Summary
बरकरार ऊतक organoids का उपयोग प्राथमिक सेल संस्कृति बहु सेलुलर में विवो microenvironment mimics कि एक मॉडल प्रणाली प्रदान करता है. हम एंजाइमी ऊतक व्यवधान के बिना, आकृति विज्ञान भेदभाव मिश्रित सेल संस्कृति प्रजातियों और प्रदर्शन perpetuates कि एक सीरम मुक्त प्राथमिक स्तन उपकला ऊतक संस्कृति मॉडल विकसित किया है. स्तन organoids> 6 महीने के लिए व्यवहार्य रहते हैं.
Abstract
सीटू (DCIS) में स्तन ductal कार्सिनोमा, परिभाषा से, मज्जा तहखाने झिल्ली को तोड़ने के बिना, स्तन वाहिनी के अंदर नियोप्लास्टिक उपकला कोशिकाओं का प्रसार है. DCIS के इनवेसिव स्तन कैंसर के लिए एक गैर-लाचार अग्रदूत है, आक्रामक कैंसर के लिए प्रगति की अनुमति है कि आणविक तंत्र और सेल आबादी पूरी तरह से नहीं जाना जाता है. आक्रमण में सक्षम पूर्वज कोशिकाओं DCIS के सेल आबादी के भीतर ही अस्तित्व में निर्धारित करने के लिए, हम ऊतक के enzymatic व्यवधान के बिना, सर्जरी के समय बाँझ मानव स्तन के ऊतकों का संग्रह और संवर्धन के लिए एक पद्धति विकसित की.
नलीपरक क्षेत्रों युक्त बाँझ स्तन के ऊतकों दिनचर्या रोग परीक्षा निम्नलिखित शल्य चिकित्सा excised स्तन के ऊतकों से काटा जाता है. DCIS युक्त ऊतक टिशू कल्चर प्रयोगशाला के लिए पोषक तत्व अमीर, एंटीबायोटिक युक्त, सीरम मुक्त माध्यम में रखा, और ले जाया जाता है. स्तन ऊतक आगे dissecte हैडी calcified क्षेत्रों को अलग करने के लिए. एकाधिक स्तन ऊतक टुकड़े (organoids) एक humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में एक हटाने योग्य ढक्कन और सुसंस्कृत साथ एक फ्लास्क में सीरम मुक्त माध्यम का एक न्यूनतम मात्रा में रखा जाता है. 14 दिन - उपकला और fibroblast सेल आबादी 10 के बाद organoid से उभरेगा. अनायास पर फार्म और उपकला सेल monolayer आसपास Mammospheres. विशेष सेल आबादी पड़ोसी कोशिकाओं में बाधा पहुँचा के बिना कुप्पी से सीधे काटा जा सकता है. हमारे गैर एंजाइमी टिशू कल्चर प्रणाली मज़बूती से ताजा मानव DCIS के घावों से cytogenetically असामान्य, आक्रामक पूर्वज कोशिकाओं का पता चलता है.
Introduction
स्तन नलिकाओं और अल्विओली (बगल में ductal कार्सिनोमा) के अंदर उपकला कोशिकाओं के प्रसार को आक्रामक वाहिनीपरक और lobular स्तन कार्सिनोमा के लिए एक लाचार अग्रदूत के रूप में मान्यता प्राप्त है. फिर भी, आक्रामक कैंसर के लिए प्रगति की अनुमति है कि आणविक तंत्र और सेल जनसंख्या गतिशीलता खराब समझ रहे हैं. पूर्व इनवेसिव स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं, या किसी भी पूर्व इनवेसिव ट्यूमर द्वारा इस्तेमाल किया अस्तित्व तंत्र, elucidating हत्या, या यहां तक कि, पूर्व आक्रामक अर्बुद 1 को रोकने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों प्रकट हो सकता है. हालांकि, कार्यात्मक अध्ययन कर मानव पूर्व आक्रामक घावों के लिए सरल कम लागत वाली विधियों की कमी की गई है. तब्दील सेल लाइनों के इन विट्रो monolayer संस्कृति की स्थापना की एक प्रयोगशाला विधि, इन अमर सेल लाइनों के phenotype और जीनोटाइप है हालांकि प्राथमिक मानव ट्यूमर कोशिकाओं 2 की आणविक स्थिति पुनरावृत्ति करने में विफल रहता है. इसके अलावा, यहां तक कि गैर-tumorigenic एमसीएफ-10A सेल लाइन, जो RECApitulates 3-डी स्तन ग्रंथि वास्तुकला, पर्याप्त रूप से कार्यात्मक फेनोटाइप और एक व्यक्ति मरीज की पूर्व-इनवेसिव स्तन घाव 3,4 की आणविक विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करने में विफल रहता है.
आक्रमण में सक्षम स्टेम तरह नियोप्लास्टिक कोशिकाओं सीटू (DCIS) सेल आबादी में ductal कार्सिनोमा भीतर अस्तित्व में निर्धारित करने के लिए, हम (चित्रा 1) 5 संग्रह है और सर्जरी के समय बाँझ मानव स्तन ऊतक संवर्धन के लिए एक पद्धति विकसित की. हमारे पूर्व vivo स्तन organoid संस्कृति प्रणाली अलग और ताजा मानव स्तन ductal कार्सिनोमा ऊतक 6-8 से mammosphere के गठन की कोशिकाओं के प्रचार के लिए, एंजाइमी ऊतक विघटन, तहखाने झिल्ली निकालने मैट्रिक्स, या तंतुप्रसू कमी पर भरोसा नहीं करता. हमारी नई प्रणाली सेल स्ट्रीमिंग / माइग्रेशन 5 के सिद्धांत पर आधारित है. प्रत्यक्ष स्तन नलिकाओं, और आसपास के स्ट्रोमा सीरम मुक्त पोषक मध्यम (सिर्फ ई की एक न्यूनतम मात्रा में डूबे हुए हैंसंस्कृति के माध्यम से अवगत कराया वाहिनी की कटौती की सतह के साथ, गैस विनिमय अधिकतम, लेकिन कुप्पी (चित्रा 1E-एफ) में कोई विशिष्ट अभिविन्यास में करने के लिए) वाहिनी टुकड़े को कवर करने के nough. इस संस्कृति प्रणाली की कोशिकाओं ऑटोलॉगस स्ट्रोमा और संस्कृति फ्लास्क पर वाहिनी के बाहर और / में विस्थापित करने की अनुमति देता है. केवल epidermal वृद्धि कारक (EGF), इंसुलिन, और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक पोषक मध्यम, organoid से निकलती मिश्रित सेल आबादी की वृद्धि का समर्थन करता है. टिशू कल्चर कुप्पी एक बाँझ humidified वातावरण बनाए रखते हुए, organoids और / या कोशिकाओं पूरे कुप्पी या पड़ोसी organoids बाधा पहुँचा के बिना काटा जा करने की अनुमति देता है कि एक हटाने योग्य, पुनः sealable ढक्कन है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
मानव स्तन के ऊतकों रक्षा विभाग, जॉर्ज मेसन विश्वविद्यालय, और Inova स्वास्थ्य प्रणाली संस्थागत समीक्षा बोर्ड की अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन, लिखित सूचित सहमति के साथ, एक शोध अध्ययन में दाखिला रोगियों से एकत्र किया गया था.
1. वृद्धि कारक है और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पोषक तत्व अमीर मध्यम तैयार
- इंसुलिन का जायजा समाधान, epidermal वृद्धि कारक (EGF), स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट और जेंटामाइसिन सल्फेट तैयार करें.
- 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ फ़िल्टर्ड पानी में इंसुलिन पुनर्गठित. एक बाँझ 10 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज में टाइप 1 अभिकर्मक ग्रेड पानी के महाप्राण 10 मिलीलीटर. सिरिंज को 0.22 माइक्रोन polyethersulfone फिल्टर देते हैं. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में बाँझ फ़िल्टर्ड पानी बांटना.
- इंसुलिन की एक 100 मिलीग्राम शीशी को बाँझ फ़िल्टर्ड पानी की 10 मिलीलीटर जोड़ें. एक भंवर मिक्सर पर संक्षिप्त सामग्री मिलाएं. बर्फ पर इंसुलिन शीशी रखें. इंसुलिन शेयर समाधान के 450 μl बग़ैर-20 डिग्री सेल्सियस पर लेबल, बाँझ microcentrifuge ट्यूबों और दुकान में tion के. इंसुलिन शेयर समाधान शीशी पर समाप्ति तिथि तक स्थिर है.
- Epidermal वृद्धि कारक (EGF) के शेयर समाधान तैयार: 500 माइक्रोग्राम प्रति EGF (शेयर 1 माइक्रोग्राम प्रति / μl) के लिए 500 μl बाँझ पानी जोड़ें. एक भंवर मिक्सर पर संक्षिप्त सामग्री मिलाएं. बर्फ पर EGF शीशी रखें.
- EGF का कार्यसाधक स्टॉक समाधान तैयार: 900 μl पोषक मध्यम (कार्य स्टॉक / μl 0.1 माइक्रोग्राम प्रति हो जाएगा) के लिए शेयर EGF समाधान के 100 μl जोड़ें. एक भंवर मिक्सर पर संक्षिप्त सामग्री मिलाएं. -80 डिग्री सेल्सियस पर EGF काम कर स्टॉक लेबल, बाँझ microcentrifuge ट्यूबों में हल और दुकान के 50 μl बग़ैर.
नोट: EGF शेयर समाधान (1 माइक्रोग्राम प्रति / μl) -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 साल के लिए स्थिर है; शेयर समाधान (0.1 माइक्रोग्राम प्रति / μl) काम -80 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने के लिए स्थिर है.
- EGF का कार्यसाधक स्टॉक समाधान तैयार: 900 μl पोषक मध्यम (कार्य स्टॉक / μl 0.1 माइक्रोग्राम प्रति हो जाएगा) के लिए शेयर EGF समाधान के 100 μl जोड़ें. एक भंवर मिक्सर पर संक्षिप्त सामग्री मिलाएं. -80 डिग्री सेल्सियस पर EGF काम कर स्टॉक लेबल, बाँझ microcentrifuge ट्यूबों में हल और दुकान के 50 μl बग़ैर.
- एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट के 40 मिलीग्राम वजन. स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट पूर्णांक रखेंOA बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब. पोषक माध्यम की 4 मिलीलीटर जोड़ें. एक भंवर मिक्सर पर संक्षिप्त सामग्री मिलाएं. समाधान थोड़ा गुलाबी होना चाहिए. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्रकाश से रक्षा की. स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट समाधान 7 दिनों के लिए स्थिर है.
- एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर जेंटामाइसिन सल्फेट के 20 मिलीग्राम वजन. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जेंटामाइसिन सल्फेट रखें. पोषक माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ें. एक भंवर मिक्सर पर संक्षिप्त सामग्री मिलाएं. समाधान पीला होना चाहिए. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्रकाश से रक्षा की. जेंटामाइसिन सल्फेट समाधान 7 दिनों के लिए स्थिर है.
- (20 (. 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / अंतिम सान्द्र), (. 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / अंतिम सान्द्र), (. 10 एनजी / एमएल अंतिम सान्द्र) स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट इंसुलिन मानव पुनः संयोजक EGF के साथ पूरक पोषक माध्यम की दो 200 मिलीलीटर बैच तैयार और जेंटामाइसिन सल्फेट माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / अंतिम सान्द्र.).
- 0.2 माइक्रोन polyethersulfone फिल्टर कुप्पी से लैस एक वैक्यूम फिल्टर कुप्पी और एक 250 मिलीलीटर प्राप्त बोतल 200 मिलीलीटर पोषक मध्यम जोड़ें. जोड़ें 20 &# 181; एल काम कर शेयर EGF, 200 μl शेयर इंसुलिन, 2 मिलीलीटर शेयर स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट, और पोषक माध्यम की 200 मिलीलीटर के लिए 400 μl शेयर जेंटामाइसिन सल्फेट. एक निर्वात को फिल्टर कुप्पी देते हैं. मध्यम फ़िल्टर. फिल्टर त्यागें और "पोषक तत्व अमीर मध्यम" के रूप में कुप्पी लेबल. अप करने के लिए 14 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
2. ऊतक अधिग्रहण और कमाई करने वाली
- ऑपरेटिंग सूट में, स्तन के ऊतकों की खरीद के बाद बाँझ तकनीक बनाए रखें. एक बाँझ ट्रे में स्तन ऊतक प्लेस और बाँझ प्लास्टिक की चादर के साथ ट्रे कवर.
- आपकी संस्था द्वारा आवश्यक रूप रेडियोलॉजी / पैथोलॉजी को कवर ट्रे में ऊतक परिवहन. ट्रे न खोलें. परिवहन टाइम्स संस्थानों के भीतर अलग-अलग हो. ऊतक को 45 मिनट पद छांटना लिए आरटी पर यह कवर ट्रे में व्यवहार्य रह सकते हैं. हालांकि, पोषक तत्व अमीर मध्यम में ऊतक के शीघ्र प्रसंस्करण बाद organoid संस्कृति के लिए इष्टतम स्थितियों प्रदान करता है.
- सकल ऊतक विच्छेदन स्तन के ऊतकों के भीतर DCIS के क्षेत्रों की पहचान करने के लिए: ऊतक बाँझपन बनाए रखने के लिए ऊतक विच्छेदन के दौरान बाँझ दस्ताने, ब्लेड, नलियां, ऊतक अंकन रंजक, और सिरका उपयोग करें.
- 70% इथेनॉल या 1% ब्लीच के साथ कार्य क्षेत्र को साफ करें. बाँझ दस्ताने खोलें और काम की सतह पर दस्ताने आवरण जगह है. दस्ताने आवरण चेहरे की बाँझ इंटीरियर रखें. बाँझ दस्ताने पर रखो.
- 70% इथेनॉल के साथ नमूना कंटेनर की सतह को साफ. ऊतक नमूना कंटेनर से प्लास्टिक की चादर निकालें और दस्ताने आवरण पर नमूना जगह है.
- ऊतक अंकन डाई में दो कपास इत्तला दे दी swabs के डुबकी. ऊतक सतह भर swabs के रोलिंग द्वारा ऊतक की सतह को डाई लागू करें.
नोट: प्रत्येक पैथोलॉजी विभाग एक मानकीकृत डाई रंग / ऊतक अभिविन्यास प्रोटोकॉल है. ऊतक रोगी में अपनी स्थिति के संबंध में ऊतक पूरबी डाई के साथ लेबल है. डाई मिट जाता है याऊतक पर चित्रित. ऊतक से अधिक डाई डालना मत करो. डाई डालने का कार्य डाई इस प्रकार शल्य हाशिए के उन्मुखीकरण भ्रमित ऊतक दरारों में / चलाने ड्रिप करने के लिए प्रेरित कर सकते हैं. ऊतक अभिविन्यास सर्जन और एक के लिए संरचनात्मक स्थलों के साथ रोगविज्ञानी) ऊतक नमूना वर्णन, और ख) ट्यूमर के संबंध में शल्य हाशिए का स्थान निर्धारित प्रदान करता है. - बाँझ धुंध पैड पर आसुत सफेद सिरका (5% एसिटिक एसिड) डालो. सिरका भिगो धुंध के साथ रंगे ऊतक दाग. धुंध त्यागें. सिरका रंगों अंकन ऊतक को ठीक करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- लगभग 5 मिमी मोटी खड़ी स्लाइस में स्तन ऊतक में कटौती. ऊतक (चित्रा 2) के माध्यम से पूरी तरह कट मत करो. / निरीक्षण कड़ा हो जाना के क्षेत्रों के लिए ऊतक टटोलना. उनकी विशेषता फर्म द्वारा DCIS के घावों को पहचानें, लाल से घिरा उपस्थिति पीला, (कारण कैल्शियम spicules के लिए) किरकिरा लग रहा है कि रबड़ जैसी सीमाओं.
नोट: कुछ मामलों में, मुहांसा (दाना-तरह) क्षेत्रों में हो सकता हैबड़े व्यास DCIS के घावों से परिगलित सामग्री का प्रतिनिधित्व सफेद डॉट्स के रूप में देखा. - स्तन ऊतक आसपास की एक छोटी राशि सहित, DCIS / केल्सीकृत स्तन के ऊतकों के क्षेत्रों काट दिया. चरण 1 में तैयार पोषक तत्व अमीर मध्यम के 20-30 मिलीलीटर युक्त एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्तन ऊतक रखें.
- धीरे ट्यूब कई बार inverting से ऊतक और मध्यम मिलाएं. मध्यम त्यागें और ताजा मध्यम जोड़ें. एक अछूता कंटेनर में ऊतक और मध्यम युक्त ट्यूब प्लेस और टिशू कल्चर प्रयोगशाला में ऊतक परिवहन.
- 70% इथेनॉल या 1% ब्लीच के साथ कार्य क्षेत्र को साफ करें. बाँझ दस्ताने खोलें और काम की सतह पर दस्ताने आवरण जगह है. दस्ताने आवरण चेहरे की बाँझ इंटीरियर रखें. बाँझ दस्ताने पर रखो.
3. टिशू कल्चर
- एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में कार्य करना, ऊतक और एक बाँझ पेट्री डिश में पोषक माध्यम की एक छोटी राशि डाल देना. एक बाँझ स्केलपेल दूर कटौती और रेशेदार ऊतक त्यागने का उपयोग करना. टुकड़े (organoids) में स्तन ऊतक लगभग 3 मिमी 2 (चित्रा 1C-डी) काटें. ऊतक में कटौती करने की कोशिश करें तो यह है कि प्रत्येक अंगOID आसपास के स्ट्रोमा के साथ कम से कम एक discernable वाहिनी खंड शामिल हैं.
- टिशू कल्चर कुप्पी के ढक्कन खोलें. बाँझ चिमटी या संदंश का प्रयोग, फ्लास्क में organoids जगह है. ढक्कन बंद करें. पेट्री डिश त्यागें.
- टिशू कल्चर कुप्पी को 11 मिलीलीटर सीरम मुक्त पोषक तत्व अमीर मध्यम (चरण 1 में तैयार) जोड़ें. कुप्पी बंद करें और organoids और मध्यम समान रूप से फ्लास्क सतह (चित्रा 1E-एफ) भर में वितरित कर रहे हैं तो कुप्पी ज़ुल्फ़.
- 2 दिनों के लिए एक humidified 5.0% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं. इस समय के दौरान कुप्पी कदम नहीं है.
- दिन 2 पद ऊष्मायन पर, संभावित बैक्टीरियल / फंगल संक्रमण के लिए जाँच करने के लिए इनक्यूबेटर से फ्लास्क को हटा दें. कुप्पी की अचानक, तीव्र आंदोलनों, या घूमता से बचें. एक औंधा माइक्रोस्कोप मंच पर कुप्पी रखें.
- बैक्टीरिया, खमीर, और / या कवक के लिए मध्यम निरीक्षण करें. कोई संदूषण का उल्लेख किया जाता है, तो एक ऐड के लिए इनक्यूबेटर कुप्पी लौटनेitional दिन. संदूषण का उल्लेख किया जाता है, तो एक उपयुक्त कंटेनर में कुप्पी और सामग्री को त्यागें.
- दिन 3 पद ऊष्मायन पर ताजा माध्यम के साथ वातानुकूलित मध्यम जगह.
- 20-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ ट्यूब में मध्यम की 11 मिलीलीटर रखें. इनक्यूबेटर से टिशू कल्चर कुप्पी निकालें. Organoids परेशान बिना, हटाने और एक बाँझ serologic पिपेट का उपयोग फ्लास्क में मध्यम त्यागें.
- एक नए बाँझ serologic विंदुक का प्रयोग, पूर्व गर्म ताजा माध्यम से 11 मिलीलीटर जोड़ें. बहुत धीरे कुप्पी सतह भर में मध्यम वितरित करने कुप्पी बारी बारी से.
- एक humidified 5.0% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं.
स्थापित Organoid / उपकला सेल कालोनियों की 4. रखरखाव
- हर 2 सप्ताह ताजा मध्यम तैयार है और टिशू कल्चर फ्लास्क में प्रति सप्ताह 3 बार मीडिया की जगह.
- 37 पर एक बाँझ कंटेनर में मध्यम की 11 मिलीलीटर रखें20-30 मिनट के लिए सी °. इनक्यूबेटर से फ्लास्क निकालें. एक बाँझ serologic विंदुक का प्रयोग, हटाने और organoids परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है, कुप्पी से वातानुकूलित मध्यम त्यागें.
- एक नए बाँझ serologic विंदुक का प्रयोग, पूर्व गर्म ताजा माध्यम से 11 मिलीलीटर जोड़ें. बहुत धीरे कुप्पी सतह भर में मध्यम वितरित करने कुप्पी बारी बारी से. एक humidified 5.0% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं.
- 10 के बाद - संस्कृति में 14 दिन, पक्षपाती नहीं कर रहे हैं कि संस्कृति फ्लास्क में ऊतक के किसी टुकड़े को हटा दें.
- Xenograft प्रत्यारोपण के लिए समय-समय पर फसल की कोशिकाओं और / या नई संस्कृति बोतल में प्रचार के लिए कुप्पी से organoids, या प्ररूपी और / या आणविक विश्लेषण के लिए.
- इनक्यूबेटर से टिशू कल्चर कुप्पी निकालें. 70% इथेनॉल के साथ फ्लास्क स्प्रे. 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव किया गया है कि एक साफ कागज तौलिया के साथ कुप्पी पर अतिरिक्त इथेनॉल से साफ कर लें.
- Organoid प्रचार: <राजभाषा>
- कुप्पी के ढक्कन खोलें और जैविक सुरक्षा कैबिनेट में ढक्कन चेहरा ऊपर जगह है. सूक्ष्म दृश्य के तहत, organoid (ओं) काटा जा करने के लिए खोजें. पिकअप को एक organoid बाँझ चिमटी या संदंश का प्रयोग करें.
- एक नई संस्कृति फ्लास्क में organoid प्रचार करने के लिए, नई कुप्पी में organoid जगह है. 11 मिलीलीटर ताजा, गर्म मध्यम जोड़ें. 3.6.3 - कदम 3.3 में वर्णित के रूप में एक humidified 5% सीओ 2 के माहौल में, 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. टिशू कल्चर में सेल संस्कृति के माध्यम से प्रति सप्ताह तीन बार फ्लास्क बदलें.
- कोशिकाओं कटाई:
- प्रत्यक्ष सूक्ष्म vixualization के तहत, धीरे परिमार्जन और महाप्राण कोशिकाओं और mammospheres बाँझ डिस्पोजेबल पिपेट सुझावों के साथ एक 1000 μl विंदुक का उपयोग. कोशिकाओं और आसपास के मध्यम aspirate. एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं / मध्यम बांटना.
- 5 सेकंड के लिए 12,100 XG पर एक छोटा-अपकेंद्रित्र में संक्षेप में कोशिकाओं स्पिन. निकालें और मध्यम त्यागें. <राजभाषा>
- डीएनए विश्लेषण के लिए, तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के साथ, मध्यम (10 μl) की एक छोटी मात्रा में, सूखी बर्फ पर सेल गोली फ्रीज.
- प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए, मास स्पेक्ट्रोमेट्री या पश्चिमी सोख्ता / रिवर्स चरण प्रोटीन के लिए 2x एसडीएस Tris-ग्लाइसिन बफर के लिए 8 एम यूरिया की 10 μl में कोशिकाओं lyse. वैकल्पिक रूप से, immunohistochemical विश्लेषण के लिए सेल स्मीयर बनाने के लिए एक cytocentrifuge में कोशिकाओं स्पिन.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
सीटू के ऊतकों में बाँझ स्तन ductal कार्सिनोमा की खरीद और संवर्धन के लिए कार्यप्रवाह
स्तन ऊतक बाँझपन ठेठ अस्पताल विकृति कार्यप्रवाह में मामूली परिवर्तन (चित्रा 1) के माध्यम से सेल संस्कृति प्रयोगशाला के लिए ऑपरेटिंग कमरे से बनाए रखा है. ऊतक ऊतक बाँझपन बनाए रखते हुए radiologic मूल्यांकन की अनुमति देता है जो एक प्लास्टिक की फिल्म कवर के साथ एक बाँझ कंटेनर में ले जाया जाता है. एक स्तन लुम्पेक्टोमी या स्तन नमूना के सकल ऊतक प्रसंस्करण बाँझ दस्ताने, ब्लेड, और ऊतक अंकन रंगों के साथ किया जाता है. बगल में स्तन ductal कार्सिनोमा के सकल शब्द के भागों उपस्थिति लाल / पीले रबड़ ऊतक से घिरा हुआ एक किरकिरा / फर्म बनावट, साथ पीला, थोड़ा उठाया क्षेत्रों जैसा दिखता है. नलीपरक हाइपरप्लासिया और DCIS के क्षेत्रों कारण calcifications को "किरकिरा" और फर्म महसूस कर सकते हैं. स्तन के ऊतकों के इन क्षेत्रों में अक्सर तन या आसपास के स्तन के ऊतकों की तुलना में एक अलग रंग दिखाई देते हैं. हालांकि, ADH गएक ही ऊतक संग्रह और दाग ऊतक वर्गों के वैकृत समीक्षा के बाद प्रतिष्ठित किया. स्तन ऊतक मानव पुनः संयोजक EGF (10 एनजी / एमएल), इंसुलिन (10 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) और जेंटामाइसिन सल्फेट के साथ पूरक सीरम मुक्त पोषक मध्यम में ऊतक और / या नलीपरक organoids डुबो कर व्यवहार्य रहता है (20 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) 5. हटाने योग्य / पुनः sealable lids के साथ सेल संस्कृति बोतल कोशिकाओं / organoids (चित्रा 1E-एफ) की आवधिक कटाई की अनुमति. इस मॉडल को सफलतापूर्वक (एन = 18) बगल में 20 से अधिक असामान्य नलीपरक हाइपरप्लासिया के साथ का निदान रोगियों (एन = 2) और ductal कार्सिनोमा से मानव स्तन पूर्व आक्रामक घावों प्रचारित.
इन विट्रो में और vivo में सहज mammosphere गठन
Mammospheres और 3-डी संरचनाओं असामान्य नलीपरक हाइपर के साथ का निदान अलग मरीजों से कई, स्वतंत्र मानव DCIS वाहिनी ऊतक टुकड़े से अनायास पैदा हुईबगल में plasia या ductal कार्सिनोमा (चित्रा 3 एवं 4) 5,9. स्तन के ऊतकों के enzymatic विघटन से पहले एक मिश्रित-सेल प्रकार संस्कृति के परिणामस्वरूप जो टिशू कल्चर, के अनुरूप प्रदर्शन नहीं किया गया था. न तो सीरम, तहखाने झिल्ली निकालने, और न ही जेल की तरह matrices के सहज mammosphere गठन (चित्रा 4) के लिए आवश्यक थे. mammospheres आक्रामक कैंसर के रूप में ही विकास पैटर्न के साथ एक इशारा / SCID माउस मॉडल में (चित्रा 5) 5 स्तन xenograft ट्यूमर उत्पन्न. इन परिणामों से मानव स्तन के भीतर पूर्व अस्तित्व में संभावित आक्रामक साथ पूर्वज कोशिकाओं वाहिनी DCIS लेकिन जाहिरा तौर पर नलीपरक आला द्वारा जांच में आयोजित की जाती हैं और organoid संस्कृति में उभरने के लिए राजी कर लिया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है. इन कोशिकाओं को आक्रामक फेनोटाइप 5,9,10 के प्रकट अभिव्यक्ति के लिए पहले से मौजूद हैं कि स्तन स्टेम कोशिकाओं की तरह की एक नई श्रेणी बनाते हैं.
उपकला व्युत्पन्न mammospheres और xenograf की पुष्टिटीएस
mammospheres से व्युत्पन्न mammospheres और xenografts उपकला मूल होने के रूप में immunofluorescence द्वारा पुष्टि की गई. उपकला कोशिका आसंजन अणु (EpCAM) उपकला कोशिकाओं 11 पर व्यक्त की एक झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन है. मानव EpCAM (हरा) और एक परमाणु दाग (DAPI, नीला) के लिए प्रतिक्रियाशील एक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ immunofluorescence संस्कृति में mammospheres में (चित्रा 6A) और एक इशारा / SCID xenograft (चित्रा 6B) के केंद्र EpCAM सकारात्मक कोशिकाओं से पता चला है.
बरकरार तहखाने झिल्ली सीमाओं का सत्यापन
देखभाल histopathologic निदान के मानक के तहत स्वतंत्र वैकृत विश्लेषण द्वारा सत्यापित mammosphere, इस संस्कृति प्रणाली में नियोप्लास्टिक उपकला कोशिकाओं, फ्रैंक आक्रमण या microinvasion से रहित थे कि पूर्व इनवेसिव स्तन घावों से प्राप्त किए गए गठन. एक ही रोगी से एकाधिक organoid संरचनाओं के लिए mammosphere उत्पन्नtumorigenic साबित हुई कि मिंग कालोनियों. इसके अलावा, organoid संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया ऊतक के histopathologic परीक्षा बरकरार तहखाने झिल्ली सीमाओं (चित्रा 7B) 5 के साथ मिला हुआ intraductal घावों का पता चला. इस प्रकार यह इस संस्कृति प्रणाली में गठित सहज mammospheres पूर्व आक्रामक नियोप्लास्टिक क्षेत्रों से ही ली गई है और microinvasion 5 की दुर्लभ क्षेत्रों के उत्पाद नहीं कर रहे हैं कि यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है.
रेडियोलॉजिकल इमेजिंग और सकल ऊतक विच्छेदन के दौरान ऊतक बाँझपन बनाए रखने के लिए 1. कार्यप्रवाह चित्रा. ऑपरेटिंग सूट में (ए), स्तन ऊतक (दिखाया लुम्पेक्टोमी नमूना) एक बाँझ ट्रे में रखा और बाँझ प्लास्टिक की चादर के साथ कवर किया जाता है. ऊतक प्लास्टिक ट्रे में सीधे imaged किया जा सकता है. (बी) ऊतक की पहचान के लिए कमाई करने वाली DCIS के क्षेत्रों में. एकल-उपयोग केवल ऊतक अभिविन्यास रंगों बाँझ कपास इत्तला दे दी swabs का उपयोग कर ऊतक की सतह पर चित्रित कर रहे हैं. घरेलू आसुत सफेद सिरका ऊतक पर सीधे डाल दिया और बाँझ कपास धुंध के साथ मिट जाता है. (सी और डी) स्तन ऊतक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक पोषक तत्व अमीर मध्यम में टिशू कल्चर प्रयोगशाला में ले जाया जाता है. ऊतक विच्छेदन, DCIS के क्षेत्रों को अलग करने के लिए बाँझ दस्ताने और ब्लेड / नलियां / कैंची का उपयोग किया जाता है. DCIS के टिशू कल्चर के लिए कई organoids में कट जाता है. (ई एंड एफ) स्तन organoids की इन विट्रो संस्कृति. मानव DCIS के ऊतक ऊतक की पूर्व enzymatic पाचन के बिना, हटाने योग्य lids के साथ टिशू कल्चर बोतल में सीधे रखा गया है. Organoid चारों ओर एक हवा तरल इंटरफेस को बनाए रखते हुए epidermal वृद्धि कारक है और इंसुलिन के साथ पूरक सीरम मुक्त संस्कृति के माध्यम से एक न्यूनतम राशि सेलुलर विकास का समर्थन करता है.6fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
स्तन DCIS के ऊतक के लिए सकल ऊतक प्रसंस्करण चित्रा 2. चित्रण. लुम्पेक्टोमी या स्तन ऊतक नमूना के माध्यम से सभी तरह से काटने के बिना खड़ी ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया द्वारा पतली वर्गों में कट जाता है. कटौती ऊतक रोटी के एक पाव रोटी जैसा दिखता है के बाद से यह विच्छेदन विधि अक्सर "रोटी पाव तकनीक" के रूप में जाना जाता है. DCIS युक्त के संदिग्ध क्षेत्र (ओं) को काट कर और 2 में कटा रहे हैं - नैदानिक विकृति और organoid संस्कृति के लिए 3 मिमी स्लाइस.
चित्रा 3. एक मिश्रित सेल प्रकार संस्कृतिविवो सेल आबादी में प्रतिनिधि बनाए रखता है. स्तन से उत्पन्न मिश्रित सेल संस्कृति की (ए) चरण विपरीत छवि खेती सफलतापूर्वक DCIS, लंगर स्वतंत्र विकास के साथ उपकला कोशिकाओं व्युत्पन्न ऊपर की ओर बढ़ रही है और विस्तार mammospheres के रूप में परिभाषित प्रचारित इन विट्रो organoid 11 सप्ताह (4X बढ़ाई). (बी एंड सी) से अधिक घावों DCIS , और EGF, इंसुलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन और जेंटामाइसिन (10x बढ़ाई) के साथ पूरक सीरम मुक्त माध्यम में, वाहिनी की तरह 3-डी संरचनाओं lobulated. (डी) उदाहरण संस्कृति (40x बढ़ाई) में 11 सप्ताह के बाद गठित mammosphere. लिए यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने.
उठना, चित्रा 4.सीरम मुक्त organoid संस्कृति में mammospheres का गठन. संस्कृति के 33 दिनों (10X बढ़ाई, 20X इनसेट) निम्नलिखित एक उदाहरण mammosphere गठन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5. इशारा / SCID माउस xenograft मॉडल. Xenografts DCIS (माउस सही स्तन वसा पैड) के साथ या आक्रामक DCIS (माउस छोड़ दिया स्तन वसा पैड) के साथ का निदान एक रोगी से निदान एक रोगी से व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं को इंजेक्शन के द्वारा उत्पन्न किए गए थे. शुद्ध DCIS और आक्रामक DCIS दोनों से व्युत्पन्न xenografts एक समान विकास पैटर्न और दर का पता चला. टी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंउसका आंकड़ा.
चित्रा 6 Mammospheres उपकला मूल के होने की पुष्टि कर रहे हैं. DCIS युक्त स्तन नलिकाओं से उत्पन्न mammospheres और माउस xenografts की उपकला मूल पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया था FITC संयुग्मित विरोधी EpCAM साथ immunofluorescence. (ए) EpCAM-FITC सकारात्मक कोशिकाओं (छद्म रंग हरा, 488 एनएम) केवल स्तन organoids से निकलती मिश्रित सेल संस्कृतियों के mammospheres (DAPI (छद्म रंग नीला, 408 एनएम) परमाणु दाग) में देखा गया था. (बी) formalin तय आयल एम्बेडेड माउस xenograft ऊतक वर्गों में EpCAM सकारात्मक कोशिकाओं केवल xenograft ट्यूमर खंड के केंद्र में पाया गया. (20x बढ़ाई) इस figu का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंपुनः.
चित्रा 7. कोलेजन चतुर्थ immunohistochemistry नलिकाओं आसपास बरकरार तहखाने झिल्ली का पता चलता है. सामान्य स्तन नलिकाओं (ए) कोलेजन चतुर्थ (diaminobenzidine = भूरे रंग धुंधला) में समृद्ध बरकरार तहखाने झिल्ली से घिरे हैं. Organoid संस्कृति के बाद, स्तन ऊतक भी mammospheres DCIS के क्षेत्रों से ली गई है और कर रहे हैं कि इस बात की पुष्टि बरकरार तहखाने झिल्ली शामिल नहीं आक्रामक कैंसर (कोलेजन चतुर्थ immunohistochemistry, पैनल एक 4x बढ़ाई, पैनल बी 10X). से का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस के साथ साथ वर्णित संस्कृति प्रणाली बुनियादी और शोधों के अध्ययन के लिए रहने वाले पूर्व आक्रामक नियोप्लास्टिक स्तन कोशिकाओं को पैदा करने के लिए एक नए मॉडल का गठन किया. अतीत में, पूर्व घातक स्तन कैंसर प्रगति आम तौर पर तीन अलग अलग तरीकों का उपयोग कर अध्ययन किया गया है. पहली विधि histopathologic और microdissected जमे हुए या निर्धारित मानव नमूनों 12-14 का आनुवांशिक विश्लेषण है. दूसरी विधि मानव पूर्व इनवेसिव स्तन घावों 15 के समान माना जाता है कि hyperplastic वायुकोशीय पिंड (हान घावों) को शामिल कि माउस मॉडल का इस्तेमाल करता है. तीसरे मॉडल ऐसी आकृति विज्ञान 3,4 की तरह एक अत्यधिक विभेदित DCIS है कि MCF7 sublines (MCF10A) के रूप में स्तन कार्सिनोमा सेल लाइनों की स्थापना का उपयोग करता है. इन तीन मॉडलों स्तन कैंसर प्रगति के लिए आणविक सुराग प्रदान की है हालांकि, इन तरीकों में से कोई भी घातक संभावित या एक व्यक्ति रोगी के घाव (ओं) में आणविक फेनोटाइप का आकलन करने में सक्षम हैं. Histopathologic विश्लेषण पूर्व आक्रामक घावों में कोशिकाओं के कार्यात्मक फेनोटाइप के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है. स्तन कैंसर प्रगति के माउस मॉडल सही रूप में सीटू 16-18 में histomorphology और मानव असामान्य नलीपरक हाइपरप्लासिया, सीटू में lobular कार्सिनोमा की विविधता, और ductal कार्सिनोमा प्रतिबिंबित नहीं कर सकते. इसके अलावा, स्ट्रोमल microenvironment और बाह्य मैट्रिक्स आसपास माउस अग्रदूत घावों के बयान मानव समकक्ष 16 से स्पष्ट रूप से अलग हैं. सहज murine अग्रदूत घावों आक्रमण और मेटास्टेसिस को प्रगति की एक बहुत कम स्तर का प्रदर्शन कर सकते हैं. प्रतिरक्षा दबा मेजबान 3,4 में प्रत्यारोपित अगर तीसरा तरीका, सुसंस्कृत सेल लाइनों, केवल कार्यात्मक प्ररूपी जानकारी प्रदान कर सकते हैं. इसके अलावा एक लंबे passaged सेल लाइन की आनुवंशिक असामान्यताएं मनुष्यों 2 में सहज स्तन कैंसर प्रगति का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं. अंत में, यह अच्छी तरह से स्थापित है कि प्रत्येक मरीज की रसौलीआक्रमण और मेटास्टेसिस 13,14,17 के लिए विकास की दर, भेदभाव राज्य, और प्रगति ड्राइव कि आनुवंशिक और epigenetic असामान्यताओं का अनोखा मेल है. मानव पूर्व आक्रामक घावों सेल संरचना और histomorphology में Multifocal और विषम हैं. इसके अलावा, जीवविज्ञान घातक क्षमता एक व्यक्ति मरीज के पूर्व आक्रामक घाव के लिए अज्ञात है.
हमारे प्राथमिक टिशू कल्चर विधि मानव पूर्व इनवेसिव स्तन कैंसर के पिछले मॉडल की कमियों पर काबू पा और निम्न लाभ प्रदान करता है: 1) organoid संस्कृति प्रणाली अनायास बढ़ने और उत्पादन होगा कि mammospheres उत्पन्न कि देशी ऊतक microenvironment भीतर नियोप्लास्टिक सेल आबादी की वृद्धि का समर्थन करता है माउस xenograft मॉडल में आक्रामक ट्यूमर. कोशिकाओं एक व्यक्ति मरीज के जीनोटाइप और फेनोटाइप का प्रतिनिधित्व करते हैं और इस तरह व्यक्तिगत चिकित्सा, या व्यक्तिगत रोग का निदान के लिए जानकारी प्रदान करते हैं. 2) organoid संस्कृति प्रणाली Maintains देशी सेलुलर उप-जनसंख्या और प्राथमिक स्तन के ऊतकों में मूल रूप से उपस्थित गैर घातक उपकला कोशिकाओं, stromal कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर खेती करने के लिए एक साधन प्रदान करता है, और organoid भीतर संस्कृति में किया जाता है. संस्कृति प्रणाली में मीडिया की कम मात्रा एक कृत्रिम तीन आयामी मचान के लिए आवश्यकता के बिना संरचनाओं की तरह सहज mammosphere गठन और विभेदित वाहिनी और वायुकोष्ठिका उत्साहजनक ऑक्सीजन विनिमय का समर्थन करता है. 3) प्राथमिक सेल संस्कृति एंजाइमी हदबंदी या बहिर्जात आनुवंशिक संशोधन द्वारा उत्पन्न संशोधनों और चयन से मुक्त है. इसके अलावा, पोषक मध्यम कम लागत और तैयार करने के लिए सरल है. 4) आणविक और आनुवंशिक विश्लेषण पूरी संस्कृति में खलल न डालें बिना समय में विभिन्न बिंदुओं पर संस्कृति से विशेष सेल आबादी और / या organoids पर आयोजित किया जा सकता है. 5) organoid संस्कृति प्रणाली देशी सेल आबादी की वृद्धि, विभेदित आकारिकी और सेल सेल बातचीत परमिट जो कर सकते हैंपहले और संस्कृति मीडिया में चिकित्सीय एजेंटों की शुरूआत के बाद से अध्ययन किया.
प्राथमिक टिशू कल्चर कुछ फायदे हैं, यह सीमाओं के बिना नहीं है. organoid संस्कृति किसी भी एक सेल प्रकार की अतिवृद्धि के बिना, मिश्रित सेल संस्कृतियों के विकास का समर्थन करता है. हालांकि, सेल प्रकार के विशिष्ट अनुपात विवो में पाया सटीक सेलुलर अनुपात पुनरावृत्ति नहीं हो सकता है इस तरह से नियंत्रित नहीं किया जा सकता. सफल organoid खेती कई सामुदायिक अस्पताल पैथोलॉजी प्रयोगशालाओं में नियमित प्रक्रिया नहीं कर रहे हैं, जो दोनों बाँझ ऊतक संग्रह और प्रसंस्करण की आवश्यकता है. नैदानिक शोधकर्ताओं के बीच अच्छा संचार, शल्य चिकित्सा स्टाफ, और विकृति स्टाफ रोगी देखभाल की निरंतरता के भीतर नमूना बाँझपन बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं.
Organoid संस्कृति की एक और सीमा सेलुलर फेनोटाइप और जीन अभिव्यक्ति 16,19 पर बुनियाद दृढ़ता का प्रभाव है. संस्कृति में स्टेम कोशिकाओं के भेदभावसीरम युक्त मध्यम के अलावा द्वारा प्रेरित किया जा सकता है या संस्कृति में विस्तारित समय के कारण हो सकता है. एक स्टेम तरह phenotype के इस गैर एंजाइमी, सीरम मुक्त organoid संस्कृति प्रणाली 5 में कई महीनों के बाद बनाए रखा गया था. कोशिकाओं, छोटे सघन हो जाते हैं, और mammospheres फार्म को विफल - हालांकि, समय में कुछ बिंदु पर, कोशिकाओं आकृति विज्ञान देखा जा सकता है जो अंतर हो सकता है. ऐसे transfections के रूप में समय के साथ सेल phenotype में परिवर्तन, आणविक प्रयोगों के साथ संभावित समस्याओं से बचने या assays के नीचे दस्तक करने के लिए, बल्कि पुराने संस्कृतियों (6 माह से अधिक) के साथ तुलना में युवा संस्कृतियों के साथ किया जाना चाहिए.
सफल organoid संस्कृति की चाबी संस्कृति फ्लास्क में मध्यम का एक उचित मात्रा का उपयोग करते हुए, और organoids समय टिशू कल्चर कुप्पी का पालन करने की अनुमति दे रहे हैं. कुप्पी सीमा ऑक्सीजन प्रसार में अतिरिक्त मध्यम, mammosphere गठन बाधा. पहले 3 - organoids आज़ादी के लिए संलग्न करने के लिए के लिए टिशू कल्चर के 7 दिनों के लिए महत्वपूर्ण हैंसंस्कृति फ्लास्क मुकदमा. एक organoid दिन 14 से जुड़ी नहीं होती है तो सामान्य तौर पर, यह संभावना किसी भी व्यवहार्य DCIS के नलीपरक क्षेत्रों को शामिल नहीं करता है और पक्षपाती नहीं बन जाएगा. दिन में 14 से पक्षपाती नहीं कर रहे हैं कि Organoids संस्कृति से हटा दिया जाना चाहिए. व्यवहार्य स्तन DCIS के नलिकाओं की कमी 10% formalin में organoid फिक्सिंग और ऊतक धुंधला और सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए तेल ब्लॉकों में ऊतक प्रसंस्करण द्वारा निम्नलिखित संस्कृति सत्यापित किया जा सकता है.
हमारे गैर एंजाइमी, सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली निष्कर्ष आक्रामक क्षमता के साथ आनुवंशिक रूप से असामान्य नियोप्लास्टिक अग्रदूत साबित कोशिकाओं पूर्व आक्रामक मानव स्तन घावों 5,9,20 के भीतर मौजूद है कि परिकल्पना का समर्थन है. यह निष्कर्ष Sgroi एट अल., मानव स्तन पूर्व आक्रामक घावों और Damonte एट अल का आनुवांशिक विश्लेषण का आयोजन किया है. स्तन अंतःउपकला रसौली परिणाम का अध्ययन किया जो (MINO) स्तन कैंसर प्रगति 12,14 के murine मॉडल के पिछले काम के अनुरूप है 21. लिया togeवहाँ दूसरों के निष्कर्ष के साथ, व्यक्ति रोगी पूर्व आक्रामक घावों की हमारी संस्कृति मॉडल एक मरीज की आक्रामक स्तन कैंसर के आक्रामक फेनोटाइप काफी हद तक पूर्व आक्रामक चरण में पूर्व निर्धारित हो सकता है कि अवधारणा का समर्थन करता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम से आंशिक रूप से समर्थन किया था (1) रक्षा विभाग के स्तन कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान अधिग्रहण गतिविधि) # लाल को W81XVVH-10-1-0781 और वे पुरस्कार, और (2) सुसान जी Komen फाउंडेशन अनुदान IR122224446 लाल और वे करने के लिए. पैथोलॉजी समर्थन और ऊतक कमाई करने वाली कृपया Inova फेयरफैक्स पैथोलॉजी विभाग, डॉ हसन Nayer, डॉ गीता ए मेनेजीस, और डॉ चार्ल्स Bechert द्वारा प्रदान की गई थी. रोगी सहमति और नमूना खरीद expertly Inova फेयरफैक्स अस्पताल नैदानिक अनुसंधान समन्वयकों होली Gallimore, हीथ Huryk, और एमिल कमार द्वारा निर्देशित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10 cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2 µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50 ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10 mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100 µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10 mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10 mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22 µm PES membrane |
| 25 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10 ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| Petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115 cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 °C, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8 M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
References
- Shaughnessy, J. A., et al. Treatment and prevention of intraepithelial neoplasia: an important target for accelerated new agent development. Clin Cancer Res. 8 (2), 314-346 (2002).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11 (5), (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Espina, V., et al. Malignant precursor cells pre-exist in human breast DCIS and require autophagy for survival. PLoS One. 5 (4), (2010).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Farnie, G., et al. Novel cell culture technique for primary ductal carcinoma in situ: role of Notch and epidermal growth factor receptor signaling pathways. J Natl Cancer Inst. 99 (8), 616-627 (2007).
- Wicha, M. S., Liotta, L. A., Garbisa, S., Kidwell, W. R. Basement membrane collagen requirements for attachment and growth of mammary epithelium. Exp Cell Res. 124 (1), 181-190 (1979).
- Espina, V., Liotta, L. A. What is the malignant nature of human ductal carcinoma in situ. Nat Rev Cancer. 11 (1), 68-75 (2011).
- Gong, C., et al. Beclin 1 and autophagy are required for the tumorigenicity of breast cancer stem-like/progenitor cells. Oncogene. 32 (18), 2261-2272 (2012).
- Simon, B., et al. Epithelial glycoprotein is a member of a family of epithelial cell surface antigens homologous to nidogen, a matrix adhesion protein. PNAS. 87 (7), 2755-2759 (1990).
- Ma, X. J., et al. Gene expression profiles of human breast cancer progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5974-5979 (2003).
- Schnitt, S. J., Harris, J. R., Smith, B. L. Developing a prognostic index for ductal carcinoma in situ of the breast. Are we there yet. Cancer. 77 (11), 2189-2192 (1996).
- Sgroi, D. C.
- Asch, H. L., Asch, B. B. Heterogeneity of keratin expression in mouse mammary hyperplastic alveolar nodules and adenocarcinomas. Cancer Res. 45 (6), 2760-2768 (1985).
- LaBarge, M. A., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Of microenvironments and mammary stem cells. Stem Cell Rev. 3 (2), 137-146 (2007).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Vaillant, F., Asselin-Labat, M. L., Shackleton, M., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The emerging picture of the mouse mammary stem cell. Stem Cell Rev. 3 (2), 114-123 (2007).
- Kim, D. H., et al. Actin cap associated focal adhesions and their distinct role in cellular mechanosensing. Sci Rep. 2, 555 (2012).
- Espina, V., Wysolmerski, J., Edmiston, K., Liotta, L. A. Attacking breast cancer at the preinvasion stage by targeting autophagy. Women's Health. 9 (2), 1-14 (2013).
- D'amonte, P. Mammary carcinoma behavior is programmed in the precancer stem cell. Breast Cancer Res. 10 (3), (2008).
