Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetische stimulatie van de gehoorzenuw

Published: October 8, 2014 doi: 10.3791/52069
Automatic Translation
1,2,5, 1,3, 3, 1, 1, 3, 1,2,4
1InnerEarLab, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 2Bernstein Focus for Neurotechnology, University of Goettingen, 3Auditory Systems Physiology Group, Department of Otolaryngology, University Medical Center Goettingen, 4Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, University of Goettingen, 5Department of Chemical, Electronic, and Biomedical Engineering, University of Guanajuato

Summary

Cochleair implantaat (CI) in staat stellen het horen door directe elektrische stimulatie van de gehoorzenuw. Echter, slechte frequentie en intensiteit resolutie beperkt de kwaliteit van het gehoor met CI. Hier beschrijven we optogenetische stimulatie van de gehoorzenuw in muizen als een alternatieve strategie voor auditieve research en ontwikkeling van toekomstige CI's.

Abstract

Directe elektrische stimulatie van de spiraal ganglion neuronen (Sgns) door cochleair implantaat (CI) kan geopend spraakverstaan ​​in het merendeel van de geïmplanteerde dove proefpersonen 1-6. Niettemin geluidsverwerkingsalgoritme met huidige CI heeft slechte frequentie en intensiteit resolutie door brede stroomspreiding van elk contact elektrode activeren een groot aantal Sgns langs de tonotopische as van het slakkenhuis 7-9. Optische stimulatie wordt voorgesteld als een alternatief voor elektrische stimulatie die ruimtelijk meer belooft beperkt activatie van Sgns en derhalve hogere frequentieresolutie codering. De laatste jaren heeft directe infrarood verlichting van de cochlea gebruikt om reacties oproepen bij de gehoorzenuw 10. Toch vereist het hogere energieën dan elektrische stimulatie 10,11 en de onzekerheid blijft bestaan ​​over het onderliggende mechanisme 12. Hier wordt een methode op basis van optogenetics om Sgns stimuleren beschrijven wemet een lage intensiteit blauw licht, met behulp van transgene muizen met neuronale expressie van channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 of-virus gemedieerde expressie van de ChR2-variant Catch 14. We gebruikten micro-light emitting diodes (μLEDs) en vezel gekoppeld lasers om ChR2 expressie Sgns stimuleren door middel van een kleine kunstmatige opening (cochleostomie) of het ronde venster. We getest de reacties van hoofdhuid opnames van licht-evoked potentials (optogenetische auditieve hersenstam respons: oABR) of door micro-elektrode opnames van de auditieve route en vergeleken hen met akoestische en elektrische stimulatie.

Introduction

Volgens de World Health Organization, 360 miljoen mensen wereldwijd lijden aan gehoorverlies. In dove proefpersonen, directe elektrische stimulatie van Sgns door CIS staat geopend spraakverstaan ​​in de meerderheid van hen 1,2,4,5. Ook al CI geïmplanteerd bij meer dan 200.000 mensen, dus de meest succesvolle neuroprothese, geluid codering gedreven door de huidige cochleaire implantaten is beperkt. CI's door elektrische stimulatie een aantal elektrodes waar iedereen activeert een tonotopische gebied van de gehoorzenuw aldus de disfunctionele sensorische orgaan van Corti omzeilen in de cochlea. Normaal horende luisteraars kunnen discrimineren meer dan 2000 frequenties, maar de huidige CI's gebruiken slechts tot 12-22 frequentie kanalen 4. Dit komt door wijdverspreide stroom uit elke prikkelelektrode 7,9 activering van een groot aantal Sgns dat vele verschillende geluidsfrequenties 8,15 vertegenwoordigen. Dezebeperking kan worden verbeterd met behulp van multipolaire stimulatie, maar ten koste van hogere stroomverbruik 16,17. Hun output dynamisch bereik voor geluid intensiteit is ook beperkt, meestal onder de 6-20 dB 4,18. Om deze redenen, het verbeteren van de frequentie en intensiteit resolutie zijn belangrijke doelstellingen voor het verhogen van CI prestaties om spraakherkenning te verbeteren in rumoerige omgevingen, prosodie begrip en muziekbeleving.

Een andere optie om de gehoorzenuw stimuleren is optische stimulatie. Licht kan gemakkelijk worden gericht op een kleine populatie SGN target veelbelovende betere ruimtelijke opsluiting toenemende frequentie resolutie en ook groter dynamisch bereik, wat resulteert in een betere resolutie intensiteit. Inderdaad, cochleaire stimulering met infrarood licht heeft uitstekende frequentieresolutie in diermodellen 10,11,19. Een nadeel van dergelijke stimulatie is dat het hogere energieën dan elektrische stimulatie vereist 12,20.

Als alternatief voor infrarode stimulatie, in dienst nemen we optogenetics te renderen Sgns licht gevoelig. Optogenetics is een nieuwe benadering die genetische en optische technieken combineert non-invasively en specifiek controle cellen met hoge temporele precisie (reviews 21 en 23). De momenteel meest gebruikte modaliteit stelt de expressie van microbiële channelrhodopsin 2 (ChR2) gen van Chlamydomonas reinhardtii en varianten daarvan, coderend voor een lichte-gated kation kanaal 24. ChR2 is een 7-transmembraan-helix eiwit dat bij getransduceerd tot neuronen en geactiveerd door blauw licht, fungeert als niet-selectief kation-kanaal, waardoor depolariseren de cellen 24-27. ChR2 is goed gekarakteriseerd 24,28- 31 en veel varianten ontwikkeld om actio wijzigenn spectrum, poorten en permeabiliteitseigenschappen 32,33. Het doel van ons werk is cochleair optogenetics stellen voor de activering van de gehoorbaan. We merken dat de optogenetic benadering van de gehoorzenuw stimuleren vereist genetische manipulatie van de ganglion spirale voor de expressie van channelrhodopsin. Werken met muizen en ratten maakt het gebruik van beschikbare transgene dieren 13,34,35, die expressie van channelrhodopsin bieden weinig variabiliteit langs de tonotopische as en in dieren 36. De combinatie van voorwaardelijke allelen 37 met de juiste Cre-lijnen zorgt voor cel-specifieke expressie. Genoverdracht in de ganglion spirale andere dieren het gebruik van virussen zoals adeno-geassocieerd virus dat een standaard aanpak optogenetics 38 en dat we bleek goed in muizen 36. Genetische manipulatie en expressie van transgenen coderend buitenaardse eiwitten beer risico op bijwerkingen zoals immune reacties en / of proliferatie, gecompromitteerde toestand of zelfs de dood van de genetisch gemanipuleerde cellen. Ten behoeve van deze demonstratie gebruiken we transgene muizen die ChR2 in ganglion spirale neuronen onder Thy-1 promotor 13 optisch stimuleren gehoorbaan. We merken dat andere channelrhodopsin varianten kunnen worden gebruikt voor hetzelfde doel als we aangetoond met virus-bemiddelde overdracht van de variant val 14 in Sgns 39.

Terwijl cochleair optogenetics vereist genetische manipulatie, het biedt moleculaire afstelling voor optimale SGN stimulatie en beloften verbeterde frequentie en intensiteit resolutie in vergelijking met elektrische stimulatie. Optogenetische stimulatie van de auditieve route is zeer relevant voor het horen van het onderzoek. Zo belooft vooruitgang in studies van de activiteit-afhankelijke verfijning van tonotopy tijdens de ontwikkeling, in de analyse van de vereiste spectrale integratie geluid localization en de mate van interactie tussen frequentiespecifieke afferente projecties in het centrale auditieve systeem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten die in dit werk werden uitgevoerd met de ethische normen gedefinieerd door de Duitse wet betreffende de bescherming van proefdieren. De universiteit van Göttingen raad voor dierenwelzijn en het welzijn van dieren kantoor van de deelstaat Nedersaksen ingestemd met de experimenten.

1 Voorbereiding van μLED-stimulator

  1. Voor μLEDs, eerst de μLED-stimulator te bereiden. Gebruik blauwe LED's met 200 van 200 micrometer actieve oppervlak (μLED, zie Materialen tabel).
  2. Soldeer de draden aan de μLED. Dan, in te kapselen de μLED en de verbindingen met epoxy lijm. Laat het 's nachts apparaat te laten de epoxy genezen.
  3. Voor mechanische stabiliteit en elektrische isolatie trechter de draden door een dunne glazen capillair gebruik 1 mm buitendiameter borosilicaat capillairen en sluit de verbinding met epoxy (figuur 1D), zodat het capillair op een mechanische manipulator kan worden gemonteerd.
    OPMERKING: Thier is een trade-off van het maken van de capsule dik genoeg om een ​​goede elektrische isolatie (vermijden van stimulatie artefacten) te krijgen, maar dun genoeg om te laten de LED vrij bewegen in de bulla en om het te vinden op de cochleostomie. Het is een goede gewoonte om meer dan een LED te bereiden.
  4. Om een ​​goede elektrische isolatie te bevestigen, eerst een petrischaal met 0,9% NaCl en dip 3 kale eindigde koperdraden te bereiden in de vloeistof. Dit dient om een ​​dier met ABR elektroden simuleren. Sluit de draden aan op de ABR-versterker en van daaruit naar een oscilloscoop.
  5. Vervolgens sluit u de LED aan de stimulator en ondergedompeld in de oplossing, totdat het helemaal bedekt is. Rijden de LED met pulsen (zie stap 3.1.1) bij de maximale toegestane stroom langer dan 20 minuten en controleer stimulatie artefacten. Als ze verschijnen, gooi de LED en probeer een nieuwe.

2 chirurgische ingreep

  1. Gebruik 4-10 weken oude transgene muizen die ChR2 onder de Thy1.2 promotor (lijn 9in Wang et al. 13). Om de dieren te manipuleren en uit te voeren de operatie, altijd schoon en goed geïdentificeerde chirurgische instrumenten.
  2. Verdoven dieren met een ip injectie van een mengsel van urethaan (1,32 mg / kg), xylazine (5 mg / kg) en buprenorfine 0,1 ug / g verdund in 0,9% steriele NaCl oplossing en plaats de muis op een verwarmingsplaat voor het handhaven body temperatuur op 37 ° C. Met deze dosis verdoving meestal duurt de hele experimentele protocol.
    1. Gaat 10 minuten na de eerste verdoving inductie controle op tekenen van opwinding door de poot terugtrekking reflex. Bij bewegingen toepassing onderhoudsdoses van urethaan (0,66 mg / kg) en buprenorfine (0,05 ug / g) verdund in 0,9% steriele NaCl oplossing (zonder xylazine). Controleer nogmaals de poot terugtrekking reflex en ga alleen als de reflex is afwezig.
  3. Scheren de retroauricular gebied zorgvuldig in voorbereiding van de incisie. Gebruik een retroauricularbenadering van de bulla (lucht bevattend middenoor holte) te bereiken.
    1. Met een micro pincet voorzichtig ontleden en / of verwijderen van een deel van de nekspieren, bijvoorbeeld platysma, sternocleidomastoid en scalenes.
    2. Vinden en de bulla (Figuur 1A) bloot te leggen. Identificeer de bulla als beenderstructuur met een karakteristieke bolvorm met een ring op het bulla oppervlak dat de insertie van het trommelvlies (figuur 1A) aangeeft. Maak een gat met de punt van een insuline naald net onder de ring. Start daar Verwijder het bot dat de bulla met een fijne Rongeur (gnawer) of microforceps zodanig dat de promontorium van de cochlea is blootgesteld (Figuur 1B) omvat.
  4. Voor de cochleostomie voorzichtig afscheren de benige capsule om een klein venster te openen (cochleostomie: ~ 500-800 micrometer), en zorg ervoor dat laat onverlet de membraneuze labyrint (Figuur 1B). Voer de cochleostomie de tweede cochleairdraaien aangezien het ver genoeg van de stapediale slagader en van de top. Het openen van de apex kan breuk van het slakkenhuis met een fractuur van de modiolus produceren.
  5. Voor een ronde raam insertie van een optische vezel of μLED-implantaat scala tympani voorzichtig vergroten de ronde venster niche door krabben de benige nis met de punt van een scherpe scalpel (a baardprofiel 11 een goede optie). Gebruik altijd een nieuw mesje of scalpel. Wees zeer voorzichtig als het stapediale slagader loopt zeer dicht bij het ​​ronde venster (Figuur 1B).

3 Optische Stimulatie Met behulp van twee benaderingen

  1. Voor transcochlear stimulatie gebruik μLEDs of vezel gekoppelde laser.
    1. Monteer de capillaire dragen van de μLED op een mechanische manipulator en zorgvuldig plaats de μLED op de cochleostomie. Gebruik oABR, opgewekt door 3-10 msec lang stimulatie vanuit een stroombron (gewoonlijk 5-40 mA bij 2,7 V) 1-5 Hz, als middel om de positie en of optimaliserenientation van de μLED.
    2. Voor laser stimulatie, gebruik maken van een 473 nm continue golf laser en een 250 micrometer glasvezel (zie ook Materiaal). Koppel de glasvezelkabel aan een blauwe laser bron die ideaal biedt een snelle analoge controle van de macht (anders gebruik maken van een akoestisch-optische apparaat of een korte sluitertijd om de optische prikkel te definiëren). Met behulp van een micromanipulator, zoekt u de tip van de vezel direct op de cochleostomie en zet het daar met behulp van tandheelkundige cement (transcochlear stimulatie).
  2. Voor intracochlear stimulatie, steek de vezel door het ronde venster in de scala tympani. Maak dan gebruik van 3-10 msec laserpulsen van 10-30 mW (macht van fiber output) 1-5 Hz tot oABR ontlokken. De grote amplitude van oABR kan de experimentator om oABR opgewekt door enige stimuli op de oscilloscoop observeren optimaliseren van de positie en oriëntatie van de zender (μLED of vezel) met oABR amplitude als uitlezing.
  3. Eenmaal goed oABR zijn bereikt, zet de vezel met cyanoacrylate lijm of tandheelkundige cement en wacht tot de lijm is solide.
    OPMERKING: Het is normaal om wat vloeistof die uit de cochlea te observeren. Om echter problemen de polymerisatie van het cement te voorkomen, is het raadzaam om drogen de regio met fijne katoenen lonten.

4 Opnamen van oABR

  1. Breng de naald elektroden onder de oorschelp, op het hoekpunt en het achterblad benen en sluit ze aan de versterker.
  2. Versterken van het verschil tussen de potentiële vertex en mastoideus onderhuidse naalden. Sample met een snelheid van 50 kHz en filter (1-10.000 Hz). Zichtbaar verschil potentiaal op een oscilloscoop ideaal bij opname opstart voor het optimaliseren van de positie van de optische stimulator. Gebruik signaalmiddeling (50-1,000x) en de gegevens op te slaan op een computer voor offline analyse.

5 Opnamen van Optisch Evoked locale veldpotentialen

  1. Plaats het dier in een stereotactische frame. Behulp van een tang centrally trek de huid bovenop de schedel en voer een mediane incisie met schaar ruwweg uitstrekt van tussen de ogen om het punt waar de nekspieren hechten aan de schedel.
    1. Weerspiegelen de huid lateraal. Snijd het periost in de lengte langs de pijlnaad en verwijder hem zijwaarts door zachtjes te wrijven de blootgestelde schedelbot met een wattenstaafje.
  2. Plaats een op maat gemaakte metalen plaat op de blootgelegde schedel laat ongeveer 1 mm ruimte tussen het caudale einde van de plaat en lambda. Met een 0,7 mm diameter boor voorzichtig een gat boren in de pariëtale bot.
  3. Voorzichtig schroef in een 0,85 mm schroefdiameter - om te dienen als referentie voor potentials opgenomen van de colliculus inferior (IC) - die de schroef met een pincet, zolang de schroef niet goed vastzit. Zorgen voor een goed contact tussen de schroef en dura zonder het penetreren van de hersenen. Lijm de schroef en de metalen plaat op de schedel met cyanoacrylaat lijm.
  4. Maak de neck spieren voorzichtig van de schedel. Trek de nekspieren caudaal voor circa 1-2 mm. Identificeer de kruising van de superieure sagittale sinus (SSS) en de dwarse sinus (TS). Indien nodig, de transparantie van de schedel door het bevochtigen van de bot met fysiologische NaCl-oplossing.
    1. Identificeer de IC in muizen als liegen direct caudaal van de SSS en TS kruising. Na identificatie van de locatie van de IC langzaam en voorzichtig uitvoeren van een trepanation uitstrekkende ca. 0.5 mm rostraal tot 1,5 mm caudaal de TS en ongeveer 3 mm lateraal.
    2. Voorkom schade aan de SSS en TS als deze zou een geslaagd experiment in de weg. Hier, te testen of de trepanned bot los is geworden door zachtjes te duwen. Behulp van een tang langzaam til het been.
  5. Met een geschikte adapter sluit een multichannel array en headstage op een micromanipulator. Tot het vernietigen van de multichannel opname reeks tijdens het inbrengen in de IC te voorkomen, verwijder voorzichtig de duramet een gebogen punt van een injectienaald beginnen nabij een bot rand.
    1. Verwijder het dier uit de stereotaxische frame. Bevestig de metalen plaat op een balk om stereotaxisch fixatie blijven. Plaats de opname probe via IC en plaats onder microscopische controle zodanig dat het bovenste kanaal net zichtbaar aan het oppervlak.
  6. Amplify het verschil potentiaal tussen de afzonderlijke kanalen van de opname matrix en de verwijzing schroef in de pariëtale bot monster bij een snelheid van 32 kHz, low-pass filter (300 Hz) en opslag op een computer voor offline analyse.
  7. Alle dieren worden op humane wijze gedood aan het einde van de procedure voorafgaand aan de verdoving herstel in overeenstemming met de relevante richtlijnen euthanasie. Geschikte werkwijzen voor euthanasie kunnen cervicale dislocatie of CO2 inhalatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een optimale cochleostomie kritisch en verhoogt de kans op een succesvolle experiment. Hierdoor Venster regelmatig is klein, en er is geen schade van de interne cochleaire structuren. Bijvoorbeeld, bloeden geeft beschadiging van de stria vascularis. Een goed voorbeeld is weergegeven in figuur 1B.

Met behulp ChR2-transgene muizen, wordt ChR2 uitgedrukt in de Sgns binnen het slakkenhuis (figuur 1C). Blauw licht verlichting, hetzij door μLED of laser, lokt grote oABR, die verschillen van akoestische ABR (AABR) in amplitude en golfvorm. oABR (Figuur 1F) hebben grotere amplitudes dan AABR (figuur 1E), maar ze zijn vergelijkbaar met elektrische ABR (eABR, figuur 1G). Dit kan worden geïnterpreteerd als oABR en eABR reflecterende werving van meer Sgns en / of een meer gesynchroniseerde activering van Sgns dan voor geluid opgewekte AABR.

nt "> Om eABR ontlokken een knaagdieren elektrische CI (MED-EL) in het ronde venster is geplaatst. We gebruikten bifasestroom pulsen (80 msec faseduur, 20 msec interphase duur, 500 uA, 6 Hz stimulatie tarief) te stimuleren en het gemiddelde antwoorden 100 stimulus herhalingen. Stimulatie met 2-glas geïsoleerde wolfraamelektroden (1 binnen en 1 buiten de cochlea) is ook mogelijk.

Het is belangrijk op te merken dat oABR zijn niet detecteerbaar in wild type dieren, na remming van voltage-gated natriumkanalen of na het opofferen van de dieren 39. Deze controle-experimenten maken het verwarmen als een mechanisme dat ten grondslag optisch evoked ABR onwaarschijnlijk.

We geverifiëerd voortplanting van de activiteit door middel van de auditieve pad door extracellulaire opnames in het centrale auditieve systeem. Voor een voorbeeld, optogenetische stimulatie van het slakkenhuis ontlokte ook neurale activiteit in de auditieve middenhersenen (colliculus inferior, figuur2).

Figuur 1
Figuur 1: Chirurgische procedure, μLED voorbereiding en oABR opname (A) Opheldering van de nekspieren onthult de bulla;. Controleer deze karakteristieke bolvorm en de ring waar het trommelvlies voegt in het bot, die kan worden gebruikt als een landmark. Schaalbalk 1 mm. (B) Opening van de bulla zal de promontorium bloot. De cochleostomie uitgevoerd op het tweede cochleair turn. Andere bezienswaardigheden zijn aangegeven, waaronder de stapediale slagader. Schaalbalk 1 mm. (C) ChR2-YFP expressie in Sgns. Immunokleuring voor GFP (groen) en phalloidin-AF-568 (rood). Schaalbalk 50 micrometer. (D) μLED, bedraad maar nog niet doorgesluisd naar de capillair. Schaalbalk 1 mm. (E), (F) en (G) representatief voorbeelds van AABR (klik, 20 Hz, 80 dB), oABR (2 msec, 1 Hz, 4 mW / mm 2) geïnduceerd door LED stimulatie en eABR (900 uA, 20 Hz) via-glas geïsoleerd wolframelektroden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Single proef locale veldpotentialen opgenomen van de IC na de akoestische, optogenetische, en elektrische stimulatie van het slakkenhuis Een schematische weergave van de multichannel opname sonde wordt getrokken aan de linkerkant van elk paneel. (A) enkele presentaties van zuivere tonen met verschillende frequenties (80 dB SPL) leiden tot een duidelijk te onderscheiden verloop van de activiteit met lagere frequenties leidt tot meer oppervlakkige activering dan hogere frequenties. Deze waarneming wordt gebruikt evaluate succesvol inbrengen van de multichannel opname array naar de IC. (B) Optische stimulatie (24 mW, 6 msec) en (C) Elektrische stimulatie (bifasisch, 80 msec faseduur, 20 msec interphase duur, 500 uA) leidde ook tot lokale veld potentieel in de IC vaak met een vergelijkbaar respons amplitudes. (D) Chirurgische situs zowel IC als een deel van het cerebellum. Schaalbalk 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beschreven experimenten tonen het optogenetic stimulatie van de Sgns en kan in principe ook worden gebruikt om binnenste en / of buitenste haarcellen te stimuleren, mits de expressie van opsins. Deze experimenten vereisen veel geduld en zorg. Zoals eerder vermeld, de meest kritische stappen is een goede cochleostomie / ronde venster insertie en een geschikte positie en oriëntatie van de lichtbron.

Er zijn beperkingen met optogenetische stimulatie bij gebruik ChR2. In ons geval oABR amplitude neemt toe met de lichtintensiteit en pulsduur, maar neemt af wanneer snelheid van stimulatie verhoogt 15. Response latency ook afhankelijk lichtintensiteit afneemt wanneer de intensiteit van de stimulus toeneemt. We stellen voor dat deze reacties het gevolg zijn van de kinetiek van de ChR2 en het aantal kanalen die in de Sgns. Bovendien kunnen ChR2 extra spikes, storingen en membraanpotentiaal optelling bij hoge spike veroorzakentarieven 27,40. Er zijn voortdurende inspanningen om deze beperkingen 32,33 overwinnen. We hebben onlangs gemeld het gebruik van virus-gemedieerde expressie van de ChR2-variant val 14 in Sgns, waarbij het ​​licht verminderde behoefte en mogen spiking naar hogere stimulatie 39. Meest recentelijk de Boyden laboratorium gerapporteerd over Chronos, een channelrhodopsin met snellere kinetiek en een hoge lichtgevoeligheid 41.

Wij stellen optogenetic stimulatie van de auditieve pathway kan bijdragen tot auditieve onderzoek en in de toekomst aan cochleaire prothesen. Wij zijn van mening dat het spraakherkenning en de perceptie van prosodie en muziek kunnen verbeteren. Vertaling van deze benadering in de kliniek vereist vele kritische ontwikkelingen zoals het optimaliseren van channelrhodopsins, de ontwikkeling van meerkanaals optische stimulatie technologie voor optische cochleair implantaat en het aantonen van biologische veiligheid voor optische stimulatie en langdurige genetische manipulatie van Sgns.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (Bernstein Focus voor Neurotechnology verlenen 01GQ0810, aan T. Moser, en MED-EL Duitsland); de Duitse Stichting voor Onderzoek door het Center for Nanoscale Microscopie en Moleculaire Fysiologie van de hersenen (FZT 103, T. Moser) en via de SFB889, N. Strenzke en T. Moser).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Urethane Sigma Aldrich U2500-100G Anesthetic
Xylazine HCl RXV Sedative and analgesic
Buprenorphine Reckitt Benckiser Analgesic
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue 
Dumont #5 - Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20 Only to be used to hold soft tissue
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-09 To open the skin and help with the muscle dissection
Lempert Rongeurs  Fine Science Tools 16004-16 They are very useful to easily remove the bone from the bulla
473 nm laser  Changchun New Industries MLL-III473 100 mW solid state 473 nm laser
Laser driver  Changchun New Industries DPSSL MLL 100 mW TTL operated laser driver
250 µm optical fiber Any comercial ; e.g. Thorlabs M42L05
Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. PCAOM VIS Control the amount of light coupled into the fiber from the laser
Controller for Acousto-optical modulator Crystal Technology, Inc. 160T1-8SAR-24-0.8 Control the acousto-optic modulator
Solo2 laser power & energy meter Gentec-EO Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser
Blue µLED Cree C470UT200 It is necessary to build several μLED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough
TDT System  Tucker-Davis Technologies RZ6-A-P1 It can be used any system for stimulus generation  presentation and data acquisition
Single-shank, 16-channel silicon probe Neuronexus a1x16-5mm-100-177-CM16LP  These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use
Omnidrill World Precision Instruments 503598 Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation
Micro Drill Steel Burrs any commercial; e.g. Fine Science Tools 19007-07
Self tapping bone screw any commercial; e.g. Fine Science Tools 19010-10 Reference screw
Micromanipulator any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis Positioning of recording probe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinstein, J. T. Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development. Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).
  2. Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. Cochlear implants: the view from the brain. Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).
  3. Clark, G. M. The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).
  4. Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. Cochlear implants: system design, integration, and evaluation. IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).
  5. Wilson, B. S., Dorman, M. F. Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future. Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).
  6. Moore, D. R., Shannon, R. V. Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain. Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).
  7. Shannon, R. V. Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction. Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).
  8. Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor. Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).
  9. Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents. Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).
  10. Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli. Journal of biomedical. 12 (2), 021008 (2007).
  11. Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements. Journal of neural engineering. 8 (5), 056006 (2011).
  12. Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser. IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).
  13. Wang, H., et al. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).
  14. Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).
  15. Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants. The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).
  16. Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L). The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).
  17. Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context. Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).
  18. Zeng, F. G., et al. Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance. The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).
  19. Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking. Journal of biomedical. 16 (11), 118002 (2011).
  20. Verma, R., Guex, A. A., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hearing research. 310, 69-75 (2014).
  21. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  22. Hegemann, P., Nagel, G. From channelrhodopsins to optogenetics. EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).
  23. Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. Targeting neurons and photons for optogenetics. Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).
  24. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  25. Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels. Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).
  26. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  27. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  28. Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function. Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).
  29. Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).
  30. Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle. Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).
  31. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).
  32. Hegemann, P., Möglich, A. Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools. Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).
  33. Mattis, J., Tye, K. M., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).
  34. Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  35. Tomita, H., Sugano, E., et al. Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter. PLoS ONE. 4 (11), e7679 (2009).
  36. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  37. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).
  38. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
  39. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  40. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. Ultrafast optogenetic control. Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).
  41. Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).

Tags

Neurowetenschappen gehoor cochleair implantaat optogenetics channelrhodopsin optische stimulatie doofheid
Optogenetische stimulatie van de gehoorzenuw
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing,… More

Hernandez, V. H., Gehrt, A., Jing, Z., Hoch, G., Jeschke, M., Strenzke, N., Moser, T. Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve. J. Vis. Exp. (92), e52069, doi:10.3791/52069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter