Summary
Первичной культуры клеток с использованием интактных органоиды ткани обеспечивает систему модели, который имитирует многоклеточных микросреду в естественных условиях. Мы разработали модель первичной культуры груди эпителий тканей бессывороточной что увековечивает смешанные культуры клеток клоны и экспонаты дифференцированные морфологию, без нарушения ферментативной ткани. Грудь органоиды остаются жизнеспособными в течение> 6 месяцев.
Abstract
Карциномы протоков молочной железы на месте (DCIS), по определению, является распространение неопластических эпителиальных клеток в пределах от груди канала, не нарушая коллагеновый базальную мембрану. В то время как DCIS не является облигатным предшественником инвазивного рака молочной железы, молекулярные механизмы, и клеточные популяции, которые позволяют прогрессирование в инвазивный рак полностью не известны. Чтобы определить, если клетки-предшественники, способные вторжения существовал в клеточной популяции DCIS, мы разработали методику сбора и культивирования стерильной ткани молочной железы человека в момент операции, без нарушения ферментативной ткани.
Стерильный ткани молочной железы, содержащий протоков сегментов собирают из хирургическим путем ткани молочной железы после рутинной патологического исследования. Ткань, содержащая DCIS находится в богатых питательными веществами, содержащей антибиотик, свободной от сыворотки среде, и доставить в лабораторию для культивирования тканей. Ткань молочной железы является дальнейшее dissected изолировать кальцинированные участки. Несколько компонентов грудного ткани (органоидами) помещают в минимальном объеме бессывороточной среде в колбе со съемной крышкой и культивируют в увлажненной CO 2 инкубаторе. Эпителиальные и фибробластов клеточные популяции выйти из Органоид после 10 - 14 дней. Mammospheres самопроизвольно образуют на и вокруг эпителиального монослоя клеток. Конкретные клеточные популяции могут быть собраны непосредственно из колбы, не нарушая соседние клетки. Наша система неферментативное культуры ткани надежно показывает цитогенетически ненормальные, агрессивные клетки-предшественники из свежих поражений человека DCIS.
Introduction
Пролиферация эпителиальных клеток в пределах груди протоков и альвеол (раком протоков на месте), признается в качестве закономерной предшественником инвазивного протоков и очаговая рак молочной железы. Тем не менее, молекулярные механизмы и динамика популяции клеток, которые позволяют прогрессирование в инвазивный рак, плохо понимал. Выяснение механизмов выживания, используемые до инвазивных клеток карциномы молочной железы, или любой предварительно инвазивной опухоли, может выявить терапевтические стратегии для убийства, или даже предотвращения, предварительно инвазивных опухолей 1. Тем не менее, простые методы недорогие для функционально обучающихся человека предварительно инвазивных поражений не хватало. Хотя в пробирке монослой культуры трансформированных клеточных линий является признанным методом лабораторной, фенотип и генотип этих иммортализованных клеточных линий не может повторять молекулярную статус первичных человеческих опухолевых клетках 2. Кроме того, даже без онкогенными клеточной линии MCF-10A, который RecApitulates 3-D молочной архитектура железы, не позволяет адекватно представлять функциональную фенотип и молекулярные характеристики предварительно инвазивного поражения молочной отдельного пациента 3,4.
Чтобы определить, является ли стволовые, как опухолевые клетки, способные вторжения существовал в протоковой карциномы (DCIS) клеточной популяции, мы разработали методологию сбора и культивирования стерильной ткани молочной железы человека в момент операции (рисунок 1) 5. Наш бывший естественных груди система Органоид культура не зависит от перебоев ферментативной ткани, базальной мембраны экстракта матрицы, или истощения фибробластов, выделения и размножения mammosphere-клеток, образующих из свежих протоков молочной железы человека карциномы ткани 6-8. Наша новая система основана на принципе клеточной миграции потокового / 5. В различимые протоки молочной железы и окружающих стромы погружены в минимальном объеме бессывороточной питательной среды (просто еnough для покрытия фрагменты воздуховодов), чтобы максимизировать газообмен, с поверхности разреза канала воздействию культуральной среде, но ни в коем определенной ориентации в колбе (рис 1E-F). Эта система культуры позволяет клеткам мигрировать из канала и в / на аутологичных стромы и культуральной колбы. Питательная среда, дополненной только с фактор эпидермального роста (EGF), инсулин и антибиотиков, поддерживает рост популяций смешанных клеточных исходящих из Органоид. Тканевой культуральной колбы имеет съемную, многократно открывать и закрывать крышку, которая позволяет органоиды и / или клетки должны быть собраны без нарушения весь колбы или соседние органоиды, сохраняя при этом стерильную среду увлажненного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Человека ткани молочной железы была собрана из пациентов, включенных в исследовании, с письменного информированного согласия, следующие Министерство обороны, Университет Джорджа Мэйсона, и утверждены протоколы системы здравоохранения Inova Экспертный совет по.
1. Подготовьте питательная среда с факторами роста и антибиотиков
- Подготовьте исходные растворы инсулина, эпидермальный фактор роста (EGF), стрептомицина сульфата и гентамицин сульфат.
- Развести инсулина в стерильной отфильтрованной воде до конечной концентрации 10 мг / мл. Аспирируйте 10 мл Тип 1 химически чистой воды в стерильную 10 мл одноразовый шприц. Приложить 0,22 мкм фильтр из полиэфирсульфона к шприцу. Не включать стерильную фильтрованную воду в стерильный 15 мл коническую пробирку.
- Добавьте 10 мл стерильной фильтрованной воды к 100 мг флакона инсулина. Смешайте содержимое кратко на вихревом смесителе. Держите флакон инсулина на льду. Разлить 450 мкл инсулина фондовом Солуния в маркированные, стерильные микропробирок и хранить при температуре -20 ° С. Инсулин раствор стабилен до истечения срока годности на флаконе.
- Подготовка исходного раствора эпидермального фактора роста (EGF): Добавить 500 мкл стерильной воды до 500 мкг EGF (запас 1 мкг / мкл). Смешайте содержимое кратко на вихревом смесителе. Держите флакон EGF на льду.
- Подготовьте рабочую исходного раствора EGF: Добавить 100 мкл фондового EGF решения до 900 мкл питательной среды (работает фондовый будет 0,1 мкг / мкл). Смешайте содержимое кратко на вихревом смесителе. Разлить 50 мкл EGF рабочего раствора в маркированных, стерильные микропробирок и хранить при температуре -80 ° С.
Примечание: исходный раствор EGF (1 мкг / мкл) стабилен в течение 1 года при -80 ° С; работающих маточного раствора (0,1 мкг / мкл) стабилен в течение 2-х месяцев при температуре -80 ° С.
- Подготовьте рабочую исходного раствора EGF: Добавить 100 мкл фондового EGF решения до 900 мкл питательной среды (работает фондовый будет 0,1 мкг / мкл). Смешайте содержимое кратко на вихревом смесителе. Разлить 50 мкл EGF рабочего раствора в маркированных, стерильные микропробирок и хранить при температуре -80 ° С.
- Взвешивают 40 мг стрептомицина сульфата на аналитических весах. Поместите сульфат стрептомицина Intоа стерильные 15 мл коническую трубку. Добавить 4 мл питательной среды. Смешайте содержимое кратко на вихревом смесителе. Раствор должен быть слегка розовый. Хранить при 4 ° С в защищенном от света. Раствор сульфата стрептомицина стабилен в течение 7 дней.
- Взвешивают 20 мг гентамицина сульфата на аналитических весах. Поместите сульфат гентамицина в стерильный 15 мл коническую пробирку. Добавить 2 мл питательной среды. Смешайте содержимое кратко на вихревом смесителе. Раствор должен быть желтым. Хранить при 4 ° С в защищенном от света. Гентамицин раствор сульфата стабилен в течение 7 дней.
- Приготовьте два 200 мл порций питательной среде с добавлением человеческого рекомбинантного EGF (10 нг / мл конечного конц.), Инсулин (10 мкг / мл окончательного конц.), Стрептомицина сульфата (100 мкг / мл окончательного конц.) И гентамицин сульфат (20 мкг / мл конечна концентраци.).
- Добавить 200 мл питательной среды в колбу, вакуум-фильтре, снабженную фильтровальной колбы 0,2 мкм полиэфирсульфона и 250 мл принимающей бутылки. Добавить 20 &# 181; л работает фондовый EGF, 200 мкл акций инсулина, 2 мл сульфат акции стрептомицин, и 400 мкл акции гентамицин сульфат в 200 мл питательной среды. Прикрепите колбу фильтра вакууме. Фильтр среду. Выбросьте фильтр и маркировать колбы как "питательная среда". Хранить при температуре 4 ° С в течение до 14 дней.
2. Ткань Приобретение и кассовых
- В операционном блоке, поддерживать стерильность после закупки ткани молочной железы. Поместите ткань молочной железы в стерильный лоток и крышка лотка стерильной полиэтиленовой пленкой.
- Транспорт ткани в крытой лоток для радиологии / патологии, как того требует вашего учреждения. Не открывайте лоток. Транспорт раз изменяться в учреждениях. Ткань может оставаться жизнеспособным в этой крытой лотка при комнатной температуре на срок до 45 мин после удаления. Тем не менее, быстрое обработка ткани в богатых питательными веществами среде обеспечивает оптимальные условия для последующего Органоид культуры.
- Валовой рассечения тканей для выявления областей DCIS в ткани молочной железы: Используйте стерильные перчатки, лезвия, скальпели, тканевые маркировки красители и уксус во время рассечения тканей для поддержания тканей стерильность.
- Очистите рабочую зону с 70% этанола или 1% отбеливателя. Откройте стерильные перчатки и поместите перчаток обертку на рабочей поверхности. Поместите стерильный интерьер перчатки оболочки вверх. Наденьте стерильные перчатки.
- Очистите поверхность образца контейнер с 70% этанола. Снимите пластиковую обертку от ткани образца контейнер и поместите образец на упаковке перчаток.
- Опустите два хлопка тампоны в ткани маркировки красителя. Нанесите краску на поверхность ткани путем прокатки тампоны по поверхности ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый патология отдел имеет протокол стандартизированного цвет красителя / ткани ориентации. Ткань помечены красителем, чтобы ориентировать ткани по отношению к его положению в пациента. Краситель смыл илинарисованы на ткани. Не лейте краску над ткани. Заливка краситель может вызвать краситель для запуска / в капельно в тканевых щелях таким запутанным ориентацию хирургического края. Ориентация ткани обеспечивает хирургу и патологоанатом с анатомических ориентиров в) описать образец ткани, и б) определять местоположение хирургического края по отношению к опухоли. - Налейте дистиллированной белого уксуса (5% уксусной кислоты) на стерильные марлевые подушечки. Пятно окрашенные ткани с уксусом пропитанной марли. Откажитесь марлю. Уксус используется для фиксации ткани маркировку красителей.
- Разрежьте ткань молочной железы в вертикальных срезов толщиной примерно 5 мм. Ничего не вырезано все путем ткани (рис 2). Соблюдайте / ощупывать ткани для областей кальцификации. Определить DCIS поражений по их характерным фирмы, бледный вид, окруженный красноватым, эластичные границы, которые чувствуют себя песчаный (в связи с спикул кальция).
ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях, комедонов (прыщ-подобные) области может бытьвидел, как белые точки, представляющие некротический материал из большого диаметра DCIS поражений. - Вырезать из областей DCIS / кальцинированная ткани молочной железы, в том числе небольшим количеством окружающих тканей молочной железы. Поместите ткань молочной железы в стерильную пробирку 50 мл, содержащую 20-30 мл питательная среда, полученного на стадии 1.
- Смешайте ткани и среды, аккуратно переворачивая пробирку несколько раз. Откажитесь от среды и добавить свежую среду. Поместите пробирку, содержащую ткани и среды в изолированном контейнере и транспортировки ткани в лаборатории культуры тканей.
- Очистите рабочую зону с 70% этанола или 1% отбеливателя. Откройте стерильные перчатки и поместите перчаток обертку на рабочей поверхности. Поместите стерильный интерьер перчатки оболочки вверх. Наденьте стерильные перчатки.
3. Ткань Культура
- Работа в кабинете биологической безопасности, влить ткани и небольшое количество питательной среды в стерильную чашку Петри. Использование стерильным скальпелем вырезать и выбросить фиброзной ткани. Отрежьте ткани молочной железы на куски (органоидов) примерно 3 мм 2 (рис 1С-D). Попробуйте сократить ткань таким образом, чтобы каждый органподъязычная содержит по крайней мере один заметной сегмент протока с окружающими стромы.
- Откройте крышку тканевой культуральной колбы. Использование стерильных пинцета или щипцов, место органоиды в колбу. Закройте крышку. Выбросьте Петри.
- Добавить 11 мл бессывороточной питательная среда (полученного на стадии 1) в тканевой культуральной колбе. Закрывают колбу и водоворот колбу так органоиды и среднего равномерно распределены по всей колбы поверхности (рис 1E-F).
- Инкубируйте колбы при 37 ° C в увлажненной 5,0% CO 2 атмосфере в течение 2 дней. Не перемещайте колбу в течение этого времени.
- На 2 день после инкубации удалить колбу из инкубатора для проверки потенциального бактериальной / грибковой загрязнения. Избегайте резких, резкие движения, или бурлящий колбы. Поместите колбу на перевернутом столике микроскопа.
- Обратите внимание на среду для бактерий, дрожжей и / или грибка. Если нет загрязнения не отмечено, возвращают в колбу в инкубатор для дополненияitional день. Если загрязнение отмечено, выбросить колбу и ее содержимое в соответствующий контейнер.
- На 3 день после инкубации, заменить кондиционированной среды свежей средой.
- Поместите 11 мл среды в стерильную пробирку при 37 ° С в течение 20-30 мин. Извлеките тканевой культуральной колбы из инкубатора. Не нарушая органоиды, удалить и уничтожить среду в колбе с помощью стерильного серологические пипетки.
- Использование новой стерильной пипетки серологические, добавить 11 мл предварительно нагретой свежей средой. Очень осторожно вращать колбу, чтобы распределить среду по всей поверхности колбы.
- Инкубируйте колбы при 37 ° C в увлажненной 5,0% CO 2 атмосферы.
4. Поддержание Основанная Органоид / эпителиальных клеток колоний
- Приготовьте свежую среду каждые 2 недели и заменить носитель в культуральной колбе ткани 3 раза в неделю.
- Поместите 11 мл среды в стерильный контейнер в 37° C в течение 20-30 мин. Удалить колбу из инкубатора. Используя стерильный серологические пипетки, снимите и выбросьте кондиционированной среды из колбы, осторожно, чтобы не потревожить органоиды.
- Использование новой стерильной пипетки серологические, добавить 11 мл предварительно нагретой свежей средой. Очень осторожно вращать колбу, чтобы распределить среду по всей поверхности колбы. Инкубируйте колбы при 37 ° C в увлажненной 5,0% CO 2 атмосферы.
- Через 10 - 14 дней в культуре, удалить любые куски ткани в культуре колбу, которые не прилипший.
- Периодически урожай клетки и / или органоиды из колбы для распространения в новые колбы с культурой, для трансплантации ксенотрансплантатной, или для фенотипических и / или молекулярного анализа.
- Извлеките тканевой культуральной колбы из инкубатора. Спрей колбу с 70% этанола. Вытереть излишки этанола на колбе с чистым бумажным полотенцем, которое было опрыскивают 70% -ным этанолом.
- Органоид распространения: <ол>
- Откройте крышку колбы и поставить крышку лицевой стороной вверх в кабинете биологической безопасности. Под микроскопом визуализации, найдите Органоид (ы), которые будут собраны. Используйте стерильные пинцет или щипцы для пикап Органоид.
- Чтобы распространить Органоид в новой культуре колбу поместите Органоид в новую колбу. Добавить 11 мл свежий, теплый среду. Инкубируют при 37 ° С, в увлажненной 5% CO 2 атмосфере, как описано в шагах 3,3 - 3.6.3. Заменить клеточная культуральная среда в культуре ткани колбу три раза в неделю.
- Сбор клеток:
- Под прямого микроскопического vixualization, мягко очистить и аспирации клетки и mammospheres используя 1000 мкл пипетки с стерильных одноразовых наконечники пипеток. Аспирации клетки и окружающую среду. Отказаться от клеток / среду в стерильную пробирку микроцентрифуги.
- Спин клетки кратко в мини-центрифуге при 12100 мкг в течение 5 сек. Снимите и выбросьте среду. <ол>
- Для анализа ДНК, немедленно заморозить осадок клеток на сухом льду, в небольшом объеме среды (10 мкл), с длительного хранения при -80 ° С.
- Для протеомного анализа, лизиса клеток в 10 мкл 8 М мочевины для масс-спектрометрии или 2x SDS Трис-глицин буфера для Вестерн-блоттинга / назад белковых микрочипов фазы. С другой стороны, спина клетки в cytocentrifuge сделать клеточных мазков для иммуногистохимического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Workflow для закупки и культивирования стерильную карциномы протоков молочной железы на месте ткани
Ткани груди стерильность сохраняется от операционной в лабораторию для культивирования клеток через незначительные изменения в типовой больницы патологии процесса (рисунок 1). Ткань транспортируется в стерильный контейнер с пластиковой крышкой фильма, который позволяет оценить радиологический при сохранении тканей стерильность. Валовой обработка ткани груди люмпэктомии или мастэктомии образца выполняется с стерильные перчатки, лезвия, и тканевых маркировки красителей. Валовой морфологическое появление карциномы протоков молочной железы на месте напоминает бледные, слегка поднятые участки с песчаным / фирмы текстуры, окруженный красноватым / желтый резиновой ткани. Области протоковой гиперплазии и DCIS может чувствовать себя "песчаный" и фирмы из-за кальцификации. Эти области ткани молочной железы часто появляются загар или немного другого цвета, чем окружающие ткани молочной железы. Тем не менее, АДГ свыделить только после сбора ткани и патологической обзора окрашенных срезах тканей. Ткань груди остается жизнеспособным путем погружения ткани и / или протоков органоиды в бессывороточной питательной среде с добавлением человеческого рекомбинантного EGF (10 нг / мл), инсулин (10 мкг / мл), стрептомицина сульфата (100 мкг / мл) и гентамицин сульфат (20 мкг / мл) 5. Клеточные культуры колбы с съемных / повторно закрывающийся крышкой разрешить периодическую уборку клеток / органоидов (рис 1E-F). Эта модель успешно распространяется груди до инвазивных поражений человека из более чем 20 пациентов с диагнозом атипичной протоковой гиперплазии (N = 2) и раком протоков на месте (п = 18).
Спонтанное образование mammosphere в пробирке и в естественных условиях
Mammospheres и 3-D структуры возник спонтанно из нескольких, независимых человека DCIS воздуховодов фрагментов ткани из разных пациентов с диагнозом атипичной протоковой гиперплазия или раком протоков на месте (Рисунок 3 и 4) 5,9. Ферментативный разрушение ткани молочной железы не была выполнена до культуре ткани, в результате чего типа смешанного клеточной культуре. Ни в сыворотке, экстракт базальная мембрана, ни гель-подобные матрицы были необходимы для формирования спонтанного mammosphere (рисунок 4). В mammospheres генерируется молочных ксенотрансплантатов опухоли в NOD / SCID мышиной модели с одной и той же модели роста, что и инвазивного рака (рисунок 5) 5. Эти результаты показывают, что клетки-предшественники с инвазивным потенциалом предварительно существовать в человеческой груди DCIS канал, но, по-видимому сдерживается протоков нише и можно уговорить выйти в Органоид культуры. Эти клетки представляют собой новую категорию, которые существуют до явного проявления инвазивного фенотипа 5,9,10 молочной стволовых клеток, в.
Подтверждение эпителиальных получены mammospheres и xenografц
В mammospheres и ксенотрансплантаты, полученные из mammospheres были подтверждены иммунофлюоресценции как имеющие эпителиальные происхождение. Эпителиальные Молекулы клеточной адгезии (ЕрСАМ) представляет собой мембранный гликопротеин экспрессируется на эпителиальных клетках 11. Иммунофлуоресцентное с мышиных моноклональных антител реактивной человеческой ЕрСАМ (зеленый) и ядерной пятно (DAPI, синий) показал ЕрСАМ положительных клеток в mammospheres в культуре (рис 6а) и центр кивком / SCID ксенотрансплантате (рис 6В).
Проверка границ нетронутыми базальной мембраны
Mammosphere формование, опухолевые клетки эпителия в этой системе культуры были получены из предварительно инвазивных поражений молочной железы, которые были лишены откровенной вторжения или microinvasion, как проверяется независимой патологического анализа под стандарт диагностики уход гистопатологического. Несколько Органоид структуры из того же пациента генерируется mammosphere дляМин колонии, которые оказались онкогенными. Кроме того, гистологическое исследование тканей, используемых для Органоид культуры показали сливной внутрипротокового поражений с границами мембранных нетронутыми подвальных (рис 7б) 5. Таким образом, можно сделать вывод, что спонтанные mammospheres, образованные в этой системе культуры получены только из предварительно инвазивных опухолевых областей и не являются продуктом редких областях microinvasion 5.
Рисунок 1. Последовательность действий для поддержания тканей стерильности во время радиологических изображений, а валовой рассечения тканей. (А) В операционном блоке, ткани молочной железы (лампектомии образца показана) помещают в стерильный лоток и покрыта стерильной пластиковой пленкой. Ткань может быть отображены непосредственно в пластиковый лоток. (Б) Ткань кассовым для идентификации области DCIS. Одноразовые только ориентация ткани красители нарисованы на поверхности ткани, используя стерильные ватные тампоны. Бытовые дистиллированной белого уксуса выливают непосредственно на ткани и наносят стерильной хлопковой марли. (C & D) тканей молочной железы транспортируется в лабораторию для культуры ткани в питательной богатой среде, дополненной антибиотиками. Рассечения тканей, изолировать районы DCIS, выполняется с использованием стерильных перчаток и лезвия / скальпели / ножницы. DCIS ткань режется на несколько органоидов для культуры. (E & F) В пробирке культура молочной органоидов. DCIS человеческого ткани помещают непосредственно в тканевых культуральных колбах со съемными крышками, без предварительного ферментативного расщепления ткани. Минимальное количество бессывороточной культуральной среде с добавлением фактора роста эпидермиса и инсулина поддерживает клеточный рост при сохранении воздух-жидкость вокруг Органоид.6fig1highres.jpg "цель =" _ пустой "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Иллюстрация валового обработки ткани молочной DCIS ткани. Лампектомии или мастэктомия ткань нарезать тонкими секций, нарезая ткань вертикально, не разрезая до конца через образец. Этот метод рассечения часто называют «техникой буханка хлеба", так как разрез тканей напоминает буханку хлеба. Площадь (ы), предположительно содержащих DCIS вырезаются и нарезанный на 2 - 3 дольки мм для диагностики патологии и Органоид культуры.
Рисунок 3. Вид смешанной культуре клетокутверждает представитель в популяциях естественных клеток. () Фазового контраста изображения культуры смешанной клеточной генерируемого от груди DCIS поражений за 11 недель (4X увеличение). (В & С) В пробирке Органоид выращивание успешно размножают DCIS полученных эпителиальные клетки с якорной независимого роста, определяемых как вверх растет и расширяется mammospheres и lobulated, воздуховодов, как 3-D образований, в свободной от сыворотки среде с добавлением EGF, инсулина, стрептомицин и гентамицин (10x). (D) Пример mammosphere формируется после 11 недель культивирования (40-кратном увеличении). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этого рисунка.
Рисунок 4. Спонтанноеформирование mammospheres в свободной от сыворотки Органоид культуры. Пример mammosphere формирование следующих 33 дней культуры (10-кратным увеличением, 20X вставка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. NOD / SCID модель мыши ксенотрансплантат. Ксенотрансплантаты были получены путем введения эпителиальные клетки, полученные от пациента с диагнозом DCIS (мыши правой молочной жировой ткани) или от пациента с диагнозом инвазивного DCIS (мышь влево молочной жировой ткани). Ксенотрансплантаты, полученные из обоих чистого DCIS и инвазивной DCIS показал аналогичные показатели роста и скорость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию тего фигура.
Рисунок 6. Mammospheres подтверждены быть эпителиального происхождения. Иммунофлуоресценции с анти-ЕрСАМ, конъюгированного с FITC был использован для подтверждения эпителиального происхождения из mammospheres и ксенотрансплантатов мыши, генерируемых из молочной каналов, содержащих DCIS. (A) EpCAM-FITC-позитивных клеток (псевдо- цвета зеленый, 488 нм) можно увидеть только в mammospheres этих культур смешанных клеточных исходящих из груди органоидов (DAPI (псевдо-синего цвета, 408 нм), окрашивающий ядра). (B) В фиксированных формалином парафиновых срезах мыши ксенотрансплантат тканей, EpCAM положительным клетки был обнаружен лишь в центре участка опухоли ксенотрансплантат. (20X увеличение) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой FIGUповторно.
Рисунок 7. Коллаген IV иммуногистохимии показывает нетронутыми базальные мембраны, окружающие протоки. Нормальные каналы грудь (A) окружены нетронутыми базальных мембран, обогащенных коллагена IV (диаминобензидин = коричневый окрашивание). После Органоид культуры, ткани молочной железы также содержит неповрежденные базальные мембраны, подтверждающие, что mammospheres выводятся из районов DCIS и не от инвазивного рака (коллаген IV иммуногистохимии, панели 4X увеличение, панель B 10X). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этот показатель.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Система культура описано здесь является новая модель генерации живущих предварительно инвазивных опухолевых клеток молочной железы для основных и трансляционных исследований. В прошлом, до прогрессирования злокачественной рак молочной железы, как правило, были изучены с использованием трех различных методов. Первый метод является гистологическое и генетический анализ микродиссекции замороженных или фиксированных образцов у людей 12-14. Второй метод использует мышиные модели, которые содержат гиперпластических альвеолярных узелки (HAN поражений), что, как считается, похож на человека до инвазивных поражений молочной железы 15. Третья модель использует создана клеточных линий карциномы молочной железы, такие как MCF7 сублиний (MCF10A), которые имеют весьма дифференцированные DCIS как морфологии 3,4. Хотя эти три модели обеспечили молекулярные ключи к прогрессии рака молочной железы, ни один из этих методов не способны оценить злокачественный потенциал или молекулярный фенотип поражения (ов) отдельного пациента. Histopathologic анализ не дает информации о функциональном фенотипа клеток в предварительно инвазивных поражений. Модель мыши прогрессирования рака молочной железы не может точно отражать histomorphology и разнообразие человеческой атипичной протоковой гиперплазии, очаговая рак на месте, и раком протоков на месте 16-18. Кроме того, стромальных микросреда и отложение внеклеточного матрикса окружающих предраковых мыши заметно отличаются от человеческого коллегой 16. Спонтанные мышиные предраковых может демонстрировать очень низкий уровень прогрессии к инвазии и метастазирования. Третий способ, культивируемые клеточные линии, может обеспечить только функциональную фенотипическую информацию, если пересаживают в подавленной иммунной системой хостов 3,4. Кроме того, генетические аномалии долгое пассированного клеточной линии не может представлять спонтанная прогрессирование рака молочной железы у человека 2. И, наконец, хорошо известно, что новообразования каждого пациентаимеет уникальное сочетание генетических и эпигенетических нарушений, которые приводят в норму роста, дифференцированное состояние и развитие в инвазии и метастазирования 13,14,17. Человеческие предварительно инвазивные поражения мультифокальна и неоднородны по составу клеток и histomorphology. Кроме того, биологическая злокачественным потенциалом неизвестно для предварительного инвазивного поражения отдельного пациента.
Наш основной метод тканевой культуры преодолевает недостатки предыдущих моделей человеческого предварительно инвазивного рака молочной железы и обеспечивает следующие преимущества: 1) Органоид система культура поддерживает рост опухолевых клеточных популяций в пределах ткани микросреды родной, что спонтанно расти и генерировать mammospheres, которые будут производить инвазивные опухоли в моделях мыши ксенотрансплантатных. Клетки представляют собой генотип и фенотип отдельного пациента и тем самым предоставлять информацию для персонализированной терапии или индивидуального прогноза. 2) Органоид система культуры скАйна родные сотовые субпопуляции и предоставляет средства для культивировать доброкачественных эпителиальных клеток, стромальных клеток и иммунные клетки изначально присутствующие в первичном ткани молочной железы, а также осуществляется в культуре в Органоид. Низкий объем информации в системе культуры поддерживает кислородный обмен обнадеживающий спонтанное образование mammosphere и дифференцированный канал и альвеол, как структуры без необходимости для искусственного трехмерной лесов. 3) первичной культуры клеток свободен от модификации и выбора генерируемых ферментативной диссоциации или экзогенной генетической модификации. Кроме того, питательная среда является недорогой и простой в приготовлении. 4) Молекулярная и генетический анализ может проводиться на конкретных клеточных популяций и / или органоидов от культуры в различных точках времени, не нарушая всю культуру. 5) Органоид система культуры разрешает рост, дифференцированы морфологии и межклеточные взаимодействия популяций родных клеток, которые могутбыть изучены до и после введения терапевтических агентов в культуральную среду.
Хотя первичной культуры ткани имеет определенные преимущества, это не без ограничений. Органоид культура поддерживает рост культур смешанных клеточных, без зарослей любого типа один клеток. Тем не менее, специфическое соотношение типов клеток не может управляться и, таким образом, не может повторять точные клеточные соотношения, найденные в естественных условиях. Успешное Органоид выращивание требует стерильной сбор и обработку тканей, оба из которых являются не обычные процедуры во многих патологических сообщество больничных лабораториях. Хорошая связь между клиническими исследователями, хирургическое персонал, и патология персонал необходимы для поддержания образец стерильности в континууме ухода за пациентами.
Дополнительным ограничением Органоид культуры является влияние субстрата твердости на клеточном фенотипа и экспрессии генов 16,19. Дифференцировки стволовых клеток в культуреможет быть вызвано добавлением среде, содержащей сыворотку, или может быть из-за длительного времени в культуре. Фенотип стволовых как поддерживалась через несколько месяцев в этом неферментативной, сыворотки системы Органоид культуры 5. Тем не менее, в какой-то момент времени, клетки могут дифференцироваться который можно увидеть морфологически - клетки становятся меньше, плотнее, и не образуют mammospheres. Чтобы избежать потенциальных проблем с изменением фенотипа клеток с течением времени, молекулярных экспериментов, таких как трансфекций или сбить анализов, должны быть выполнены с молодыми культурами, а не со старыми культур (более 6 месяцев).
Ключи к успешному Органоид культуры используете соответствующий объем среды в колбе для культивирования, и позволяет время органоиды придерживаться тканевой культуральной колбы. Превышение среднего диффузии пределы колбы кислорода, препятствуя образованию mammosphere. Первые 3 - 7 дней культуры ткани имеют решающее значение для органоиды приложить к ТИСподать в суд на культуральной колбы. В общем, если Органоид не прилагается на 14 день, это, скорее всего, не содержит каких-либо жизнеспособных DCIS протоков сегментов и не станет приверженцем. Органоидами, которые не прилипшие к 14 дню должны быть удалены из культуры. Отсутствие жизнеспособным молочной DCIS каналов может быть проверена следующую культуру путем фиксации Органоид в 10% формалине и обработки ткани, в парафиновые блоки для окрашивания тканей и микроскопическом исследовании.
Наша неферментативное, выводы системные культура бессывороточных подтверждают гипотезу, что существует генетически аномальные опухолевые клетки-предшественники с инвазивным потенциалом в предварительно инвазивных поражений молочной железы человека 5,9,20. Этот вывод согласуется с предыдущей работы Сгрой и др., Которые, проведенного генетического анализа молочной железы человека предварительно инвазивных поражений и Damonte соавт., Изучавшего молочной ЦИН вырост (Мино) мышиной модели прогрессии рака молочной железы 12,14 , 21. Взятые TogeTher с выводами других, наша культура модель конкретного пациента предварительно инвазивных поражений поддерживает концепцию, что агрессивный фенотип инвазивного рака молочной железы пациента может быть в значительной степени предопределены на предварительно инвазивной стадии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана (1) Министерство обороны груди Программа исследований рака (US Army Medical Research Приобретение активность) награда # W81XVVH-10-1-0781 в LAL и VE, и (2) грант Сьюзен Г. Комен IR122224446 к Лал и VE. Поддержка патологии и ткани кассовым был любезно предоставлен Inova Fairfax патологоанатомического отделения, доктор Хасан Nayer, доктор Гита А. Менезес, и д-р Чарльз Bechert. Согласие пациента и образца по закупкам со знанием руководствуется Inova Fairfax Hospital клиническое исследование координаторов Холли Галлимор, Хизер Huryk, и Эмиль Камар.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C.
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D'amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
