneği tanımlamak, ve b) tümör ile ilgili olarak cerrahi sınırların yerini belirlemek sağlar. - Steril gazlı bez üzerine damıtılmış beyaz sirke (% 5 asetik asit) dökün. Sirke batırılmış gazlı bez ile boyanmış doku kurulayın. Gazlı bez atın. Sirke boyalar işaretleme dokuyu düzeltmek için kullanılır.
- Yaklaşık 5 mm kalınlığında dikey dilimler halinde meme dokusunu kesti. Doku (Şekil 2) aracılığıyla tüm yol kesmeyin. / Gözlemlemek kalsifikasyon alanları için doku palpe. Kendi karakteristik firması tarafından DCIS belirlemek, kırmızımsı çevrili görünüm soluk, (nedeniyle kalsiyum spikülleri için) cesur hissediyorum lastik sınırları.
NOT: Bazı durumlarda, komedondur (sivilce gibi) alanlar olabilirBüyük çaplı DCIS lezyonlarında nekrotik malzemeyi temsil eden beyaz noktalar olarak görülmektedir. - Meme dokusunu çevreleyen küçük bir miktar da dahil olmak üzere, DCIS / kalsifiye meme dokusunu kesip. Aşama 1 'de hazırlanan besleyici zengin ortam 20-30 ml ihtiva eden steril bir 50 ml tüp içine meme dokusu yerleştirin.
- Yavaşça tüpü birkaç kez ters yüz edilerek doku ve orta karıştırın. Orta atın ve taze orta ekleyin. Izole edilmiş bir kap içine doku ve ortam ihtiva eden tüp yerleştirilir ve doku kültürü laboratuara doku taşımak.
- % 70 etanol veya% 1 çamaşır suyu ile çalışma alanını temizleyin. Steril eldiven açın ve çalışma yüzeyine eldiven sarıcı yerleştirin. Eldiven sarıcı yüzü yukarı steril içini yerleştirin. Steril eldiven giyin.
3. Doku Kültürü
- Biyolojik güvenlik kabininde çalışan doku ve steril bir Petri kabı içine besleyici ortam küçük bir miktar dökün. Steril bir neşter kesip ve fibröz doku atın kullanma. Adet (organoids) içine meme dokusunu yaklaşık 3 mm 2 (Şekil 1C-D) kesti. Doku kesmek için çalışın, böylece her organOSB çevreleyen stroma sahip en azından bir ayırd edilebilir kanal segmenti ihtiva eder.
- Doku kültür şişesi kapağını açın. Steril cımbız veya forseps kullanılarak, şişeye organoids yerleştirin. Kapağı kapatın. Petri atın.
- Doku kültür şişesine 11 mi serumsuz besin yönünden zengin ortam (aşama 1 'de hazırlandı) ekleyin. Şişeyi kapatın ve organoids ve orta eşit kap yüzeyinden (Şekil 1E-F) arasında dağıtılır böylece balon girdap.
- 2 gün boyunca nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C'de bir balon içinde inkübe edin. Bu süre boyunca bir balon içinde hareket ettirmeyin.
- Gün 2 sonrası inkübasyon, potansiyel bakteri / mantar kontaminasyonu kontrol etmek için inkübatör şişeyi çıkarın. Şişenin ani, keskin hareketler, ya da türbülans kaçının. Ters bir mikroskop sahnede şişesi yerleştirin.
- Bakteri, maya ve / veya mantar için orta dikkate alınmalıdır. Herhangi bir kirlenme tespit edilirse, bir eklenti için inkübatör şişeyi geriitional gün. Kirlenme tespit edilirse, uygun bir kap içinde bir balon içinde ve içindekileri atmak.
- 3. günde enkübasyonunda, taze ortam ile koşullandırılmış bir ortam değiştirin.
- 20-30 dakika süre ile 37 ° C 'de, bir steril tüp içine ortamı 11 ml yerleştirin. Inkübatör doku kültür şişesi çıkarın. Organoids bozmadan çıkarın ve steril bir serolojik pipet kullanarak şişeye içinde orta atın.
- Yeni bir steril serolojik pipet kullanarak, önceden ısıtılmış taze ortam 11 ml ilave ediniz. Çok yumuşak, şişe yüzeyi boyunca orta dağıtmak üzere şişe döndürün.
- Nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C'de bir balon içinde inkübe edin.
Kurulmuş organoid / Epitel Hücre Kolonileri 4. Bakım
- Her 2 haftada bir taze ortamı hazırlayın ve doku kültürü şişesinde haftada 3 kez ortamı değiştirin.
- 37 ° C'de steril bir kap içinde ortam 11 ml yerleştirin20-30 dakika süreyle ° C. Inkübatör şişeyi çıkarın. Steril bir serolojik pipet kullanarak, kaldırmak ve organoids rahatsız etmemek için dikkatli olmak şişesi klimalı ortam atın.
- Yeni bir steril serolojik pipet kullanarak, önceden ısıtılmış taze ortam 11 ml ilave ediniz. Çok yumuşak, şişe yüzeyi boyunca orta dağıtmak üzere şişe döndürün. Nemlendirilmiş bir% 5.0 CO2 atmosferinde 37 ° C'de bir balon içinde inkübe edin.
- 10 sonra, - 14 günlük kültür, yapışkan olmayan bir kültür şişesi içinde doku parçaları alın.
- Ksenograft transplantasyon için periyodik olarak hasat hücreleri ve / veya yeni kültür şişelerine yayılması için şişeden organoids, ya da fenotipik ve / veya moleküler analiz için.
- Inkübatör doku kültür şişesi çıkarın. % 70 etanol ile balonun püskürtün. % 70 etanol ile püskürtülür olmuştur temiz bir kağıt havlu ile balona aşırı etanol silin.
- Organoid yayılımı: <ol>
- Şişenin kapağını açın ve biyolojik güvenlik kabini kapak yüzü yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Mikroskopik görüntüleme altında, organoid (ler) hasat edilmesi bulun. Pick-up için bir organoid steril cımbız veya forseps kullanın.
- Yeni bir kültür şişesi içinde organoid yaymak için, yeni bir şişede organoid yerleştirin. 11 ml taze, sıcak orta ekleyin. 3.6.3 - adımda 3.3 de tarif edildiği gibi, bir nemlendirilmiş% 5 CO2 atmosferinde, 37 ° C'de inkübe edilir. Doku kültüründe, hücre kültür ortamı haftada üç kez şişe yerleştirin.
- Hücrelerin hasat:
- Direkt mikroskobik vixualization altında, hafifçe kazıyın ve aspire hücreler ve mammospheres steril tek kullanımlık pipet uçları ile 1000 ul pipet kullanarak. Hücreleri ve çevresindeki ortam aspire. Steril mikrosantrifüj tüpü içine hücre / orta koyun.
- 5 saniye boyunca 12.100 xg'de mini-santrifüj kısaca hücreleri Spin. Çıkarın ve orta atın. <ol>
- DNA analizi için hemen -80 ° C 'de, uzun süreli saklama, ortam (10 ul), küçük bir hacim içinde, kuru buz üzerinde hücre pelletini dondurma.
- Proteomik analizi, kütle spektrometrisi veya batı benekleme / ters fazlı protein mikrodizilerinin 2x SDS Tris-glisin tamponu 8 M üre, 10 ml içinde hücreler lize edildi. Alternatif olarak, immünohistokimyasal analizi için hücre smear yapmak için bir Sitosantrifüj hücreleri dönerler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yerinde dokusunda steril meme duktal karsinom tedarik ve kültürleme için iş akışı
Meme dokusu kısırlık tipik bir hastane patoloji iş akışı içinde küçük değişiklikler (Şekil 1) üzerinden hücre kültürü laboratuvara ameliyathane muhafaza ediliyor. Doku doku sterilite korurken radyolojik değerlendirmesi izin veren bir plastik film kapağı ile steril bir kaba taşınır. Bir göğüs lumpektomi veya mastektomi numunenin brüt mendil steril eldiven, bıçakları, ve doku işaretleme boyaları ile gerçekleştirilir. In situ meme duktal karsinom brüt morfolojik görünümü kırmızımsı sarı / lastik bir doku ile çevrili cesur / sağlam doku, soluk, hafif kalkık alanları benzer. Duktal hiperplazi ve DCIS'lı Alanları Kalsifikasyonlara bağlı "gritty" ve firma hissedebilirsiniz. Meme dokusunun Bu alanlar genellikle kahverengi veya çevredeki meme dokusu daha biraz farklı renk görünür. Bununla birlikte, ADH CıBir tek doku toplama ve lekeli doku kesitlerinde patolojik inceleme sonrasında ayırt edilebilir. Meme dokusu, insan rekombinant EGF (10 ng / ml), insülin (10 ug / ml), streptomisin sülfat (100 ug / mL) ve gentamisin sülfat ile takviye edilmiş serumsuz besleyici ortam içinde, doku ve / veya duktal organoids daldırılmasıyla kalabildiğini (20 ug / ml), 5. Çıkarılabilir / yeniden kapatılabilen kapaklı hücre kültürü şişeleri hücre / organoids (Şekil 1E-F) periyodik hasat izin verir. Bu model başarılı (n = 18) yerinde 20'den fazla atipik duktal hiperplazi tanısı konmuş hastalarda (n = 2) ve duktal karsinom insan meme pre-invaziv lezyonlar yayılır.
In vitro ve in vivo olarak spontan mammosphere oluşumu
Mammospheres ve 3-D yapıları atipik duktal hiper tanısı farklı hastadan birden fazla bağımsız insan DCIS kanal doku parçalarının kendiliğinden ortaya çıktıin situ plasia veya duktal karsinom (Şekil 3 ve 4) 5,9. Göğüs dokusunun enzimatik kesilmesi öncesinde, bir karma hücre tipi kültüründe neden doku kültürü, yapılmadı. Ne serumu, bazal membran ekstresi, veya jel benzeri bir matris kendiliğinden mammosphere formasyonu (Şekil 4) için gerekli idi. Mammospheres invazif kanser aynı büyüme paterni ile, NOD / SCID fare modelinde (Şekil 5) 5 meme ksenograft tümörler üretmiştir. Bu sonuçlar insan meme içinde ön-mevcut potansiyel invaziv ile öncül hücreler kanalı DCIS ama görünüşe duktal niş tarafından kontrol altında tutulan ve organoid kültürde ortaya sürülmesi olduğunu göstermektedir. Bu hücreler, invazif fenotipte 5,9,10 aleni tezahürü önce mevcut meme kök-benzeri hücreler yeni bir kategorisini oluşturmaktadır.
Epitel türetilmiş mammospheres ve xenograf teyidits
Mammospheres türetilen mammospheres ve ksenograftlar epitelyal kökenli sahip olarak, bağışıklık ile doğrulanmıştır. Epitelyal hücre adezyon molekülü (EpCAM) epitel hücreleri 11 ile ifade edilen bir zar glikoproteinidir. İnsan EpCAM (yeşil) ve bir nükleer boya (DAPI, mavi) karşı reaktif olan bir fare monoklonal antikor ile immünofloresan kültür mammospheres içinde (Şekil 6A), ve NOD / SCID ksenograft (Şekil 6B) ve merkez EpCAM pozitif hücrelerini göstermiştir.
Sağlam bazal membran sınırlarının doğrulanması
Bakım histopatolojik tanı standart altında bağımsız patolojik inceleme ile doğrulandığı gibi mammosphere, bu kültür sistemi neoplastik epitel hücreleri, frank işgali veya mikroinvazif yoksun olan pre-invaziv meme lezyonlarının elde edilmiştir şekillendirme. Aynı hastadan gelen çok sayıda Organoid yapılar için mammosphere oluşturulantümörijenik olduğu kanıtlanmıştır Ming kolonileri. Buna ek olarak, organoid kültürü için kullanılan dokunun histopatolojik inceleme sağlam bazal membran sınırları (Şekil 7B) 5 ile birleşen intraduktal lezyon saptandı. Bu nedenle, bu kültür sisteminde oluşturulan kendiliğinden mammospheres Preinvazif neoplastik alanlarda sadece türetilmiştir ve mikroinvazif 5 nadir alanlarında ürünü değildir olduğu sonucuna varılabilir.
Radyolojik görüntüleme ve brüt doku diseksiyonu sırasında doku steriliteyi korumaya 1. iş akışı Şekil. Ameliyathanede (A), meme dokusu (gösterilmemiştir lumpektomi numune) steril bir tepsiye yerleştirilir ve steril bir plastik sarım ile örtülür. Doku plastik tepsi doğrudan görüntülü olabilir. (B) Doku tanımlamak için gişe hasılatı elde eden DCIS'lı alanları. Tek kullanımlık sadece doku yönelim boyalar steril pamuk uçlu silgiçlerle doku yüzeyine boyanır. Ev damıtılmış beyaz sirke doku üzerine boşaltılır ve steril pamuklu bir tülden ile kurutulur. (Cı-Ge), meme dokusu antibiyotikler ile takviye edilmiş besin açısından zengin bir ortam içinde doku kültürü laboratuara nakledilir. Doku diseksiyonu, tümörün büyüklüğü alanları izole etmek steril eldiven ve bıçakları / neşter / makas kullanılarak yapılır. DCIS, doku kültürü için çok sayıda organoids halinde kesilir. (E ve F) meme organoids in vitro kültürü. İnsan DCIS, doku doku önceden enzimatik sindirimi olmadan çıkarılabilir kapaklı doku kültürü şişelerinde doğrudan yerleştirilir. Organoid etrafında bir hava-su ara-yüzünün muhafaza ederken, epidermal büyüme faktörü ve insülin ile takviye edilmiş serumsuz bir kültür ortamı içinde bir az miktarda hücre büyümesini desteklemektedir.6fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Meme DCIS doku için brüt doku işleme Şekil 2. İllüstrasyon. Lumpektomi veya mastektomi doku örneğinin içinden tüm yol kesmeden dikey doku dilimleme ince kesitler halinde kesilir. Kesilmiş doku bir somun ekmek benzer beri bu Diseksiyon yöntemi genellikle "ekmeği tekniği" olarak adlandırılır. DCIS içeren şüphelenilen alan (lar) kesip ve 2 içine dilimlenmiş - tanı patoloji ve organoid kültürü için 3 mm dilim.
Şekil 3. bir karma hücre türü kültürüvivo hücre popülasyonlarında temsilcisine tutar. Meme oluşturulan karma hücre kültürü (A) Faz kontrastlı görüntü ekimi başarıyla DCIS, ankraj bağımsız büyüme ile epitel hücrelerinden oluşan yukarı büyüyen ve genişleyen mammospheres olarak tanımlanan yayılır In vitro organoid 11 hafta (4X büyütme). (B & C) üzerinde lezyonlar DCIS ve EGF, insülin, streptomisin ve gentamisin (10X büyütme) ile desteklenmiş serum serbest ortamda, kanal gibi 3-D oluşumlar lobüle. (D) Örnek kültür (40X büyütme) 11 hafta sonra oluşan mammosphere. için tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek.
Spontan Şekil 4.Serum serbest organoid kültüründe mammospheres oluşumu. kültürün 33 gün (10X büyütme, 20X içerlek) Aşağıdaki örnek mammosphere oluşumu. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. NOD / SCID fare ksenogreft modeli. Ksenogrefleri DCIS'lı (sağ fare meme yağ pedi) ile veya invaziv DCIS'lı (fare sol meme yağ yastığı) tanısı alan hastanın tanısı bir hastadan elde edilen epitel hücreleri enjekte edilerek üretildi. Saf DCIS'lı ve invaziv DCIS'lı hem türetilmiş Ksenogrefleri benzer bir büyüme paterni ve hızı saptandı. t büyük halini görmek için buraya tıklayınızOnun rakam.
Şekil 6. Mammospheres epitelyal menşeli olduğu teyid edilmiştir. DCIS içeren meme kanalı oluşturulur mammospheres ve fare ksenograftlarının epitel kaynağını teyit etmek için, FITC konjüge edilmiş bir anti-EpCAM ile bağışıklık (A). EpCAM-FITC pozitif hücreler (sözde yeşil renkli, 488 nm) sadece meme organoids çıkan karma hücre kültürlerinin mammospheres (DAPI (sözde renkli mavisi, 408 nm) bir nükleer boya) olarak görüldü. (B) 'formalinde tespit edilmiş parafine gömülmüş fare ksenograft doku bölümlerinde, EpCAM pozitif hücreleri sadece Ksenograft tümör kesitinin ortasına tespit edilmiştir. (20X büyütme) Bu Figu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınızyeniden.
Şekil 7. Kollajen IV immünohistokimyası kanalları çevredeki sağlam bodrum membranlar ortaya koymaktadır. Normal meme kanalları (A) kollajen IV (diaminobenzidinin = kahverengi lekelenme) zenginleştirilmiş sağlam bazal membran ile çevrilidir. Organoid kültür takiben, meme dokusu da mammospheres DCIS'lı alanları türetilen ve teyit sağlam bodrum zarlarını içeren değil invaziv kanser (kollajen IV immünhistokimya, panel A 4X büyütme, panel B 10X). Dan daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif kültür sistemi temel ve translasyonel araştırma çalışmaları için yaşayan pre-invaziv neoplastik meme hücreleri üretmek için yeni bir model oluşturmaktadır. Geçmişte, pre-malignan göğüs kanserindeki ilerlemeler, tipik olarak üç farklı yöntem kullanılarak incelenmiştir. İlk yöntem histopatolojik ve microdissected dondurulmuş veya sabit insan örneklerinin 12-14 genetik analizi. İkinci yöntem, insan pre-invaziv meme lezyonlarının 15 benzer olduğu düşünülen hiperplastik alveol nodüller (HAN lezyonlar) ihtiva fare modelleri kullanır. Üçüncü model, morfoloji 3,4 gibi son derece farklılaşmış DCIS var MCf7 alt hatları (MCF10A) gibi meme kanseri hücre hatları kurulmuştur kullanır. Bu üç model meme kanseri ilerlemesine moleküler ipuçları vermiş olsa da, bu yöntemlerin hiçbiri malign potansiyeli veya hastanın bireysel lezyon (lar) moleküler fenotip değerlendirmek yeteneğine sahiptir. Histopathologic analizi ön-invazif lezyonlarında hücrelerin fonksiyonel fenotipi hakkında bilgi sağlamaz. Meme kanseri ilerlemesinde fare modeli yerinde 16-18 'de histomorphology ve insan atipik duktal hiperplazi, yerinde lobular karsinom çeşitliliği ve duktal karsinom yansıtmayabilir. Ayrıca, stromal mikro-ortam ve hücre-dışı matrisi çevreleyen, bir fare öncü lezyonların depozisyon insan muadili 16 belirgin bir şekilde farklıdır. Spontane fare öncü lezyonların, invazyon ve metastaz için ilerleme çok düşük seviyede sergileyebilir. Bağışıklık sistemi baskılanmış konaklar 3,4 naklediliyor eğer Üçüncü yöntem, kültürlü hücre hatları, sadece fonksiyonel fenotipik bilgi sağlayabilir. Buna ek olarak, bir uzun bir pasajlanmışlardır hücre çizgisinin genetik anormallikler insanlarda 2 spontan meme kanseri ilerlemesi temsil olmayabilir. Son olarak, iyi kurulmuş olduğu her hastanın neoplazmıişgali ve metastaz 13,14,17 için büyüme oranını, farklılaştırılmış devlet ve ilerlemesini sürücü genetik ve epigenetik anormalliklerin eşsiz bir kombinasyonu vardır. İnsan pre-invaziv lezyonlar hücre kompozisyon ve histomorphology multifokal ve heterojen vardır. Ayrıca, biyolojik malign potansiyel bir hastanın pre-invaziv lezyon için bilinmemektedir.
Bizim birincil doku kültürü yöntemi insan pre-invaziv meme kanseri önceki modellerin eksiklikleri gideren ve aşağıdaki avantajları sağlamaktadır: 1) organoid kültür sistemi kendiliğinden yetişen ve üretecek mammospheres oluşturmak doğal doku mikroçevresinin içinde neoplastik hücre popülasyonlarının büyümesini destekler fare ksenogreft modellerinde invaziv tümörler. Hücreler, tek bir hastanın genotipi ve fenotipi ve böylece kişiye tedavi veya tek tek prognoz için bilgi sağlar. 2) Organoid kültür sistemi Bakımains yerli hücre alt-popülasyonları bulunduğunu ve primer meme dokusu içinde orjinal olarak mevcut olmayan bir habis epitel hücreleri, stromal hücreler ve bağışıklık hücrelerini yetiştirmek için bir araç sağlar, ve organoid içinde kültürü yapılmıştır. Kültür sisteminde ortamının düşük hacimli bir suni bir üç boyutlu yapı iskeleleri için gerek kalmadan yapılar gibi spontan mammosphere oluşumu ve farklı kanal ve alveollere teşvik oksijen değişimini destekler. 3) Birincil hücre kültürü, enzimatik çözünme ya da egzojen genetik modifikasyonla elde modifikasyonlar ve seçim içermez. Bundan başka, besleyici ortam, düşük maliyetli ve hazırlanması basit. 4) moleküler ve genetik analiz tüm kültür bozmadan zaman içinde farklı noktalarda kültürden spesifik hücre popülasyonları ve / veya organoids üzerinde yapılabilir. 5) Organoid kültür sistemi yerel hücre popülasyonlarının büyümesi, ayırt morfolojisi ve hücre-hücre etkileşimleri izin veren canönce ve kültür ortamı içine terapötik maddeler ilave edildikten sonra incelenecektir.
Birincil doku kültürü bazı avantajları olmasına rağmen, herhangi bir sınırlama olmaksızın değildir. Organoid Kültür herhangi birine hücre tipinin büyümesi olmaksızın, karma hücre kültürlerinin gelişimini destekler. Fakat, hücre tipleri ile ilgili spesifik oran in vivo olarak bulunan tam hücresel oranlarını özetlemek olmayabilir ve böylece kontrol edilebilir ve edilemez. Başarılı organoid ekimi birçok toplum hastanenin patoloji laboratuvarlarında rutin işlemler değildir, her ikisi de steril doku toplanması ve işlenmesini gerektirir. Klinik araştırmacılar arasında iyi bir iletişim, cerrahi personel, ve patoloji personel hasta bakımı süreklilik içerisinde örnek sterilitenin sağlanması için gereklidir.
Organoid kültür Diğer bir kısıtlama, hücre fenotipinde ve gen ekspresyonu 16,19 üzerinde alt döküm sertlik etkisidir. Kültür içinde kök hücrelerin farklılaşmasıSerum ihtiva eden ortamda ilavesiyle indüklenebilir ya da kültürde uzun zamana bağlı olabilir. Bir kök benzeri fenotip, bu enzimatik olmayan serum içermeyen Organoid kültür sisteminde 5 birkaç ay sonra muhafaza edilmiştir. Hücreler, daha küçük, daha yoğun hale gelir ve mammospheres formu başarısız - Bununla birlikte, zaman içinde bir noktada, hücreler morfolojik olarak görülebilen ayırt edebilir. Böyle transfections gibi zamanla hücre fenotipi değişiklikler, moleküler deneyleri, potansiyel sorunları önlemek veya tahlilleri yıkmak için, oldukça eski kültürlerin (6 aydan fazla) daha genç kültürleri ile yapılmalıdır.
Başarılı organoid kültürüne tuşları kültürü şişesi ortamı uygun bir birim kullanarak ve organoids zaman doku kültürü şişesi uymak için izin vermiş olursunuz. Şişe sınırları oksijen geçirgenlikleri aşırı ölçüde ortam, mammosphere oluşumunu inhibe etmek. Ilk 3 - organoids TIS bağlanması için, doku kültürü 7 gün kritikkültür şişesi dava. Bir organoid gün 14 ile bağlı değil ise, genel olarak, büyük olasılıkla hiçbir canlı DCIS duktal kesimleri içermez ve yapışık hale olmaz. 14. günde yapışık olmayan Organoids kültürden çıkarılabilir olmalıdır. Uygun bir meme DCIS kanallarının olmaması% 10 formalin içinde organoid sabitlenmesi ve doku boyama ve mikroskopik değerlendirme için, parafin blokları halinde doku işleyerek sonra kültür doğrulanabilir.
Bizim enzimatik olmayan, serum içermeyen kültür sistemi bulguları invaziv potansiyeli genetik olarak anormal neoplastik ön-madde hücreleri, önceden invazif insan meme lezyonu 5,9,20 içinde var olduğu hipotezini desteklemektedir. Bu bulgu Sgroi ve ark., Insan meme ön-invaziv lezyonlar ve Damonte ark genetik analiz gerçekleştirdi. Meme intraepitelyal neoplazi akıbet okudu (MINO) meme kanseri ilerlemesi 12,14 sıçan modelinin önceki çalışmaları ile tutmak olduğunu 21. Alınan togeTher diğerlerinin sonuçlar ile, bireysel hasta önceden invaziv lezyonlar dahil olmak kültürü modeli, bir hastanın invasif göğüs kanserinin agresif fenotipi, büyük ölçüde ön-invazif aşamasında önceden belirlenmiş olabilir kavramını desteklemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma ile kısmen desteklenmiştir (1) Savunma Bakanlığı Meme Kanseri Araştırma Programı (US Army Medical Research Toplama Aktivitesi) # LAL için W81XVVH-10-1-0781 ve VE ödül ve (2) Susan G. Komen Vakfı hibe IR122224446 Lal ve VE etmek. Patoloji destek ve doku grossing nazik Inova Fairfax Patoloji Anabilim Dr. Hasan Nayer, Dr. Geetha A. Menezes, Dr. Charles Bechert'in tarafından sağlandı. Hasta rızası ve örnek ihale ustalıkla Inova Fairfax Hastanesi'nde klinik araştırma koordinatörleri Holly Gallimore Heather Huryk ve Emil Kamar tarafından yönlendiriliyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C.
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D'amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
