Protocol
1，制备培养基，细胞因子和糊化板的
- 用鹰的培养基（DMEM）的贝科的修改与高糖和丙酮酸钠准备胚胎干细胞培养基。添加20％ESC合格的胎牛血清（FBS），1％青霉素/链霉素，1％L-谷氨酰胺，1％HEPES缓冲液，1％非必需氨基酸，0.1％庆大霉素（50毫克/毫升）和0.1％（ 55μM）β-巯基乙醇。经过滤消毒胚胎干细胞培养基。
- 通过根据制造商的说明制备1升阿尔法最低必需培养基（α-MEM）中从粉末制备OP9媒体。添加20％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素。颠倒混匀。经过滤消毒成2个500毫升分装。
注意：使用的由粉末制成的介质，推荐和可能产生改进的OP9细胞的维持和体外分化的结果。这种方法已经成为我们的标准程序。然而，我们也注意到塔难道我们在某些时候使用预制的液体α-MEM足够的成功。 - 制备通过加入10％二甲亚砜（DMSO）中，以90％FBS的冷冻介质。轻轻摇动，通过过滤消毒。保存在4℃。
- 通过在完整OP9介质中溶解的人类重组受体Flt-3配体（FLT-3L），以10微克/毫升制备2000倍的Flt-3配体（10微克/毫升）。分装成的1.5 ml离心管中，并储存在-80℃。按照供应商的建议对稳定性和储存。
注：FLT-3L的稳定性是短（2个月，在4℃或3个月，在-80℃）。 - 通过使用完整OP9媒体准备1000倍的IL-7（1微克/毫升）。分装成的1.5 ml离心管中，并储存在-80℃。按照稳定性和存储供应商的建议（IL-7在-80℃可稳定12个月）。
- 准备好1000倍，白血病抑制因子（LIF）（10微克/毫升）用1:10稀释10 7个单位的LIFíÑ胚胎干细胞培养基。店内分装在4℃。一定要注意通过对分装小瓶制造商提供的截止日期。
注：产品是稳定的浓缩或稀释的形式至少18自生产之日起二个月。 - 通过制备糊化6孔板中添加毫升0.1％的1.5明胶溶液成一个6孔板的每个孔中。留在无菌罩在室温下用在盖子的菜肴，使至少30分钟的涂层。菜也可以留在潮湿的培养箱中过夜。细胞接种前才取出所有剩余的明胶溶液。不要让明胶溶液完全变干的好。
2，准备工作和饲养细胞和小鼠胚胎干细胞的维护（MESC）
注：孵育在湿润的37℃培养箱中培养5％的CO 2的所有单元格。
- 解冻小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）
- 快速解冻冷冻瓶（〜5×10 6
- 添加8毫升ES细胞培养基的解冻细胞中，逐滴的方式从冷冻介质逐渐稀释的DMSO。
- 离心细胞，在400×g下在4℃下5分钟。小心取出上清液，重悬细胞沉淀在3毫升胚胎干细胞介质。
- 准备50毫升离心管用33ml预热的ES细胞介质。添加3毫升再悬浮的MEF以使终体积到36毫升
- 分发3毫升再悬浮的MEF为两个糊化的6孔板的每个孔中。将平板放入培养箱中至少6小时，以使细胞附着并摊开播种mESCs分化上之前。这些有丝分裂被捕饲养层可以是用于初始接种后几天可用的，如果其介质是每2-3天更换。
注：刚被捕的MEF也可以使用。 </ OL>
- 播种mESCs分化
- 快速解冻，在37℃水浴冻结卓制克隆小瓶并按照2.1.1-2.1.3介绍准备细胞。
注意：我们冻结2瓶卓制从6孔板的融合很好。 - 从6孔板与被捕MEF细胞单层（在步骤2.1.5的方法制备）的一个孔中（每MESC克隆）除去介质并播种3毫升mESCs分化对MEF的单层的顶端。添加3微升1000倍的LIF（10毫微克/毫升）。返回餐具放入孵化器。
- 快速解冻，在37℃水浴冻结卓制克隆小瓶并按照2.1.1-2.1.3介绍准备细胞。
- 胚胎干细胞的维护和胰蛋白酶介导的通道
注：根据卓制合流每日更换介质，或分割。理想情况下，收获和分离/重制版的隔日细胞。- 除去ES细胞培养基，并用2毫升的PBS洗涤mESCs分化。删除的PBS。加入1 ml的0.25％胰蛋白酶的孵育在37℃下进行3-5分钟。
- 胰酶消化收集细胞，并将它们转移到15ml离心管中。大力吸管将细胞悬液分手的米团块胚胎干细胞。加入2 ml完全的ES细胞培养基中的细胞悬浮液中以中和胰蛋白酶。
- 自旋细胞在400×g下5分钟，在4℃下。除去上清，重悬沉淀在3毫升的ES细胞培养基。
- 从制备的含有被捕MEF细胞单层的6孔板中取出媒体。在3ml的ES细胞培养基中加入细胞悬浮液（根据所期望的分流比）的适当量向每孔中被接种。添加3微升1000倍LIF的。一个融合卓制以及分裂1:6将准备通过2天。
- OP9 / OP9-DL1细胞维持
- 解冻OP9细胞的小瓶（按照步骤2.1.1-2.1.3使用OP9媒体）
- 添加7毫升OP9媒体10厘米组织培养皿。添加3毫升悬浮细胞中逐滴的方式，在整个板块分布的细胞。将细胞在夜间的孵化器。
- 检查OP9细胞汇合的第二天。如果菜中含有许多死细胞漂浮，字符型数据已经在媒体和加入10毫升新鲜OP9媒体。返回菜的孵化器，如果接近满汇合没有观察到。斯普利特（胰酶）1:4不久的融合OP9单层。
注：板材应在2天左右再次到达同一汇合水平。小心不要让OP9细胞变得过度融合。 - 冻结OP9细胞的早期传代的扩张股票。
注意：我们冻结2瓶OP9细胞从一个附近汇合10cm皿。扩大股票每管可以进一步传播到创建工作的股票，在卓制共培养实验后使用。保持在液氮中冷冻所有OP9股票，而不是在-80℃的冰箱中，由于温度波动可以在冻结的质量产生负面影响。
3 OP9-DL1共培养过程
- 共培养的准备
- 约前一星期共培养开始，解冻的MEF，mESCs分化和OP9细胞申通快递工作中正。由于不需要OP9-DL1细胞直至共培养8天，在此期间共培养开始后的前三天解冻OP9-DL1细胞。维持或根据需要冻结所有细胞。
- 确定为10厘米板的制备对共培养物达到80％汇合基于实验的规模0天OP9细胞单层的初始数量（ 例如 ，区分和卓制克隆的数目的共培养时间点的数目以进行分析）。为了准备共同培养，分裂近1间OP9细胞融合菜：4和1：领先时，单层，将需要6个两天。
注意：一个需要每ESC克隆至少有一个板块。典型地，一个单一ESC克隆接种于单个板（如下所述）在第0天应该产生足够的细胞播种6板在第5天通过。每天5板将使一个后续分析的时间点。 - 由于OP9单层将不断需要共同培养通道，小心总是mainta在另外的OP9培养板中以共培养并行足够数量。
- 第0天：共培养物的起始
- 收集卓制在2.3.1-2.3.4。计数细胞。
- 对于每个卓制克隆制备5×10 4卓制在10毫升每板OP9媒体。
注意：虽然我们还没有使用它，我们注意到，另一种介质组成的α-MEM，10％胎牛血清和5×10 -5 Mβ-巯基乙醇还报道了在分化的共培养物用10。 - 从OP9菜肴删除旧的媒体，并添加10毫升卓制悬液，以照顾到整个板均匀地分布在细胞的菜肴。将菜在37℃培养箱中培养。
- 第3天：媒体变革
- 从孵化器中取出菜肴，在显微镜下观察。菌落开始失去光泽，并出现变平。
- 从菜肴取出介质，轻轻地加入10毫升新鲜OP9媒体。
- 返回共培养皿于培养箱中培养。目视监视胚层样细胞集落的形成每日通知OP9馈线单层制剂的定时为下通道（第5天），这不应该被执行，直到〜菌落80-90％可视地显示中胚层样形态。在第5天细胞转移的步骤，最大延迟为2天。
- 第5天：胰蛋白酶介导的通路与预镀。
注：提前准备10厘米的菜足够数量的具有最佳融合OP9细胞。下一个步骤继续进行只有当共培养物在视觉上显示在步骤3.3.3中描述的特征（参见代表结果）。- 从共培养皿取出介质。加4毫升的PBS洗。摇动的PBS和删除。添加4毫升0.25％胰蛋白酶和放置碗碟孵化器〜5分钟。
- 破坏胰蛋白酶消化细胞活力移液层，注意不要引入过多的气泡，直到均匀，多为单细胞悬浮液来实现的。
- 添加4毫升完整OP9媒体和吹打混匀。转移细胞进入一个新的，空的10cm平皿并置于培养箱中30分钟，以允许OP9细胞附着在培养皿中。这种“预镀”步骤减小转移到共培养物中的下一个步骤OP9细胞的数目。
- 准备50ml离心管中有40微米的细胞过滤器。
- 收集非贴壁细胞从预镀盘，并通过细胞过滤器进入管传递它们。 6毫升的PBS轻轻洗的菜，并通过相同的过滤器通过它，而使附着OP9细胞落后。
- 离心细胞，在400×g下5分钟，在4℃下。除去上清液，重悬细胞沉淀在3毫升完整OP9媒体。计数细胞。
- 从10厘米板的最佳融合OP9细胞中取出介质。
- 对于每个分析时间点，种子5×10 5个细胞在OP9单层在10毫升的最终体积。
- 加入5毫微克/毫升重组人FLT-3L和放置碗碟的孵化器。
- 第8天：造血祖细胞（HPC）的集合
注：在时间提前准备的6孔板与OP9或OP9-DL1细胞单层有足够数量，以便它们将〜80％汇合的这一步。- 准备50ml离心管中有40微米的过滤器。
- 从孵化器中取出菜肴，在显微镜下观察。高性能计算机的闪亮集群应该被松散地连接到OP9单层。收集尽可能多的这些细胞成为可能通过洗涤（但不是过度破坏）的OP9单层用吸管和菜的现有媒体。为了防止起泡，总是留下至少为1毫升介质中的移液管的尖端的这段HPC收集/洗涤步骤。
- 通过40微米过滤的细胞成管。加入8毫升的PBS以相同的板和显微镜下检查是否所有的HPC我们重新收集。更有力的洗涤重复用PBS洗涤/采集步骤和（如有必要）。菌株的细胞分化成已含有从同一平板上的细胞的试管中。
- 离心细胞，在400×g下5分钟，在4℃下。
- 制备的3毫升主混合物（每平板接种在第5天）OP9媒体与5毫微克/毫升的Flt-3L和1纳克/毫升的IL-7。
- 在OP9媒体FLT-3L + IL-7预混液中取出上清液，重悬沉淀（3毫升处理的每个10cm皿）。从各板传送所收集的细胞于6孔板与OP9细胞的一个孔。
- 为了驱动细胞向单核细胞，B细胞或红细胞谱系的种子收集的细胞上OP9细胞。为了得到T细胞，种子细胞到OP9-DL1细胞单层。
- 将6孔板进入培养箱。
- 10日：媒体变革
- 准备15毫升离心管中每个不同的MESC克隆饲养细胞型combina灰中共同培养。
- 准备OP9媒体的主结构与FLT-3L为5毫微克/毫升和IL-7的1纳克/毫升。制备3毫升为每个孔中。
- 轻轻收集介质从6孔培养板从含有相同的ESC克隆饲养细胞类型组合多口井相结合的媒体的每个孔中。
- 加入2mL OP9媒体主结构（参见3.6.2节）到每口井。
- 离心机在400×g下5分钟，在4℃下将收集的介质。除去上清，悬浮最初收集步骤3.6.3每片（非常小的，如果可见）在1毫升OP9媒体主结构（参见3.6.2节）每口井。
- 分发1毫升细胞放回各孔最初从中收集的媒体带来的体积在各孔中至3ml。返回菜的孵化器。
- 12日：无胰蛋白酶通道
注：提前准备的6孔盘与OP9或OP9-DL1细胞提供足够数量，使他们以最佳汇合的时候这个STEP。 12日是理想的流式细胞仪开发红细胞，单核细胞和早期T细胞的分析。- 制备主混合物（3毫升每孔中，将在共培养继续）OP9媒体与受体Flt-3L的5纳克/毫升和IL-7的1纳克/毫升。
- 制备的50ml离心管中以40微米的过滤器（一个用于在共培养每个ESC克隆饲养细胞类型的组合）。
- 大力吸取现有媒体在每个孔中，以分解所有细胞（包括单分子层）中的井。继续有力吹打，直至状态类似于单细胞悬液的实现。
- 通过过滤器进入管程将收集的细胞。加入3毫升的PBS到每口井洗并收集所有剩余的细胞。通过相同的过滤器通过细胞。从含有相同的ESC克隆饲养细胞组合型多井组合的细胞。
- 丢弃使用过的细胞过滤和除去等分试样相当于一个阱（〜6ml）中的任何期望的流式细胞仪（或其它）分析，以进行在该日。在使用之前储存在冰这些等份。
- 离心细胞，在400×g下5分钟，在4℃下。取出上清液。重悬在50ml离心管中的沉淀物在3ml每孔预混重新播种。每增加每个细胞悬液以及3毫升到适当的饲养细胞类型，然后将菜在孵化器。
- 第14天：媒体变革
- 按照3.6节所述的步骤。
- 第16天：没有胰蛋白酶通道
注意：预先准备最佳汇合OP9或OP9-DL1细胞的6孔培养皿中用于此步骤。
注意：16天是理想的流式细胞术分析的B淋巴细胞和中间阶段的T细胞。- 按照3.7节所述的步骤。
- 18日：媒体变革
- 按照3.6节所述的步骤。
- 第20天：没有胰蛋白酶通道
注：当日20 IŠ理想的流式细胞仪的中期分析到后期开发的T细胞。- 按照3.7节所述的步骤。如果需要的话，进行分化细胞过去20天的交替介质变化和没有胰蛋白酶通路每隔两天，每天监测淋巴细胞膨胀率。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
当在LIF存在下生长在MEF中，mESCs分化可以保持在未分化状态。在理想条件下，它们显示为细胞通过一个闪亮卤素在相差显微镜包围的紧凑集落（ 图1）。这些培养物必须每天监测。根据细胞的汇合，媒体可以被改变或细胞可以分裂。相邻卓制菌落不应该来彼此接触的点。未分化mESCs分化的正常，健康的文化是一个重要的起点， 在体外 T细胞分化。在起始的共培养，则建议的细胞是没有被拥挤完全汇合。这是为了让广大收获细胞用于细胞接种到OP9单层是卓制（而不是饲养细胞）。如果汇合重大差异的各种卓制克隆在第0天相鉴别中观察到，那么这将是最好的前坚持那朵删除的MEF告培养皿（如在使用完整的ES细胞培养基步骤3.4.3-3.4.6）计数mESCs分化为共培养物接种之前。
OP9细胞必须事先进行很好的维护了共同培养开始（如2.4节所述）。此外，可以认为，OP9细胞失去它们的一些属性与长期培养和/或显着增加，它们的扩散速率7避免超出1分流比：5的维修OP9细胞中，并在六周后丢弃连续OP9文化，将有助于避免这些缺陷。
在最初细胞接种和细胞转移步骤的共培养物（0天，5 8，12，16），OP9细胞单层应当合流的最佳范围内， 图2示出了低的（ 图2A）和高（ 图2B）的OP9细胞汇合可取用作共培养细胞单层的范围的结束。过集流板的一个实例示于图URE 2C。不能保持最佳合流可能诱发形成脂肪细胞（ 图2D），在大量的，可带负共培养影响。
在第0天，在共培养开始于OP9细胞而非OP9-DL1细胞自中胚层的形成是有利的OP9细胞。将细胞接种在OP9-DL1细胞单层开始第8天，以诱导T细胞的生产。而一些卓制克隆将可视地显示健壮和定量的（〜90％）通过共培养（ 图3A-B）的第5天形成胚样集落，他人可以显示延迟在这个步骤（ 图3C-F）。在显微镜下，来自在该测定中的中胚层样集落已被可变地描述为类似于货车车轮或缩孔（ 图4A），或星爆或小花（ 图4B）。
同时公布的OP9-DL1的协议反映了量化预估中胚层的规范灰通过共培养的第5天，第7，我们发现，并非所有的ESC克隆达到这个时间帧之内的常态。在这些情况下，我们改变了在第5天的培养基中，并等待额外的1-2天进行的“5天”细胞的收获/传输协议之前。此延迟的目的是为了让〜的ES细胞集落的80％-90％，以在视觉上成为胚层之前传送。明确指出，这80％-90％的数字反映了一个严格的视觉标准可辨别通过菌落形态在共培养皿简单相衬显微镜检查是很重要的。它仅仅是指ESC集落所类似的图4中所示的比例，这是可能的，一些ESC克隆不会达到这个视觉标准，即使经过2天的延迟。在这样的情况下，能够以丰富的使用流式细胞仪的细胞的血液形成中胚层前体的Flk-1 +细胞分选，如先前已描述的。6,11在任何情况下，为sa的命名方便珂，我们“重设时钟”，并指中胚层样菌落转移的一天，“5天”
当多个ESC克隆正在分化的平行，这是可能的，一些共培养将准备的第5天通路上的时间，而另一些滞后。在这种情况下，最好是延迟所有的共培养物的通道，直到较慢的克隆赶上别人。延迟似乎没有尽到“准时”联合培养什么伤害，但有利于较慢克隆了大量的后续分化。
8日（ 即中胚层细胞集落转移三天后）认为高性能计算机的出现和蓄积。高性能计算机是作为光泽细胞簇被松散地附着到OP9饲养细胞（ 图5）中可见。仔细洗涤过程中，使用移液管和上盘的介质，将分离和收集的高性能计算机，同时留下在OP9单层大多完好（ 图6A-C）。这也许是该协议的技术最为敏感的一步。这需要一些练习来找到相应的运动和媒体的喷射压力达到高性能计算机的最大收获与饲养层的干扰最小的理想平衡。它是可以接受的，如果一些OP9单层的升空，由于大多数的任何杂散单层将在40微米尼龙网被捕获后滤波。 图6D示出了过度的移液导致比需要更大的单层中断后的单层。在此洗涤步骤中，重要的是要检查显微镜是否所有的高性能计算机已收集下，并相应地调整洗涤压力。
共培养的进展可以通过流式细胞术来监测。具体分析ESC的非红系造血后代，重要的是要在活的CD45 +细胞的第一栅极。这个步骤筛选出从分析的OP9细胞，同时用DAPI或其他核染色染料使无活力的细胞的排斥。经12天，许多集群小，圆形，有光泽的细胞应该是可见的。这是没有必要进行计数的细胞在此阶段。但我们已经观察到活，门控流式细胞事件计数通常是在1-3×10 5个每12天共培养的范围很好。流式细胞仪分析分化的OP9单层将产生红活门控细胞（CD45 负 ，TER119 +）和单核细胞（CD45 +，CD11b的喜 ）血统（ 图7A）的。现场，CD45 +细胞分化的OP9-DL1单层应揭露标记的CD4 + / CD8 +双负特性分析（DN）-1（CD44 +，CD25负 ， 负的CD4，CD8 负 ）和DN2（CD44 +，CD25 +， CD4 负 ，CD8 + 负 ）阶段的T细胞（ 图7B NG>）。通过16天，存在于小的，圆的，有光泽的细胞在培养物的量的显著增加。在OP9-DL1s，T细胞分化产品进步的DN3（NEG CD44，CD25 +，CD4负 ，CD8 + 负 ）和DN4（NEG CD44，CD25 负 ， 负的CD4，CD8 NEG）阶段。一些DP（CD4 +，CD8 +）T细胞也可以开始出现由16天（ 图7B）。高性能计算机接种在OP9细胞，得到B细胞（CD19 +）的第16天通过的OP9-DL1-卓制共培养20天，将有大量的DP T细胞和单阳性（SP）本CD8 + T细胞的（ 图7B）。图8提供的图总结了上述过程的关键步骤，并且在共培养所建议的分析时间点。
ghres.jpg“/>
图1相差显微镜分化mESCs分化（锐边殖民地）在MEF单层（放大100倍）的顶部越来越多的形象。
图2：的OP9单层汇合相衬显微镜图像（A）的最低和（B）的最高汇合水平宜为共培养通道/播种（40X放大倍率）的过汇合OP9单层（40X放大倍率（C）的实施例。 ）（D）过汇合OP9单层（放大200倍）与脂肪细胞形成（大，小泡含有细胞）。
图3：相衬microscop中胚层样集落形成的共同文化的“5天”Y图像（A）40X和（B）100X意见，共同培养板> 90％群体中胚层分化。这些板块都准备好一天5通道。需要转移前（C和E，40倍的放大倍率，D＆F，放大100倍）1-2天推迟5天共培养板（CF）的例子。
图4：在各种中胚层样细胞集落形成的，在共培养的第5天相衬显微镜图像（A）中称为“火山口”或菌落形态（B）中所提到的菌落形态。“车轮”。作为“星爆”或“小花”（放大200倍）。
图5相衬显微镜8天共培养板的图像小，圆形，有光泽的HPC集群上的OP9单层（放大40倍）。
图6：在共培养8天高性能计算机采集后OP9单层（AC）经过仔细清洗收获的HPC OP9单层中断适当的范围内（D）的OP9单层的例子已经被过度破坏的一天8 HPC收获的过程。
图7：具有代表性流式细胞术（FACS）中，在特定的时间点进行分析卓制分化的影响。 （A）的染色为红（左），单核细胞（中）和B细胞（右）MESC-OP9共培养的产品在12天或16所示，（B）染色用于在指定的时间点显影性T细胞MESC-OP9-DL1共培养。请参阅文本免疫表型的详细说明。
图8框图的MESC-OP9共培养过程的步骤：（A）首八天共培养的关键细胞转移的步骤。细胞接种在OP9细胞在天0-5来表示的近似数（B）的第8天转印步骤和流式细胞术，在共培养的关键时间点由流量检测的预期细胞分化的产品。请参阅文本免疫表型的详细说明。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在OP9-DL1共培养系统已经利用血细胞类型的干细胞在发育过程中，研究了不同的基因产物的作用。8,12,13这也证明研究的基因调节DNA的功能的有效模式9,14中的细胞分化。使用这种方法作为一种替代整个小鼠模型所用的时间和实验，解决在造血许多基本问题，成本得到相当大的节约。然而，该协议用于这些目的的适应性要求，将在这些过程中使用卓制克隆中的电位变化的认定。公布协议的时间表是由平均预期的，保养得很好，不操纵卓制线。7此外，入选嵌合体小鼠的产生卓制的克隆通常是高品质的，并会在OP9共培养表现非常强劲。另一方面，卓制克隆直接从稳定的新兴转染与异位整合的转基因会显示不同程度的初步分化的效率从平均低于平均水平。这里所描述的协议提供之日起五道工序的战略性1-2天的延迟，以拉平之前，造血诱导体外培养这些潜在差异。
当日8通道是此协议的执行有最潜在的错误的步骤。耐心，实践和仔细观察就会使一个开发出优化的HPC收获，同时尽量减少OP9单层干扰的技术。超越键天5和第8天的步骤中，重要参数涉及细致细胞培养物保养（尤其OP9细胞，如上文所述），并特别注意在协议中使用的试剂。最关键的试剂是胎牛血清。不同的地段FBS将在其支持这个过程的能力差别很大。多个批次必须在O测试rder，以确定这将产生强大的分化在该测定。
该共培养系统有它的局限性。例如，这种模式不支持单阳性的CD4细胞的分化。其中一个原因是缺乏在OP9细胞的主要组织相容性复合体（MHC）II类抗原呈递的基础设施中的表达。需要CD4 + SP细胞的正常发育抗原的MHC II型1细胞表面展示。在CD8 + SP细胞的出现做代表成熟和未成熟的CD8 SP胸腺细胞阶段的混合。1此外，卓制成功移植的T细胞祖细胞到小鼠体内，需要通过胚胎胸腺器官培养前通过。1不过，这项技术已经证明了它承诺作为一个强大的调查方法，在血液和免疫系统发育细胞和分子的问题，以前只能在V探索龙腾。因此，除了提供了一种新的方法，使这些问题更加迅速的进展，更广泛地采用了OP9-ESC共培养体系将有减少使用实验动物的更广泛的影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Stem cell qualified FBS | Gemini | 100-125 | Heat inactivated |
| Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| L-alanyl L-glutamine | Corning | 25-015-CI | |
| HEPES buffer | Millipore | TMS-003-C | |
| Non-Essential Amino Acids | ThermoScientific | SH30853.01 | |
| Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml) | Life Technologies | 15750-060 | |
| β-mercaptoethanol (55 mM) in DPBS | Life Technologies | 21985-023 | |
| Filter Unit | Millipore | SCGPU05RE | 0.22 μm PES membrane |
| Cell Culture Grade Water | Corning | 25-055-CM | |
| α-MEM | Life Technologies | 12000-022 | Powder, reconstitute per manufacture recommendation |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| FBS | ThermoScientific | SH 30396.03 | Testing of individual lots required |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma | D2650 | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand | R&D Systems | 308-FK | |
| Recombinant Murine IL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | |
| Utrapure water with 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| MEFs mitomycin C treated | Millipore | PMEF-CF | Any mitotically arresteded MEFs can be used |
| DPBS | Corning | 21-031-CV | |
| Cell strainer (40 μm) | Fisher | 22363547 | |
| Tissue culture dish 100 x 20 mm | BD Falcon | 353003 | |
| Multiwell 6-well | BD Falcon | 353046 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | Tubes for FACS |
| ES R1 cells | ATCC | SCRC-1011 | |
| OP9 cells | Cells can be obtained from the Riken Laboratory Cell Repository (Japan). | ||
| OP9-DL1 cells | Cells can be requested from the Zúñiga-Pflücker laboratory. | ||
| FlowJo software | Tree Star | FACS data analyses | |
| Flow Cytometer | BD | FACScan, FACSCalibur and FACSVantage have been used in our lab |
References
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
- Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
- de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
- Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
- Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
- Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
- Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
- de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
- Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
- Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).
