Summary
תרבית תאים ראשונית באמצעות organoids רקמה שלמה מספקת מערכת מודל המחקה את המיקרו-הסביבה רב-התאית בגוף חי. פיתחנו מודל סרום ללא עיקרי רקמת האפיתל שד תרבות המנציח שושלות מעורבות תרבית תאים ותערוכות מובחנות מורפולוגיה, ללא הפרעה רקמה האנזימטית. organoids השד בר-קיימא ל> 6 חודשים.
Abstract
קרצינומה של צינוריות שד באתרו (DCIS), בהגדרה, היא התפשטות של תאי אפיתל גידולים בתחומי צינוריות השד, מבלי לפרוץ את הקרום במרתף collagenous. בעוד DCIS הוא מבשר שאינו מחייב לסרטן שד פולשני, המנגנונים המולקולריים ואוכלוסיות תאים המאפשרים התקדמות לסרטן פולשני אינם ידועים במלואו. כדי לקבוע אם תאים מסוגלים פלישה היו קיימים בתוך אוכלוסיית תאי DCIS, שפיתחנו מתודולוגיה לאיסוף וculturing רקמת שד האנושי סטרילי בזמן הניתוח, ללא הפרעה אנזימטית של רקמה.
רקמת שד סטרילי המכילה קטעי ductal שנקטפו מרקמת שד שנכרת בניתוח לאחר בדיקה פתולוגית שגרתית. רקמה המכילה DCIS ממוקמת במדיום מזין עשיר, המכיל אנטיביוטיקה, סרום חופשי, ומועברת למעבדה תרבית רקמה. רקמת השד היא dissecte נוסףד לבודד את האזורים המסוידים. חתיכות מרובות רקמת שד (organoids) ממוקמות בנפח מינימאלי של מדיום סרום ללא בבקבוק עם מכסה נשלף ותרבותי בCO 2 באינקובטור humidified. אוכלוסיות תאי אפיתל ופיברובלסטים לצאת מorganoid לאחר 10-14 ימים. באופן ספונטני Mammospheres יוצר על ומסביב monolayer תאי אפיתל. ניתן לקצור אוכלוסיות תאים ספציפיות ישירות מהבקבוק מבלי לשבש תאים שכנים. מערכת התרבות שלנו אינה אנזימטית רקמה אמינה מגלה תאי cytogenetically חריגים, חודרניים אב מנגעי DCIS אנושיים טריים.
Introduction
התפשטות של תאי האפיתל בתחומי צינוריות שד וalveoli (קרצינומה ductal באתר) מוכרת כמבשר מחייב לductal פולשני וסרטן השד לובולרי. עם זאת, המנגנונים המולקולריים ודינמיקה של אוכלוסיות תאים המאפשרים התקדמות לסרטן פולשני הם הבינו היטב. הבהרת מנגנוני ההישרדות בשימוש על ידי תאים טרום-פולשנית סרטן השד, או כל גידול טרום פולשני, עשויה לחשוף אסטרטגיות טיפוליות להריגה, או אפילו מניעה, שאתות מראש פולשנית 1. עם זאת, שיטות עלות נמוכה פשוטות לנגעים טרום-פולשנית אנושיות תפקודי לומדים כבר חסרות. למרות שתרבות monolayer במבחנה של שורות תאים הפכו שיטת מעבדה הוקמה, פנוטיפ לבין הגנוטיפ של שורות תאים הונצחו אלה נכשל לשחזר את המצב המולקולרי של תאים סרטניים אנושיים ראשוניים 2. יתר על כן, אפילו שורת התאים שאינם סרטנית MCF-10A, שrecapitulates 3-D ארכיטקטורת בלוטת החלב, לא מייצגת את הפנוטיפ הפונקציונלי ומאפיינים מולקולריים של נגע השד מראש פולשנית של המטופל 3,4 כראוי.
כדי לקבוע אם תאי גידולים כמו גזע מסוגלים פלישה היו קיימים בתוך קרצינומה ductal באתרו (DCIS) אוכלוסיית תאים, שפתחנו מתודולוגיה לאיסוף וculturing רקמת שד האנושי סטרילי בזמן הניתוח (איור 1) 5. ex vivo מערכת תרבות organoid השד שלנו אינה מסתמכת על הפרעה אנזימטית רקמה, מטריצת תמצית קרום במרתף, או דלדול פיברובלסטים, לבידוד ומתפשט תאי יוצרי mammosphere מרקמת קרצינומה ductal שד האנושי הטרי 6-8. המערכת החדשה שלנו מבוססת על העיקרון של הזרמה / נדידת תאי 5. הצינורות ניכרו השד, וסטרומה מסביב שקועים בהיקף מינימאלי של מדיום מזין סרום ללא (רק דוארnough כדי לכסות את שברי הצינור) על מנת למקסם את חילוף גזים, עם פני השטח החתך של הצינור נחשף לתרבות בינונית, אבל בשום כיוון מסוים בבקבוק (איור 1E-F). מערכת זו התרבות מאפשרת לתאים לנדוד אל מחוץ לצינור ול/ על בקבוק סטרומה ותרבות אוטולוגי. בינוני המזין, בתוספת רק עם עוריות Growth Factor (EGF), אינסולין, ואנטיביוטיקה, תומך בצמיחה של אוכלוסיות תאים מעורבות שנכללו בגין את organoid. יש בקבוק תרבות רקמת מכסה המאפשר organoids ו / או התאים להיות שנקטפו מבלי לשבש את organoids הבקבוק או השכן כל, תוך שמירה על סביבת humidified סטרילי נשלף, מחדש סגר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
רקמת שד אנושית שנאספו מחולים שהשתתפו במחקר, עם סכמה בכתב הודיעה, לאחר משרד הגנה, אוניברסיטת ג'ורג 'מייסון, והפרוטוקולים המאושרים של מערכת בריאות Inova Institutional Review Board.
1. הכנת תזונתי עשיר בינוני עם גורמי גדילה ואנטיביוטיקה
- הכן פתרונות מניות של אינסולין, גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), סולפט סטרפטומיצין סולפט גנטמיצין.
- מחדש אינסולין במים מסוננים סטרילי לריכוז סופי של 10 מ"ג / מיליליטר. לשאוב 10 מיליליטר של מים כיתה מגיב מסוג 1 במזרק חד פעמי 10 מיליליטר סטרילי. צרף מסנן 0.22 מיקרומטר polyethersulfone למזרק. לוותר מים המסוננים סטרילי לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי.
- להוסיף 10 מיליליטר של מים מסוננים סטרילי לבקבוקון 100 מ"ג של אינסולין. מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. שמור את בקבוקון האינסולין על קרח. לוותר 450 μl של מניית אינסולין solution לכותרת, צינורות סטרילית microcentrifuge ולאחסן ב -20 ° C. פתרון מניות אינסולין הוא יציב עד לתאריך התפוגה על הבקבוקון.
- הכן פתרון מניות של גורם הגדילה באפידרמיס (EGF): הוסף 500 μl מים סטריליים 500 מיקרוגרם EGF (1 מיקרוגרם / μl מלאי). מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. שמור את בקבוקון EGF על קרח.
- הכן פתרון מניות חוזר של EGF: הוסף של פתרון EGF המניה 100 μl 900 בינוני מזין μl (מלאי עבודה יהיה 0.1 מיקרוגרם / μl). מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. לוותר 50 μl של פתרון EGF עובד המניות שלכותרתו צינורות microcentrifuge סטרילי, ולאחסן ב -80 ° C.
הערה: פתרון מניות EGF (1 מיקרוגרם / μl) הוא יציב במשך השנה 1 ב -80 מעלות צלזיוס; עובד פתרון מניות (0.1 מיקרוגרם / μl) הוא יציב במשך 2 חודשים ב -80 מעלות צלזיוס.
- הכן פתרון מניות חוזר של EGF: הוסף של פתרון EGF המניה 100 μl 900 בינוני מזין μl (מלאי עבודה יהיה 0.1 מיקרוגרם / μl). מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. לוותר 50 μl של פתרון EGF עובד המניות שלכותרתו צינורות microcentrifuge סטרילי, ולאחסן ב -80 ° C.
- שוקל 40 מ"ג של סולפט סטרפטומיצין על איזון אנליטיים. הנח את int סולפט סטרפטומיציןOA 15 מיליליטר סטרילי צינור חרוטי. הוסף 4 מיליליטר של מדיום מזין. מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. הפתרון צריך להיות ורוד במקצת. חנות ב 4 ° C מוגנת מפני אור. פתרון סולפט סטרפטומיצין יציב למשך 7 ימים.
- שוקל 20 מ"ג של סולפט גנטמיצין על איזון אנליטיים. הנח את סולפט גנטמיצין לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר סטרילי. הוסף 2 מיליליטר של מדיום מזין. מערבבים את התוכן בקצרה על מיקסר מערבולת. הפתרון צריך להיות צהוב. חנות ב 4 ° C מוגנת מפני אור. פתרון סולפט גנטמיצין יציב למשך 7 ימים.
- הכן שני 200 מיליליטר קבוצות של מדיום מזין בתוספת EGF האנושי רקומביננטי (10 ng / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.), אינסולין (10 מיקרוגרם / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.), סולפט סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.) וסולפט גנטמיצין (20 מיקרוגרם / קונצרט כלשהו סופי מיליליטר.).
- הוסף בינוני 200 מיליליטר מזין בבקבוק מסנן אבק מצויד בבקבוק 0.2 מיקרומטר לסנן polyethersulfone ובקבוק שקיבל 250 מיליליטר. הוסף 20 &181 #; המניה עובדת l EGF, 200 אינסולין μl מניות, 2 מיליליטר סולפט סטרפטומיצין המניות, ו -400 סולפט גנטמיצין מניית μl ל-200 מיליליטר של מדיום מזין. צרף את בקבוק המסנן לואקום. סינון הבינוני. מחק את המסנן ואת תווית הבקבוק כמו "מדיום עשיר מזין". חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 14 ימים.
2. רקמות רכישה וגילום
- בסוויטת ההפעלה, לשמור על טכניקה סטרילית אחרי רכישת רקמת השד. הנח את רקמת השד במגש סטרילי ולכסות את המגש בניילון הנצמד סטרילי.
- להעביר את הרקמה במגש המכוסה לרדיולוגיה / פתולוגיה כנדרש במוסד שלך. אל תפתחו את המגש. פעמים תחבורה להשתנות בתוך מוסדות. רקמה יכולה להישאר קיימא במגש מכוסה זה ב RT להודעה כריתה עד 45 דקות. עם זאת, עיבוד מהיר של הרקמה לתוך מדיום עשיר מזין מספק תנאים אופטימליים לתרבות organoid שלאחר מכן.
- נתיחת רקמות ברוטו לזהות אזורים של DCIS בתוך רקמת השד: השתמש בכפפות סטריליות, להבים, אזמלים, צבעי סימון רקמה, וחומץ בנתיחת רקמה לרקמה לשמור על סטריליות.
- נקה את אזור העבודה עם אתנול 70% או אקונומיקה 1%. פתח את כפפות סטריליות ולמקם את עטיפת הכפפה על משטח העבודה. הנח את הפנים סטרילי של עטיפת כפפה עם הפנים כלפי מעלה. לשים על כפפות סטריליות.
- נקה את פני השטח של מיכל הדגימה עם 70% אתנול. הסר את עטיפת הפלסטיק מיכל דגימת הרקמה ומקום הדגימה על עטיפת הכפפה.
- טובלים צמר הטה שתי כותנה לצבע הרקמה לציון. החל הצבע אל פני השטח של הרקמה על ידי גלגול ספוגיות על פני הרקמה.
הערה: כל מחלקה הפתולוגית יש פרוטוקול נטייה צבע לצבוע / רקמה סטנדרטית. רקמה מסומנת בצבע כדי לכוון את הרקמה ביחס לעמדתה בסבלנות. או לצבוע נמחקצייר על הרקמה. אין לשפוך הצבע על הרקמות. לשפוך הצבע יכול לגרום לצבע לרוץ / לטפטף לתוך נקיקי רקמות ובכך מבלבלים את הכיוון של שוליים ניתוחיים. נטייה רקמה מספקת למנתח ופתולוג עם ציוני אנטומיים ל) מתאר את דגימת הרקמות, ו ב) לקבוע את המיקום של השוליים הניתוחיים ביחס לגידול. - יוצקים חומץ לבן מזוקק (5% חומצה אצטית) על פדה גזת סטרילי. למחוק את הרקמה צבועה עם הגזה ספוגה בחומץ. מחק את הגזה. חומץ משמש כדי לתקן רקמת סימון צבעים.
- חותך את רקמת השד לפרוסות אנכיות כ 5 מ"מ עובי. לא לחתוך את כל הדרך דרך הרקמה (איור 2). שים לב / למשש את הרקמה לאזורים של הסתיידות. לזהות נגעי DCIS על ידי משרד עורכי האופייניים שלהם, חיוור הופעה מוקפת אדמדם, גבולות גומי שמרגישים גרגירי (עקב spicules סידן).
הערה: במקרים מסוימים, comedo אזורים (כמו פצעון) יכולים להיותנתפס כנקודות לבנות, המייצגות את חומר נימקי מנגעי DCIS בקוטר גדול. - לגזור תחומי DCIS / רקמת שד מסוידת, כולל כמות קטנה של רקמה הסובבת שד. הנח את רקמת השד לתוך צינור 50 מיליליטר סטרילי המכיל 20-30 מיליליטר של מדיום עשיר מזין מוכן בשלב 1.
- מערבבים את הרקמה ובינוני על ידי בעדינות את צינור היפוך מספר פעמים. מחק את בינוני ומוסיף בינוניים טרי. מניחים את הצינור המכיל את הרקמה ובינוני למכל מבודד ולהעביר את הרקמה למעבדה תרבית רקמה.
- נקה את אזור העבודה עם אתנול 70% או אקונומיקה 1%. פתח את כפפות סטריליות ולמקם את עטיפת הכפפה על משטח העבודה. הנח את הפנים סטרילי של עטיפת כפפה עם הפנים כלפי מעלה. לשים על כפפות סטריליות.
תרבות 3. רקמות
- , עובד בארון בטיחות ביולוגי לשפוך הרקמה וכמות קטנה של המדיום מזין לתוך צלחת פטרי סטרילית. באמצעות אזמל סטרילי לחתוך ולסלק את הרקמה הסיבית. חותך את רקמת השד לחתיכות (organoids) כ 3 מ"מ 2 (איור 1 ג-ד). נסה לחתוך את הרקמה, כך שכל איברOID מכיל קטע צינור להבחין לפחות אחד עם סטרומה שמסביב.
- פתח את המכסה של הבקבוק בתרבית הרקמה. בעזרת פינצטה או מלקחיים סטריליות, למקם את organoids לתוך הבקבוק. סגור את המכסה. מחק את צלחת פטרי.
- הוסף בינוני 11 מיליליטר מזין סרום ללא עשיר (מוכן בשלב 1) לבקבוק תרבית רקמה. סגור את הבקבוק ולערבל את הבקבוק כך organoids והבינוני מפוזרים באופן שווה על פני הבקבוק (איור 1E-F).
- דגירה הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס באווירת CO humidified 5.0% 2 במשך 2 ימים. אל תזיז את הבקבוק בזמן הזה.
- יום 2 לאחר דגירה על, להסיר את הבקבוק מן החממה כדי לבדוק זיהום פטרייתי / חיידקים פוטנציאליים. הימנע פתאומי, תנועות חדות, או מתערבל של הבקבוק. הנח את הבקבוק על במה מיקרוסקופ הפוכה.
- שים לב למדיום לחיידקים, שמרים, ו / או פטרייה. אם אין זיהום יצוין, להחזיר את הבקבוק לחממה לתוספתיום itional. אם הזיהום יצוין, להשליך את הבקבוק ותכנים במכל מתאים.
- יום 3 לאחר דגירה על, להחליף את המדיום המותנה עם מדיום חדש.
- הנח 11 מיליליטר של מדיום בצינור סטרילי על 37 מעלות צלזיוס במשך 20-30 דקות. הסר את בקבוק תרבות רקמה מן החממה. מבלי להפריע את organoids, להסיר ולסלק הבינוני בבקבוק בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי.
- בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי חדשה, להוסיף 11 מיליליטר של המדיום הטרי מראש חימם. מאוד בעדינות לסובב את הבקבוק כדי להפיץ את המדיום על פני הבקבוק.
- דגירה הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס ב5.0% אווירת CO 2 humidified.
4. תחזוקה של מושבות תאי Organoid / אפיתל הוקמה
- להכין מדיום טרי כל 2 שבועות ולהחליף את התקשורת בבקבוק תרבות הרקמה 3 פעמים בשבוע.
- הנח 11 מיליליטר של מדיום במכל סטרילי ב 37° C במשך 20-30 דקות. הסר את הבקבוק מן החממה. בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי, להסיר ולסלק בינוני המותנה מהבקבוק, נזהר שלא להפריע organoids.
- בעזרת פיפטה סרולוגית סטרילי חדשה, להוסיף 11 מיליליטר של המדיום הטרי מראש חימם. מאוד בעדינות לסובב את הבקבוק כדי להפיץ את המדיום על פני הבקבוק. דגירה הבקבוק על 37 מעלות צלזיוס ב5.0% אווירת CO 2 humidified.
- לאחר 10-14 ימים בתרבות, להסיר כל חתיכות של רקמות בבקבוק התרבות שאינן חסיד.
- תאים מעת לעת קציר ו / או organoids מהבקבוק להתפשטות לתוך צלוחיות תרבות חדשות, להשתלת xenograft, או לפנוטיפי ו / או ניתוח מולקולרי.
- הסר את בקבוק תרבות רקמה מן החממה. תרסיס הבקבוק עם אתנול 70%. נגב את אתנול עודף על הבקבוק עם מגבת נייר נקייה שרוססה עם אתנול 70%.
- התפשטות Organoid: <ol>
- פתח את המכסה של הבקבוק ולשים את המכסה כלפי מעלה בארון הבטיחות הביולוגי. תחת להדמיה מיקרוסקופית, לאתר את organoid (ים) להיות שנקטפו. להשתמש בפינצטה או מלקחיים סטריליות לאיסוף organoid.
- כדי להפיץ organoid בבקבוק תרבות חדש, מקום organoid בבקבוק החדש. הוסף בינוני טרי, חם 11 מיליליטר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, באווירת 5% CO 2 humidified כמתואר בשלבים 3.3 - 3.6.3. החלף את מדיום תרבית תאים בתרבית רקמת בקבוקון שלוש פעמים בשבוע.
- קציר תאים:
- תחת vixualization המיקרוסקופי ישיר, בעדינות לגרד ותאים לשאוב וmammospheres באמצעות פיפטה 1,000 μl עם טיפים פיפטה חד פעמי סטרילי. לשאוב את התאים ובינוניים שמסביב. לוותר תאים / בינוני לתוך צינור microcentrifuge סטרילי.
- ספין התאים לזמן קצר במיני-צנטריפוגות ב XG 12,100 במשך 5 שניות. להסיר ולסלק הבינוני. <ol>
- לניתוח ה- DNA, להקפיא באופן מיידי את התא גלולה בקרח יבש, בנפח קטן של מדיום (10 μl), עם אחסון לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס.
- לניתוח proteomic, lyse התאים 10 μl של 8 מ 'אוריאה לספקטרומטר מסה או חיץ טריס-גליצין 2x SDS סופגים / microarrays חלבון המערבי הפוך שלב. לחלופין, ספין תאים בcytocentrifuge לעשות מריחות תא לניתוח immunohistochemical.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרימת עבודה עבור רכישה וculturing קרצינומה ductal שד סטרילי ברקמה באתר
עקרות רקמת שד נשמרת מחדר הניתוח למעבדה תרבית תאים באמצעות שינויים קלים בעבודת פתולוגיה בבית החולים טיפוסית (איור 1). רקמה מועברת במכל סטרילי עם מכסה פלסטיק סרט המאפשר הערכת radiologic תוך שמירה על סטריליות רקמה. עיבוד רקמות גולמי של מדגם כריתת גוש בשד או כריתת שד מבוצע עם כפפות סטריליות, להבים, וצבעים רקמה לציון. הופעה מורפולוגיים ברוטו של קרצינומה של צינוריות שד באתר דומה אזורים חיוורים, מורמים מעט עם מרקם גרגירי / חברה, מוקף ברקמה אדמדמה / צהובה גומי. אזורים של היפרפלזיה ductal וDCIS עלולים להרגיש "גרגירי" וחברה בשל הסתיידויות. אזורים אלה של רקמת שד לעתים קרובות מופיעים שזופים או צבע מעט שונה מרקמת השד שמסביב. עם זאת, ג ADHלהבחין רק לאחר איסוף רקמות וסקירה פתולוגית של סעיפי רקמות המוכתמות. רקמת שד נשארת קיימא על ידי טבילה ו / או organoids ductal הרקמה במדיום מזין סרום ללא תוספת EGF האנושי רקומביננטי (10 ng / ml), אינסולין (10 מיקרוגרם / מיליליטר), סולפט סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) וסולפט גנטמיצין (20 מיקרוגרם / מיליליטר) 5. צלוחיות תרבית תאים עם מכסים להסרה / מחדש סגר תאפשר קצירה תקופתית של תאים / organoids (איור 1E-F). מודל זה מופץ בהצלחה נגעים טרום-פולשנית שד אנושיים יותר מ 20 חולים שאובחנו עם היפרפלזיה ductal טיפוסית (n = 2) וקרצינומה ductal באתרם (n = 18).
היווצרות mammosphere ספונטנית במבחנת in vivo
Mammospheres ומבני 3-D התעוררו באופן ספונטני מברים מרובים, עצמאי אדם צינור DCIS רקמה מחולים שונים שאובחנו עם היפר ductal טיפוסיקרצינומה plasia או ductal באתרם (איור 3 ו -4) 5,9. הפרעה אנזימטית של רקמת השד לא בוצעה לפני תרבית רקמה, שהביאה לתרבות סוג תאים משולבים. לא סרום, מטריצות לחלץ קרום במרתף, ולא ג'ל כמו-נדרשו להיווצרות ספונטנית mammosphere (איור 4). Mammospheres נוצר גידולי xenograft החלב במודל של עכברי NOD / SCID עם אותו דפוס הצמיחה כמו זה של סרטן פולשני (איור 5) 5. תוצאות אלו מראות כי תאים עם פוטנציאל פולשני מראש קיימות בתוך השד האנושי DCIS צינור אבל כנראה הם נבלמו על ידי הנישה ductal ויכולים להיות שידלו לצאת בתרבות organoid. תאים אלה מהווים קטגוריה חדשה של תאי גזע כמו-שד שהיו קיימות לפני הביטוי הגלוי של 5,9,10 פנוטיפ פולשני.
אישור mammospheres אפיתל נגזר וxenografts
Mammospheres וxenografts נגזר מmammospheres אושרו על ידי immunofluorescence כבעל מקורות אפיתל. מולקולת הידבקות תאי אפיתל (EpCAM) היא גליקופרוטאין קרום הביע על תאי האפיתל 11. Immunofluorescence עם נוגדנים חד שבטי עכבר מגיבים לEpCAM האנושית (ירוק) וכתם גרעיני (DAPI, כחול) הראה תאים חיוביים EpCAM בmammospheres בתרבות (איור 6 א) ומרכז xenograft NOD / SCID (איור 6).
אימות של גבולות קרום במרתף שלם
Mammosphere יוצרים, תאי אפיתל גידולים במערכת זו התרבות נגזרו מנגעי שד טרום פולשני שהיו ריקים מפלישה או microinvasion כנים, כפי שאומת על ידי ניתוח פתולוגי עצמאי תחת תקן של אבחון היסטופתולוגיות טיפול. מבני organoid מרובים מאותו החולה שנוצרו mammosphere למושבות מינג שהוכיחו את עצמו tumorigenic. בנוסף, בדיקות היסטופתולוגיות של הרקמה המשמשת לתרבות organoid גילו נגעי intraductal ומחוברות עם גבולות מרתף שלם קרום (איור 7) 5. כך ניתן להסיק כי mammospheres הספונטני שנוצר במערכת זו התרבות נגזרת רק מאזורי גידולים טרום פולשני ואינו תוצר של אזורים הנדירים של microinvasion 5.
איור 1. זרימת עבודה לשמירה על סטריליות רקמות במהלך הדמיה רדיולוגית ונתיחת רקמות ברוטו. (א) בסוויטת ההפעלה, רקמת שד (מדגם כריתת גוש מוצג) ממוקמת במגש סטרילי ומכוסה בניילון הנצמד סטרילי. הרקמה ניתן הדמיה ישירות במגש הפלסטיק. רקמות (B) גילום לזהות תחומי DCIS. שימוש יחיד בלבד צבעי נטייה רקמה צבועים על פני השטח הרקמות באמצעות מטליות כותנה שקצהו סטרילי. חומץ לבן מזוקק משק הבית הוא שפך ישירות על גבי הרקמה ומוכתמת בגזת צמר גפן סטרילי. רקמת שד (C & D) מועברת למעבדה תרבית רקמה במדיום עשיר מזין בתוספת אנטיביוטיקה. נתיחת רקמות, לבודד האזורים של DCIS, מתבצעת באמצעות כפפות סטריליות ולהבים / אזמלים / מספריים. רקמת DCIS היא חתכה לתוך organoids מרובה לתרבות. (E & F) התרבות במבחנה של organoids שד. רקמה אנושית DCIS ממוקמת ישירות בצלוחיות תרבית רקמה עם מכסים נשלפים, ללא עיכול אנזימטי מוקדם של הרקמה. סכום מינימאלי של מדיום סרום ללא תרבות בתוספת גורם גדילה באפידרמיס ואינסולין תומך צמיחה סלולרית תוך שמירה על ממשק אוויר נוזלי סביב organoid."Target =" 6fig1highres.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור איור 2. של עיבוד רקמות ברוטו לרקמת שד DCIS. כריתת הגוש או רקמת כריתת שד הוא חתך לתוך חלקים דקים על ידי חיתוך הרקמה אנכי ללא חיתוך לאורך כל הדרך את הדגימה. שיטה לנתיחה זו המכונה לעתים קרובות "טכניקת כיכר לחם", שכן הרקמה לחתוך דומה כיכר לחם. האזור (ים) שנחשד במכיל DCIS נחתכים החוצה ופרוס ל3 - 2 פרוסות מ"מ לפתולוגיה אבחון ותרבות organoid.
3. תרבות סוג מעורב תא איורשומר על נציג באוכלוסיות תאי vivo. (א) תמונה בניגוד שלב של תרבית תאים מעורבת שנוצרה משד DCIS נגעים על פני 11 שבועות (הגדלה 4X). (B & C) במבחנה organoid טיפוח בהצלחה מופצת נגזר DCIS תאי האפיתל עם צמיחה עצמאית מעגן, מוגדר כגידול כלפי מעלה וmammospheres הרחבת , וlobulated, תצורות 3-D כמו צינור-, במדיום סרום ללא תוספת EGF, אינסולין, סטרפטומיצין וגנטמיצין (הגדלה 10X). (ד) דוגמא mammosphere נוצר לאחר 11 שבועות בתרבות (הגדלה 40X). לחץ כאן ל לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ספונטניהיווצרות של mammospheres בתרבות organoid חופשית בסרום. היווצרות mammosphere דוגמא הבאה 33 ימים של התרבות (הגדלה 10X, 20X הבלעה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5. NOD / מודל איור SCID xenograft העכבר. Xenografts נוצרו על ידי הזרקת תאי האפיתל הנגזרים ממטופל שאובחן עם DCIS (ימני של עכבר כרית החלב שומן) או ממטופל שאובחן עם DCIS החודרני (כרית שומן החלב השמאלי בעכבר). Xenografts נבע הן מDCIS הטהור וDCIS החודרני חשף דפוס צמיחה דומה ושיעור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של tדמותו.
Mammospheres 6. איור הם אישרו להיות ממוצא אפיתל. Immunofluorescence עם אנטי EpCAM מצומדת לFITC שימש כדי לאשר את מקור האפיתל של mammospheres וxenografts עכבר שנוצר מצינוריות שד המכילות DCIS. (א) בתאים חיוביים EpCAM-FITC (פסאודו- ירוק בצבע, 488 ננומטר) נראו רק בmammospheres של תרביות תאים המעורבות הנובעות מorganoids השד (DAPI (פסאודו בצבע כחול, nm 408) כתם גרעיני). (ב) בסעיפי רקמות xenograft עכבר פרפין המוטבעים פורמלין קבוע, EpCAM חיובית תאים התגלו רק במרכז חתך גידול xenograft. (הגדלה 20X) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של figu זהמחדש.
איור 7. קולגן IV אימונוהיסטוכימיה מגלה ממברנות מרתף שלמות המקיפות את הצינורות. צינורות רגיל שד () מוקפים בממברנות מרתף שלמות מועשרים בקולגן IV (diaminobenzidine = כתמים חומים). בעקבות תרבות organoid, רקמת שד מכילה גם ממברנות מרתף שלמות המאשרות כי mammospheres נגזרים מתחומי DCIS ולא מסרטן פולשני (אימונוהיסטוכימיה קולגן IV, פנל הגדלה 4X, לוח ב '10X). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת התרבות המתוארת כאן מהווה מודל חדש ליצירת תאי גידולים קדם-פולשנית המתגוררים שד למחקרים בסיסיים וtranslational. בעבר, התקדמות סרטן השד טרום ממארת יש בדרך כלל נחקרה תוך שימוש בשלוש שיטות שונות. השיטה הראשונה היא היסטופתולוגיות וניתוח גנטי של דגימות אנושיות קפוא או קבועות microdissected 12-14. השיטה השנייה משתמשת במודלים של עכברים המכילים גושי נֹאדִי (נגעי האן) hyperplastic כי הם חשבו להיות דומים לנגעי שד טרום פולשני אנושיים 15. המודל השלישי משתמש בהוקם שורות תאי סרטן השד כגון sublines MCF7 (MCF10A) שיש לי DCIS מובחן מאוד כמו המורפולוגיה 3,4. למרות ששלושת מודלים אלה סיפקו רמזים מולקולריים להתפתחות סרטן השד, אף אחת מהשיטות הללו הם מסוגלים להעריך פוטנציאל ממאיר או הפנוטיפ המולקולרי בנגע של מטופל (ים). Histopathניתוח ologic אינו מספק מידע על הפנוטיפ הפונקציונלי של התאים בנגעים טרום-פולשני. מודל העכבר של התקדמות סרטן השד עשוי שלא לשקף במדויק את histomorphology והגיוון של היפרפלזיה אנושית טיפוסית ductal, קרצינומה ובולרי באתר, וקרצינומה ductal באתר 16-18. יתר על כן, מייקרו-סביבת סטרומה והתצהיר של נגעים מבשר מטריצת חוץ-תאית המקיפים את העכבר הם שונים במידה ניכרת ממקבילתה האנושית 16. נגעים מבשר עכבריים ספונטניים יכולים להציג רמה נמוכה מאוד של התקדמות לפלישה וגרורות. השיטה השלישית, שורות תאים בתרבית, יכולה לספק מידע פנוטיפי פונקציונלי רק אם הושתלו מארחים מדוכאים חיסוניים 3,4. בנוסף מומים הגנטיים של שורת תאים ארוך passaged עשויים שלא לייצג התקדמות סרטן השד ספונטנית בבני האדם 2. לבסוף, זה מבוסס היטב כי neoplasm של כל מטופליש שילוב ייחודי של מומים גנטיים ואפיגנטיים המניע את קצב צמיחה, המצב מובחן, וההתקדמות לפלישה ו13,14,17 גרורות. נגעים טרום-פולשנית אדם הם multifocal והטרוגנית בהרכב תא וhistomorphology. יתר על כן, הפוטנציאל הממאיר הביולוגי אינו ידוע לנגע טרום-פולשנית של מטופל.
שיטת תרבית הרקמה העיקרית שלנו מתגברת על החסרונות של דגמים קודמים של סרטן השד מראש פולשנית אנושי ומספקת את היתרונות הבאים: 1) מערכת התרבות organoid תומכת צמיחה של אוכלוסיות תאי גידולים במייקרו-סביבת רקמות הילידים כי באופן ספונטני לצמוח ולייצר mammospheres שיפיק גידולים פולשניים במודלי xenograft העכבר. התאים מייצגים את גנוטיפ לבין פנוטיפ של מטופל ובכך מספקים מידע לטיפול מותאם אישית, או לסיכויי החלמה אישיות. 2) שימור מערכת תרבות organoidains אוכלוסיות ילידים סלולריות ומספק אמצעי לטיפוח תאים לא ממאירים אפיתל, תאי סטרומה ותאי מערכת חיסון במקור נמצאים ברקמת השד הראשונית, ונשא לתרבות בתוך organoid. ההיקף הנמוך של תקשורת במערכת התרבות תומך חילופי חמצן מעודדים היווצרות ספונטנית mammosphere ודביק מובחנים וalveoli כמו מבנים ללא צורך בפיגומים ממדיים מלאכותיים שלושה. 3) תרבות התא הראשונית היא ללא שינויים ובחירה שנוצרו על ידי ניתוק האנזימטית או שינוי גנטי אקסוגני. יתר על כן, בינוני המזין היא עלות נמוכה ופשוטה להכנה. 4) מולקולרי ואנליזה גנטית יכולים להתנהל על אוכלוסיות תאים ספציפיות ו / או organoids מהתרבות בנקודות שונות בזמן מבלי לשבש את התרבות כולה. 5) מערכת התרבות organoid מאפשרת אינטראקציות צמיחה, מורפולוגיה הבדיל ותאי תאים של אוכלוסיות תאי ילידים שיכוליםלהיחקר לפני ואחרי כניסתה של סוכנים טיפוליים לתקשורת והתרבות.
למרות שיש תרבית רקמה העיקרית יתרונות מסוימים, זה לא בלי מגבלות. תרבות organoid תומכת צמיחה של תרביות תאים מעורבות, ללא צמיחת יתר של כל סוג תא אחד. עם זאת, יחס המסוים של סוגי תאים לא ניתן לשלוט ובכך ייתכן שלא לשחזר את סלולארי היחסים המדויקים, מצאו in vivo. טיפוח organoid מוצלח דורש אוסף רקמות סטריליים ועיבוד, אשר שניהם לא הליכים שיגרתי במעבדות פתולוגיה בבית חולים קהילתיים רבות. תקשורת טובה בין החוקרים הקליניים, צוות כירורגית, וצוות פתולוגיה חיוניות לשמירה על סטריליות מדגם בתוך הרצף של טיפול בחולה.
מגבלה נוספת של תרבות organoid היא ההשפעה של מוצקות תשתית על הפנוטיפ סלולארי וביטוי גני 16,19. התמיינות של תאי גזע בתרבותיכול להיגרם על ידי תוספת של מדיום סרום המכיל או יכול להיות בגלל הזמן ממושך בתרבות. פנוטיפ כמו גזע נשמר אחרי כמה חודשים במערכת זו אינה אנזימטית, סרום ללא תרבות organoid 5. עם זאת, בשלב מסוים בזמן, התאים עשויים להבחין בה ניתן לראות מורפולוגית - התאים הופכים קטנים יותר, צפופים יותר, ולא מצליחים ליצור mammospheres. כדי להימנע מבעיות פוטנציאליות עם שינויים בפנוטיפ תא לאורך זמן, ניסויים מולקולריים, כגון transfections או להפיל את מבחני, יש לבצע עם תרבויות צעירות ולא עם תרבויות עתיקות (יותר מ -6 חודשים).
המפתחות לתרבות organoid מוצלחת משתמשים בנפח מתאים של מדיום בבקבוק התרבות, ומאפשרים זמן organoids לדבוק בבקבוק בתרבית הרקמה. בינוני עודף בדיפוזיה חמצן גבולות בקבוק, עיכוב היווצרות mammosphere. 3 ראשון - 7 הימים של תרבות רקמה הם קריטיים לorganoids לצרף tisלתבוע בקבוק התרבות. באופן כללי, אם organoid לא צרף ליום 14, סביר להניח שאינו מכיל כל מגזרי ductal DCIS בת-קיימא ולא יהפוך לחסיד. Organoids שאינם חסיד ביום 14 יש להסיר מתרבות. חוסר צינוריות DCIS שד קיימא ניתן לאמת התרבות הבאה על ידי תיקון organoid בפורמלין 10% ועיבוד הרקמות לגושי פרפין עבור מכתים רקמות והערכה מיקרוסקופית.
אינו אנזימטית, ממצאי מערכת תרבות סרום ללא תמיכה שלנו בהשערה כי תאים מבשר נאופלסטיות של עיוות גנטית עם פוטנציאל פולשני קיימות בתוך נגעי שד אנושי מראש פולשנית 5,9,20. ממצא זה עולה בקנה אחד עם העבודה הקודמת של אח Sgroi אל., שנערך אנליזה גנטית של נגעים טרום-פולשנית שד האנושי וDamonte et al., שחקר את התוצאה neoplasia intraepithelial החלב (מינו) מודל עכברי של התקדמות סרטן השד 12,14 , 21. ט.ו.ג. נלקחיס עם המסקנות של אחרים, מודל התרבות שלנו של נגעים טרום-פולשנית מטופל תומך ברעיון שפנוטיפ האגרסיבי של סרטן שד פולשני של מטופל יכול להיות במידה רבה נקבעו מראש בשלב שלפני פולשנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי (1) שד משרד ההגנה תכנית לחקר סרטן (צבא ארה"ב למחקר רפואי רכישת פעילות) הפרס # W81XVVH-10-1-0781 לLAL וVE, ו- (2) מענק סוזן ג 'קומן הקרן IR122224446 לאל וVE. תמיכת פתולוגיה וגילום רקמה סופקו באדיבות על ידי Inova Fairfax פתולוגיה מחלקה, ד"ר חסן נייער, ד"ר גיתה א מנזס, ודר 'צ'ארלס בכרט. הסכמת מטופל ורכש מדגם מודרך במומחיות על ידי רכזי מחקר קליני Inova Fairfax בית החולים הולי Gallimore, הת'ר Huryk, ואמיל קמר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C.
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D'amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
