Summary
Primärzellkultur unter Verwendung von intaktem Gewebe Organoiden stellt ein Modellsystem, das die multizellulären Mikroumgebung in vivo nachahmt. Wir entwickelten ein Serum-freien Primär Brustepithel Gewebekulturmodell, das gemischte Zellkultur-Linien und Exponate differenzierte Morphologie perpetuiert, ohne enzymatische Gewebezerstörung. Breast Organoiden lebensfähig bleiben für> 6 Monate.
Abstract
Breast duktalen Carcinoma in situ (DCIS), per Definition, ist die Proliferation von Tumor Epithelzellen innerhalb der Grenzen des Brustgang, ohne dass der kollagenen Basalmembran. Während DCIS ist eine nicht-invasive obligate Vorläufer Brustkrebs sind die molekularen Mechanismen und Zellpopulationen, die Progression zu einem invasiven Krebs gestatten nicht vollständig bekannt. Zu bestimmen, ob Vorläuferzellen, die Invasion im DCIS Zellpopulation existiert, haben wir eine Methode zum Sammeln und Kulti sterile menschlichen Brustgewebe zum Zeitpunkt der Operation, ohne die enzymatische Zerstörung von Gewebe.
Sterile Brustgewebe enthält duktalen Segmente aus chirurgisch entfernt folgende Routine pathologische Untersuchung Brustgewebe geerntet. Tissue enthält DCIS wird in nährstoffreichen, antibiotikahaltigen, serumfreies Medium zur Gewebekulturlabor gebracht und transportiert. Das Brustgewebe wird weiter dissected, die verkalkten Stellen zu isolieren. Mehrere Brustgewebestücke (Organoiden) in einem minimalen Volumen von serumfreiem Medium in einem Kolben mit einem abnehmbaren Deckel und kultiviert in einem befeuchteten CO 2 -Inkubator gegeben. Epithelialen und Fibroblasten-Zellpopulationen ergeben sich aus der Organoid nach 10-14 Tagen haben. Mammospheres spontan auf und um die epitheliale Zellschicht. Spezifische Zellpopulationen können direkt aus dem Kolben ohne Störung benachbarter Zellen geerntet werden. Unsere nicht-enzymatische Gewebekultursystem zuverlässig verrät zytogenetisch abnormal, invasive Vorläuferzellen aus frischen menschlichen DCIS Läsionen.
Introduction
Proliferation von Epithelzellen innerhalb der Grenzen der Milchgänge und Alveolen (duktale Carcinoma in situ) als obligate Vorläufer invasive duktale und lobuläre Mammakarzinom erkannt. Dennoch sind die molekularen Mechanismen und Zellpopulationsdynamik, die Progression zu einem invasiven Krebs erlauben kaum verstanden. Aufklärung der Überlebensmechanismen von pre-invasiven Brustkrebszellen, oder jede präinvasiven Tumor verwendet wird, kann therapeutische Strategien für das Töten oder sogar verhindern, pre-invasiven Neoplasien 1 offenbaren. Doch einfache Low-Cost-Methoden zur funktions Studium der menschlichen präinvasiven Läsionen haben gefehlt. Obwohl in vitro Monokultur von transformierten Zelllinien ist eine etablierte Labormethode, der Phänotyp und Genotyp dieser immortalisierten Zelllinien nicht die Molekular Status der primären menschlichen Tumorzellen 2 zu wiederholen. Selbst die nicht-tumor MCF-10A Zelllinie, die recapitulates 3-D Brustdrüse Architektur nicht die funktionellen Phänotyp und molekularen Eigenschaften des pre-invasive Brustläsion 3,4 einzelnen Patienten adäquat zu repräsentieren.
Zu bestimmen, ob stielartigen neoplastischen Zellen fähig Invasion im duktalen Carcinoma in situ (DCIS) Zellpopulation existiert, eine Methodik entwickelt, die wir für das Sammeln und Kulti sterile menschlichen Brustgewebe zum Zeitpunkt der Operation (1) 5. Unsere ex vivo Brust organoiden Kultursystem nicht auf die enzymatische Gewebe-Zerstörung, Basalmembran-Matrix-Extrakt oder Fibroblasten Verarmungs verlassen, für Isolierung und Vermehrung mammosphere bildenden Zellen aus frischem menschlichen Brustkarzinomgewebe duktalen 6-8. Unser neues System ist auf dem Prinzip der Zelle Streaming / Migrations 5 basiert. Die erkennbaren Milchgänge, und die umliegenden Stroma sind in einem Mindestvolumen von Serum-freien Nährmedium (nur E tauchtnough die Kanalfragmente umfassen), um den Gasaustausch in keiner bestimmten Ausrichtung in den Kolben (1E-F) zu maximieren, mit der Schnittfläche des Kanals in das Kulturmedium ausgesetzt ist, aber. Dieses Kultursystem erlaubt den Zellen, aus dem Kanal und in / auf dem autologen Stroma und Kulturkolben migrieren. Das Nährmedium, nur Epidermal Growth Factor (EGF), Insulin und Antibiotika ergänzt, fördert das Wachstum von gemischten Zellpopulationen aus dem organoiden ausgeht. Die Gewebekulturflasche hat einen abnehmbaren, wiederverschließbaren Deckel, die Organoide und / oder Zellen ohne Unterbrechung der gesamte Kolben oder Nachbar Organoiden geerntet werden können, während eine sterile feuchten Umgebung.
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Protocol
Menschlichem Brustgewebe wurde von Patienten in einer Forschungsstudie eingeschrieben, mit schriftlicher Einwilligung erhoben, nach Department of Defense, George Mason University, und genehmigte Protokolle Inova Health System Institutional Review Board.
1. Bereiten Nährstoff reiches Medium mit Wachstumsfaktoren und Antibiotika
- Stammlösungen von Insulin, epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Streptomycinsulfat und Gentamicinsulfat.
- Rekonstitution in sterile Insulin gefilterte Wasser auf eine Endkonzentration von 10 mg / ml. Saugen Sie 10 ml Typ 1 analysenreinem Wasser in einem sterilen 10 ml Einwegspritze. Bringen Sie einen 0,22 um Polyethersulfon-Filter an der Spritze. Verzichten die sterile gefilterte Wasser in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen.
- 10 ml steril filtriert Wasser zu einer 100 mg Ampulle von Insulin. Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Halten Sie das Insulinfläschchen auf Eis. Dispense 450 ul der Insulinstammlösungention in beschriftete, sterile Mikrozentrifugenröhrchen und bei -20 ° C. Insulin-Stammlösung ist bis zum Verfallsdatum auf dem Fläschchen stabil.
- Bereiten Stammlösung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF): In 500 ul sterilem Wasser auf 500 ug EGF (Lager 1 ug / ul). Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Halten Sie den EGF Fläschchen auf Eis.
- Bereiten Sie eine Arbeitsstammlösung von EGF: 100 l des Aktien EGF-Lösung bis 900 & mgr; l Nährmedium (Arbeits Aktie 0,1 ug / ul sein). Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Geben Sie 50 ul der EGF Arbeitsstammlösung in beschriftete, sterile Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C.
HINWEIS: EGF-Stammlösung (1 ug / ul) ist für 1 Jahr stabil bei -80 ° C; Arbeitsstammlösung (0,1 ug / ul) ist 2 Monate bei -80 ° C stabil.
- Bereiten Sie eine Arbeitsstammlösung von EGF: 100 l des Aktien EGF-Lösung bis 900 & mgr; l Nährmedium (Arbeits Aktie 0,1 ug / ul sein). Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Geben Sie 50 ul der EGF Arbeitsstammlösung in beschriftete, sterile Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C.
- Wiegt 40 mg Streptomycinsulfat auf einer Analysenwaage. Legen Sie die Streptomycinsulfat intoa sterile 15 ml konischen Röhrchen. 4 ml Nährmedium. Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Die Lösung sollte leicht rosa sein. Lagerung bei 4 ° C lichtgeschützt lagern. Streptomycinsulfat-Lösung ist für 7 Tage stabil.
- Wiegt 20 mg Gentamicinsulfat auf einer Analysenwaage. Legen Sie die Gentamycinsulfat in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen. 2 ml Nährmedium. Mischen Sie den Inhalt kurz auf einem Vortex-Mischer. Die Lösung sollte gelb sein. Lagerung bei 4 ° C lichtgeschützt lagern. Gentamicin-Sulfat-Lösung ist für 7 Tage stabil.
- Vorbereitung zwei 200 ml Chargen Nährmedium mit humanem rekombinantem EGF ergänzt (10 ng / ml Endkonzentration.), Insulin (10 ug / ml Endkonzentration.), Streptomycinsulfat (100 ug / ml Endkonzentration.) Und Gentamicinsulfat (20 ug / ml Endkonzentration.).
- In 200 ml Nährmedium mit einer Vakuumfilterkolben mit 0,2 um Polyethersulfon Filterkolben ausgestattet und einem 250 ml Auffangflasche. In 20 &# 181; l Arbeitsstamm EGF, 200 ul Lager Insulin, 2 ml Stammstreptomycinsulfat und 400 ul Lager Gentamycinsulfat zum 200 ml Nährmedium. Die Filterkolben anbringen zu einem Vakuum. Filtern Sie die Medium. Entsorgen Sie den Filter und den Kolben als "nährstoffreichen Medium" zu kennzeichnen. Lagerung bei 4 ° C für bis zu 14 Tage.
2. Die Gewebeerfassung und Hochrechnung
- Im Operationsbereich, pflegen steriler Technik nach Beschaffung des Brustgewebes. Legen Sie das Brustgewebe in einem sterilen Tablett und decken das Tablett mit sterilen Plastikfolie.
- Transportieren Sie das Gewebe in der überdachten Fach Radiologie / Pathologie, wie durch Ihre Institution erforderlich. Das Fach nicht öffnen. Transportzeiten variieren innerhalb der Institutionen. Gewebe kann in diesem überdachten Fach bei RT bis zu 45 min nach Exzision lebensfähig bleiben. , Schnelle Verarbeitung des Gewebes in nährstoffreichen Medium bietet jedoch optimale Bedingungen für die anschließende Organoid Kultur.
- Gross Gewebedissektion die mit Bereichen von DCIS innerhalb des Brustgewebes zu identifizieren: Verwenden Sie sterile Handschuhe, Klingen, Skalpelle, Gewebemarkierungsfarbstoffe und Essig während Gewebedissektion um Gewebe Sterilität aufrechtzuerhalten.
- Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol oder 1% Bleichmittel. Öffnen Sie die sterile Handschuhe und setzen Sie den Handschuh-Wrapper auf die Arbeitsfläche. Legen Sie das sterile Innere des Handschuhs Wrapper Gesicht. Setzen Sie auf die sterile Handschuhe.
- Reinigen der Oberfläche des Probenbehälters mit 70% Ethanol. Entfernen Sie die Plastikfolie von der Gewebeprobenbehälter und legen Sie die Probe auf dem Handschuh-Wrapper.
- Tauchen Sie zwei Wattestäbchen Abstriche in das Gewebe Markierungsfarbstoff. Anwendung des Farbstoffs an der Oberfläche des Gewebes durch Walzen die Tupfer über die Gewebeoberfläche.
Hinweis: Jeder Pathologie hat einen standardisierten Farbstoff Farbe / Gewebeorientierung Protokoll. Gewebe mit Farbstoff markiert, um das Gewebe in Bezug auf seine Position in dem Patienten orientieren. Der Farbstoff wird ausgelöscht oderauf das Gewebe lackiert. Füllen Sie nicht den Farbstoff über das Gewebe. Gießen der Farbstoff kann bewirken, dass der Farbstoff in das Gewebe Ritzen so verwirrend die Ausrichtung der operativen Margen führen / Tropf. Tissue Orientierung bietet dem Chirurgen und Pathologen mit anatomischen Merkmalen, um a) eine Beschreibung der Gewebeprobe und b) bestimmen die Lage der operativen Margen in Bezug auf den Tumor. - Gießen destilliertem weißen Essig (5% Essigsäure) auf steriler Gaze-Pads. Tupfen Sie das gefärbte Gewebe mit dem Essig getränkten Gaze. Entsorgen Sie die Gaze. Essig wird die Markierung im Gewebe Farbstoffe zu fixieren.
- Schneiden Sie das Brustgewebe in vertikale Scheiben ca. 5 mm dick. Schneiden Sie nicht den ganzen Weg durch das Gewebe (Abbildung 2). Beobachten / ertasten das Gewebe für Bereiche der Verkalkung. Identifizieren DCIS Läsionen durch ihre charakteristische Firma, blasse Erscheinung durch rötliche umgeben, gummi Grenzen, die kiesigen fühlen (wegen Calcium spicules).
HINWEIS: In einigen Fällen kann Mitesser (Pickel-like) Gebietenals weißen Punkten, die nekrotischen Material von großem Durchmesser DCIS Läsionen gesehen. - Schnitten Bereiche DCIS / verkalkt Brustgewebe, einschließlich einer geringen Menge umgebenden Brustgewebe. Legen Sie das Brustgewebe in ein steriles 50 ml Röhrchen mit 20-30 ml nährstoffreichen Medium in Schritt 1 vorbereitet.
- Mischen Sie das Gewebe und Medium durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens mehrmals. Entsorgen Sie das Medium und fügen frisches Medium. Das Röhrchen wird das Gewebe und Medium, das in einem isolierten Behälter und Transportieren des Gewebes an den Gewebekulturlabor.
- Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol oder 1% Bleichmittel. Öffnen Sie die sterile Handschuhe und setzen Sie den Handschuh-Wrapper auf die Arbeitsfläche. Legen Sie das sterile Innere des Handschuhs Wrapper Gesicht. Setzen Sie auf die sterile Handschuhe.
3. Gewebekultur
- Arbeiten in einem biologischen Sicherheitsschrank, gießt das Gewebe und eine kleine Menge des Nährmediums in eine sterile Petrischale. Mit einem sterilen Skalpell weggeschnitten und entsorgen Sie die Fasergewebe. Schneiden Sie das Brustgewebe in Stücke (Organoiden) ca. 3 mm 2 (1C-D). Versuchen Sie, das Gewebe zu schneiden, so dass jedes Organoid mindestens eine erkennbare Kanalabschnitt mit umgebenden Stroma.
- Öffnen Sie den Deckel der Zellkulturflasche. Mit einer sterilen Pinzette oder Zange, legen Sie die Organoiden in den Kolben. Schließen Sie den Deckel. Entsorgen Sie die Petrischale.
- Hinzufügen 11 ml serumfreien nährstoffreichen Medium (hergestellt in Schritt 1) zu der Zellkulturflasche. Das Gefäß verschließen und den Kolben wirbeln so die Organoiden und mittlere gleichmäßig über die Flaschenoberfläche (1E-F) verteilt.
- Der Kolben wird bei 37 ° C inkubieren in einer befeuchteten 5,0% CO 2 -Atmosphäre für 2 Tage. Sie nicht den Kolben während dieser Zeit bewegen.
- Am Tag 2 nach der Inkubation, entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator, um für potenzielle Bakterien / Pilzbefall zu überprüfen. Vermeiden Sie plötzliche, heftige Bewegungen oder Verwirbelung des Kolbens. Den Kolben in einem inversen Mikroskop Bühne.
- Beachten Sie das Medium für Bakterien, Hefen und / oder Pilzbefall. Wenn keine Verunreinigungen festgestellt wird, wird der Kolben zurück in den Inkubator für eine Zusatzitional Tag. Wenn eine Kontamination festgestellt wird, entsorgen Sie die Kolben und der Inhalt in einen geeigneten Behälter.
- Am Tag 3 nach der Inkubation, ersetzen Sie das konditionierte Medium mit frischem Medium.
- Platzieren 11 ml Medium in einem sterilen Röhrchen bei 37 ° C für 20-30 min. Die Zellkulturflasche aus dem Inkubator entfernen. Ohne die Organoiden stören, entfernen und entsorgen Sie das Medium in den Kolben mit einer sterilen serologischen Pipette.
- Mit Hilfe einer neuen sterilen serologischen Pipette 11 ml des vorgewärmten frisches Medium. Sehr sanft drehen Sie den Kolben, um das Medium über die Flaschenoberfläche zu verteilen.
- Der Kolben wird bei 37 ° C in einer befeuchteten 5,0% CO 2 -Atmosphäre inkubiert.
4. Wartung von Gegründet Organoide / Epithelzellen Kolonien
- Bereiten Sie frisches Medium alle 2 Wochen und ersetzen Sie die Medien in der Zellkulturflasche 3-mal pro Woche.
- Platzieren 11 ml Medium in einem sterilen Behälter in 37° C für 20-30 min. Die Flasche aus dem Inkubator entfernen. Mit einem sterilen serologischen Pipette, entfernen und entsorgen Sie die konditionierte Medium aus dem Kolben, wobei Sie darauf achten, nicht die Organoiden stören.
- Mit Hilfe einer neuen sterilen serologischen Pipette 11 ml des vorgewärmten frisches Medium. Sehr sanft drehen Sie den Kolben, um das Medium über die Flaschenoberfläche zu verteilen. Der Kolben wird bei 37 ° C in einer befeuchteten 5,0% CO 2 -Atmosphäre inkubiert.
- Nach von 10 - 14 Tagen in Kultur, entfernen alle Gewebestücke in der Kulturflasche, die nicht adhärenten sind.
- Periodisch Ernten der Zellen und / oder Organoide aus dem Kolben für eine Ausbreitung in neue Kulturflaschen für Xenograft-Transplantation oder zur phänotypischen und / oder molekulare Analyse.
- Die Zellkulturflasche aus dem Inkubator entfernen. Sprühen Sie den Kolben, der mit 70% Ethanol. Wischen überschüssiges Ethanol zu dem Kolben mit einem sauberen Papiertuch, das mit 70% Ethanol besprüht wurde.
- Organoid Vermehrung: <ol>
- Öffnen Sie den Deckel der Flasche und legen Sie den Deckel offen in der biologischen Sicherheitsschrank. Unter mikroskopischer Visualisierung, suchen Sie die Organoid (n), geerntet werden. Verwenden Sie sterile Pinzette oder Zange zu Pick-up ein organoides.
- Um die Organoid in einem neuen Kulturflasche zu propagieren, setzen Sie den Organoid im neuen Kolben. In 11 ml frischem, warmem Medium. Inkubieren bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO 2 Atmosphäre wie in den Schritten 3.3 - 3.6.3. Ersetzen Sie das Zellkulturmedium in der Zellkulturflasche dreimal pro Woche.
- Ernten der Zellen:
- Unter direkte mikroskopische vixualization, vorsichtig abkratzen und saugen Zellen und mammospheres mit einem 1000 ul Pipette mit sterilen Einweg-Pipettenspitzen. Saugen Sie die Zellen und umgebenden Medium. Verzichten die Zellen / Medium in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen.
- Dreh die Zellen kurz in einem Mini-Zentrifuge bei 12.100 xg für 5 sec. Entfernen und entsorgen Sie das Medium. <ol>
- Zur DNA-Analyse, sofort gefrier das Zellpellet auf Trockeneis in einem kleinen Mediumvolumen (10 ul), mit langfristiger Lagerung bei -80 ° C.
- Zur Proteomanalyse, lysieren die Zellen in 10 ul 8 M Harnstoff für die Massenspektrometrie oder 2x SDS Tris-Glycin-Puffer für Western Blot / Umkehrphasen-Protein-Microarrays. Alternativ drehen Zellen in einem Zytozentrifuge zu Zellabstriche zur immunhistochemischen Analyse zu machen.
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Representative Results
Workflow für die Beschaffung und das Kultivieren sterile Brust duktalen Carcinoma in situ Tissue
Brustgewebe Sterilität aus dem Operationssaal in die Zellkulturlabor über geringfügige Änderungen in typischen Krankenhauspathologie Workflow (Abbildung 1) gehalten. Gewebe wird in einem sterilen Behälter mit einer Deckfolie, die radiologische Beurteilung ermöglicht unter Beibehaltung der Sterilität Gewebe transportiert. Gross Gewebeverarbeitung einer Brust Lumpektomie oder Mastektomie Probe wird mit sterilen Handschuhen, Schaufeln und Gewebemarkierungsfarbstoffen durchgeführt. Gross morphologische Erscheinungsbild der Brust duktalen Carcinoma in situ ähnelt blasse, leicht erhabene Bereiche mit einer kiesigen / feste Textur, von rötlich / gelb gummi Gewebe umgeben. Gebiete duktalen Hyperplasie und DCIS kann "gritty" und fest durch Verkalkungen fühlen. Diese Bereiche des Brustgewebes erscheinen oft tan oder eine etwas andere Farbe als das umgebende Brustgewebe. Jedoch ADH cein erst nach Gewebesammlung und pathologische Überprüfung der gefärbten Gewebeschnitten zu unterscheiden. Brustgewebe durch Eintauchen der lebensfähigen Gewebe und / oder duktalen Organoiden in serumfreien Nährmedium mit humanem rekombinantem EGF (10 ng / ml), Insulin (10 ug / ml), Streptomycinsulfat (100 ug / ml) und Gentamicinsulfat ergänzt bleibt (20 ug / ml) 5. Zellkulturflaschen mit abnehmbarer / wiederverschließbaren Deckel erlauben regelmäßige Ernte von Zellen / Organoiden (1E-F). Dieses Modell der menschlichen Mutter präinvasiven Läsionen erfolgreich propagiert aus mehr als 20 Patienten mit atypischen duktalen Hyperplasie diagnostiziert (n = 2) und duktalen Carcinoma in situ (n = 18).
Spontane mammosphere Bildung in vitro und in vivo
Mammospheres und 3-D-Strukturen entstanden spontan aus mehreren, unabhängigen Menschen DCIS Kanal Gewebefragmente von verschiedenen Patienten mit atypischen duktalen hyper diagnostiziertplasie oder duktalen Carcinoma in situ (Abbildung 3 und 4) 5,9. Enzymatische Störung des Brustgewebes nicht vor der Gewebekultur, die in einer gemischten Zelltyp-Kultur führte geführt. Für spontane mammosphere Bildung (Abbildung 4) waren weder Serum, Basalmembran-Extrakt, noch gelartige Matrizen benötigt. Die mammospheres erzeugt Brust Xenotransplantat-Tumoren in einem NOD / SCID-Maus-Modell mit dem gleichen Muster wie das Wachstum von invasiven Krebs (5) 5. Diese Ergebnisse zeigen, dass Vorläuferzellen im menschlichen Brust invasive Potential vorge vorhanden DCIS Kanal sind jedoch anscheinend in Prüfung durch das duktale Nische gehalten und kann entlockt in organoiden Kultur hervor werden. Diese Zellen bilden eine neue Kategorie von Bruststielartigen Zellen, die vor dem offenen Manifestation des invasiven Phänotyps 5,9,10 existieren.
Bestätigung der epithelialen abgeleitet mammospheres und xenografts
Die mammospheres und Heterotransplantate aus den mammospheres abgeleitet wurden durch Immunfluoreszenz als mit epithelialen Ursprung bestätigt. Epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) ist ein Glykoprotein von 11 Epithelzellen exprimiert. Immunfluoreszenz mit einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen humanes EpCAM (grün) und eine Kernfärbung (DAPI, blau) reaktive zeigten EpCAM-positive Zellen in der Kultur in mammospheres (6A) und die Mitte eines NOD / SCID-Xenotransplantat (6B).
Überprüfung der intakten Basalmembran Grenzen
Die mammosphere bilden, neoplastischen Epithelzellen in diesem Kultursystem wurden aus pre-invasiven Brustläsionen, die frei von frank Invasion oder Mikroinvasion waren abgeleitet, wie von unabhängigen pathologischen Analyse unter Standardbehandlung histopathologischen Diagnose verifiziert. Mehr organoiden Strukturen vom gleichen Patienten erzeugt mammosphere fürming Kolonien, die tumorigene erwiesen. Darüber hinaus histopathologische Untersuchung des für Organoid Kultur verwendet Gewebe ergab konfluenten intraduktalen Läsionen mit intakter Basalmembran Grenzen (7B) 5. Somit kann gefolgert werden, daß die spontane mammospheres in diesem Kultursystem gebildet werden nur von pre-invasive Tumorbereichen abgeleitet sind und nicht ein Produkt der seltenen Bereichen Mikroinvasion 5 werden.
Abbildung 1. Workflow für die Aufrechterhaltung Gewebe Sterilität während der radiologischen Bildgebung und grobe Gewebedissektion. (A) In der Betriebs Suite, wird das Brustgewebe (Lumpektomie Probe gezeigt) in einer sterilen Schale gelegt und mit sterilen Plastikfolie abgedeckt. Das Gewebe kann direkt in der Kunststoffschale abgebildet werden kann. (B) Gewebeeinspiel zu identifizieren Bereichen DCIS. Single-Use nur Gewebeorientierung Farbstoffe werden auf die Gewebeoberfläche mit sterilen Wattestäbchen Abstriche gemalt. Haushalts destilliertem Essig wird direkt auf das Gewebe gegossen und mit sterilen Wattebausch geblottet. (C & D) Brustgewebe zur Gewebekulturlabor in nährstoffreichen Medium, ergänzt mit Antibiotika, transportiert. Gewebedissektion, um die Bereiche des DCIS zu isolieren, wird mit sterilen Handschuhen und Schaufeln / Skalpelle / Schere durchgeführt. Das DCIS Gewebe in mehrere Organoiden für Kultur geschnitten. (E & F) In-vitro-Kultur von Mutter Organoiden. Menschliche DCIS Gewebe direkt in Gewebekulturflaschen mit abnehmbarem Deckel gestellt, ohne vorherige enzymatische Verdauung des Gewebes. Eine minimale Menge an serumfreies Kulturmedium mit dem epidermalen Wachstumsfaktor und Insulin unterstützt das Zellwachstum, während eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche auf der organoiden.6fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Abbildung der Bruttogewebeverarbeitung für Brust DCIS Gewebe. Die Lumpektomie oder Mastektomie Gewebe in dünne Schnitte durch Schneiden des Gewebes vertikal ohne Schneiden den ganzen Weg durch die Probe geschnitten. Diese Dissektion Methode wird oft als "Brotlaib-Technik" bezeichnet, da der Schnitt Gewebe ähnelt einem Laib Brot. Die Fläche (n) zu enthalten DCIS vermutet werden herausgeschnitten und in 2 geschnitten - 3 mm Scheiben für diagnostische Pathologie und organoiden Kultur.
Abbildung 3. Eine gemischte Zelltyp Kulturhält Vertreter in vivo Zellpopulationen. (A) Phasenkontrastbild gemischt aus Brust- erzeugten Zellkultur DCIS Läsionen über 11 Wochen (4-fache Vergrößerung). (B & C) In vitro Organoid Anbau erfolgreich propagierte DCIS abgeleiteten Epithelzellen mit Verankerung unabhängiges Wachstum, definiert als nach oben wächst und expandiert mammospheres und gelappt, kanalartige 3-D-Formationen, in serumfreiem Medium mit EGF, Insulin, Streptomycin und Gentamicin (10-facher Vergrößerung) ergänzt. (D) Beispiel mammosphere nach 11 Wochen in der Kultur (40-facher Vergrößerung) gebildet. Bitte klicken Sie hier, um sehen Sie eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. SpontaneBildung mammospheres in Serum freien Organoid Kultur. Ein Beispiel mammosphere Bildung nach 33 Tage der Kultur (10-facher Vergrößerung, 20X Kasten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. NOD / SCID-Maus-Xenograft-Modell. Xenografts wurden durch Injektion Epithelzellen aus einem Patienten mit DCIS (rechte Mausbrustfettpolster) oder von einem Patienten mit invasiver DCIS (linke Mausbrustfettpolster) diagnostiziert diagnostiziert abgeleitet erzeugt. Xenografts von beiden reinen DCIS und invasive DCIS abgeleitet ergab ein ähnliches Wachstumsmuster und bewerten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen tseine Figur.
Abbildung 6 Mammospheres werden bestätigt epithelialen Ursprungs sein. Immunfluoreszenz mit anti-EpCAM an FITC konjugiert war, verwendet, um den epithelialen Ursprung mammospheres und Maus-Xenotransplantaten von Milchgänge enthält DCIS erzeugt bestätigen. (A) EpCAM-FITC-positiven Zellen (pseudo- farbig grün, 488 nm) wurden nur in mammospheres der gemischten Zellkulturen aus Brust Organoiden ausgeht (DAPI (pseudo-farbig blau, 408 nm) Kernfärbung) gesehen. (B) in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Maus Xenograft Gewebeschnitten, EpCAM positive Zellen wurden nur in der Mitte des Xenotransplantats Tumorabschnitt erfasst. (20-facher Vergrößerung) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses figu ansehenre.
Abbildung 7. Collagen IV Immunhistochemie zeigt intakten Basalmembranen umliegenden Kanäle. Normale Milchgänge (A) werden durch intakte Basalmembran in Kollagen IV (Diaminobenzidin = braun-Färbung) angereichert umgeben. Nach Organoid Kultur, enthält Brustgewebe auch intakte Basalmembran bestätigt, dass die mammospheres aus Bereichen der DCIS und nicht aus invasiven Krebs (Kollagen IV Immunhistochemie, Feld A 4-fache Vergrößerung, Panel B 10X). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl.
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Discussion
Die hier beschriebene Kultursystem stellt ein neues Modell für die Erzeugung leben präinvasiven neoplastischer Brustzellen für die Grundlagenforschung und translationale Forschung Studien. In der Vergangenheit hat prämalignen Brustkrebsprogression typischerweise unter Verwendung von drei verschiedenen Verfahren untersucht. Die erste Methode ist histopathologischen und genetischen Analyse mikrodisseziert gefroren oder festen Proben menschlichen 12-14. Die zweite Methode nutzt Mausmodellen, die hyperplastische alveolären Knötchen (HAN Läsionen) enthalten, die vermutlich ähnlich dem menschlichen präinvasiven Brustläsionen 15 zu sein. Das dritte Modell verwendet etablierte Brustkarzinom-Zelllinien wie MCF7 Unterlinien (MCF10A), die eine stark differenzierte Morphologie DCIS 3,4 haben. Obwohl diese drei Modelle Molekular Hinweise auf das Fortschreiten von Brustkrebs vorgesehen ist, keine dieser Methoden für die Auswertung der malignen Potential oder die molekulare Phänotyp Läsion (en) eines einzelnen Patienten. Histopathologic Analyse keine Informationen über die funktionellen Phänotyp der Zellen in den vor-invasive Läsionen. Das Mausmodell für Brustkrebs Progression kann nicht genau die Histomorphologie und die Vielfalt der menschlichen atypischen duktalen Hyperplasie, lobuläre Carcinoma in situ, und duktalen Carcinoma in situ 16-18. Ferner die stromale Mikroumgebung und die Abscheidung von extrazellulärer Matrix umgebenden Maus Vorstufen unterscheiden sich deutlich von dem menschlichen Gegenstück 16. Spontane murinen Vorläuferläsionen kann eine sehr niedrige Niveau der Progression zur Invasion und Metastasierung aufweisen. Das dritte Verfahren, kultivierte Zelllinien kann nur funktional phänotypischen Informationen liefern, wenn sie in immunsupprimierten Wirten 3,4 transplantiert. Darüber hinaus sind die genetische Anomalien eines langen agiert Zelllinie kann nicht vertreten spontanen Brustkrebs Progression beim Menschen 2. Schließlich ist es bekannt, dass Neubildung jedes Patientenbesitzt eine einzigartige Kombination von genetischen und epigenetischen Anomalien, die Wachstumsrate, differenzierten Zustand, und Fortschreiten zu der Invasion und Metastasierung 13,14,17 fahren. Menschliche präinvasiven Läsionen sind multifokale und heterogen in Zellzusammensetzung und Gewebemorphologie. Darüber hinaus ist die biologische malignes Potenzial für Pre-invasive Läsion des einzelnen Patienten unbekannt.
Unsere primäre Gewebekulturverfahren beseitigt die Mängel der bisherigen Modelle der menschlichen präinvasiven Brustkrebs und bietet die folgenden Vorteile: 1) Die Organoid Kultursystem unterstützt das Wachstum von Tumorzellpopulationen innerhalb der nativen Gewebemikroumgebung, die spontan wachsen und mammospheres, die produzieren wird invasive Tumoren in Maus-Xenograft-Modellen. Die Zellen stellen den Genotyp und Phänotyp des individuellen Patienten und dadurch Informationen für personalisierte Therapie oder individuelle Prognose. 2) Der Organoid Kultursystem maintAINS die nativen zellulären Subpopulationen und bietet die Möglichkeit, nicht-malignen Epithelzellen, Stromazellen und Immunzellen ursprünglich in der primären Brustgewebe vorhanden kultivieren und im Organoid in Kultur durchgeführt. Das geringe Volumen der Medien in dem Kultursystem unterstützt Sauerstoffaustausch fördern spontane mammosphere Bildung und differenzierte Kanal und Alveolen artigen Strukturen ohne die Notwendigkeit einer künstlichen dreidimensionalen Gerüst. 3) Die primäre Zellkultur frei von Modifikationen und Auswahl durch enzymatische Spaltung oder exogenen genetischen Veränderung erzeugt. Darüber hinaus ist das Nährmedium kostengünstige und einfach herzustellen. 4) Molekulare und genetische Analyse kann auf bestimmte Zellpopulationen und / oder Organoide aus der Kultur zu verschiedenen Zeitpunkten, ohne die gesamte Kultur Unterbrechung durchgeführt werden. 5) Der Organoid Kultursystem ermöglicht das Wachstum, die differenzierte Morphologie und Zell-Zell-Wechselwirkungen der nativen Zellpopulationen, die könnenvor und nach der Einführung von therapeutischen Wirkstoffen in das Kulturmedium untersucht.
Obwohl primären Gewebekultur hat bestimmte Vorteile, ist es nicht ohne Einschränkungen. Die Organoid Kultur unterstützt Wachstum von gemischten Zellkulturen ohne übermäßiges Wachstum von einem Zelltyp. Jedoch kann der spezifische Verhältnis von Zelltypen, die nicht gesteuert werden und kann somit nicht die genauen Verhältnisse zellulären in vivo gefunden rekapitulieren. Erfolgreiche Organoid Anbau erfordert sterile Gewebeerhebung und -verarbeitung, die beide nicht Routineverfahren in vielen kommunalen Krankenhaus Pathologie-Laboratorien. Gute Kommunikation zwischen den klinischen Forschern, OP-Personal und Pathologie Mitarbeiter sind wesentlich für die Aufrechterhaltung Probe Sterilität im Kontinuum der Patientenversorgung.
Eine weitere Einschränkung des organoiden Kultur ist die Wirkung der Erde Festigkeit auf zelluläre Phänotyp und Genexpression 16,19. Differenzierung von Stammzellen in Kulturkann durch Zugabe von serumhaltigem Medium oder induziert werden kann durch längere Zeit in Kultur. Ein Stamm-ähnlichen Phänotyp wurde nach mehreren Monaten in diesem nicht-enzymatische, serumfreien Kultursystem organoiden 5 gehalten. Jedoch an einem bestimmten Punkt in der Zeit können die Zellen differenzieren, die morphologisch gesehen werden kann - die Zellen kleiner, dichter zu werden, und nicht zu mammospheres bilden. Um mögliche Probleme mit den Veränderungen in Zellphänotyp im Laufe der Zeit, molekulare Experimente wie Transfektionen vermeiden oder knock down Assays sollte mit jungen Kulturen anstatt mit alten Kulturen (mehr als 6 Monate) durchgeführt werden.
Der Schlüssel zum erfolgreichen organoiden Kultur werden mit einem geeigneten Volumen des Mediums in der Kulturflasche, und es dem Organoiden Zeit, zu der Gewebekulturflasche haften. Überschüssiges Medium im Kolben Grenzen Sauerstoffdiffusion und hemmt mammosphere Bildung. Die ersten 3 - 7 Tage die Gewebekultur sind entscheidend für die Organoide, um zum Befestigen tisverklagen Kulturflasche. Im Allgemeinen, wenn ein Organoid wurde nicht von Tag 14 angebracht ist, ist es wahrscheinlich keine tragfähige DCIS duktalen Segmente enthalten und wird nicht haft geworden. Organoide, die nicht bis zum Tag 14 verwachsen sind, sollten aus der Kultur entfernt werden. Der Mangel an lebensfähigen Brust DCIS Kanäle können folgende Kultur durch Fixieren des organoiden in 10% Formalin und Verarbeiten der Gewebe in Paraffinblöcken für Tissue-Färbung und mikroskopische Untersuchung überprüft werden.
Unsere nicht-enzymatische, Serum-freien Kultursystem Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass genetisch abnormen Tumorvorläuferzellen mit invasiven Potential innerhalb präinvasiven menschlichen Brustläsionen 5,9,20 existieren. Dieser Befund ist im Einklang mit der bisherigen Arbeit von Sgroi et al., Die genetische Analyse der menschlichen Brust präinvasiven Läsionen und Damonte et al., Die die Brust intraepitheliale Neoplasie Auswuchs sucht (Mino) Mausmodell für Brustkrebs Progression 12,14 , 21. Taken together mit den Schlussfolgerungen der anderen, unserer Kultur Modell der einzelnen Patienten vor, eine invasive Läsionen unterstützt das Konzept, dass die aggressive Phänotyp von invasivem Brustkrebs eines Patienten kann in der pre-invasiven Stadium weitgehend vorbestimmt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch (1) das Verteidigungsministerium Breast Cancer Research Program (US Army Medical Research Acquisition Activity) preis # W81XVVH-10-1-0781 LAL und VE, und (2) die Susan G. Komen Foundation Grant IR122224446 Lal und VE. Pathologie Unterstützung und Gewebehochrechnungs wurde freundlicherweise von Inova Fairfax Pathologie-Abteilung, Dr. Hassan Nayer, Dr. Gita A. Menezes, und Dr. Charles Bechert vorgesehen. Patienteneinwilligung und Probenbeschaffung wurde fachmännisch von Inova Fairfax Hospital klinischen Forschungskoordinatoren Holly Gallimore, Heather Huryk und Emil Kamar geführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
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