Dérivation des cellules T In Vitro De la souris les cellules souches embryonnaires

Résumé

Les cellules souches embryonnaires de souris peuvent être différenciées en cellules T in vitro à l’aide du système de co-culture OP9-DL1. Le succès de cette procédure nécessite une attention particulière à l’entretien des réactifs/cellules et des étapes clés sensibles à la technique. Nous discutons ici de ces paramètres critiques et fournissons un protocole détaillé pour encourager l’adoption de cette technologie.

Résumé

Le système de co-culture OP9/OP9-DL1 est devenu une méthode bien établie pour dériver des types de cellules sanguines différenciées à partir de progéniteurs embryonnaires et hématopoïétiques d’origine souris et humaine. Il est maintenant utilisé pour répondre à une variété croissante de questions génétiques, cellulaires et moléculaires complexes liées à l’hématopoïèse, et est à la pointe des efforts visant à traduire ces résultats fondamentaux en applications thérapeutiques. Les procédures sont simples et donnent régulièrement des résultats solides. Cependant, la réussite de la différenciation hématopoïétique in vitro nécessite une attention particulière aux détails de la maintenance des réactifs et des cultures cellulaires. De plus, le protocole comporte des étapes sensibles à la technique qui, bien que non difficiles, nécessitent du soin et de la pratique à maîtriser. Nous nous concentrons ici sur les procédures de différenciation des lymphocytes T à partir de cellules souches embryonnaires de souris (CSEm). Nous fournissons un protocole détaillé avec des discussions sur les étapes et les paramètres critiques qui permettent une différenciation cellulaire robuste et reproductible in vitro. Il est dans l’intérêt du domaine d’envisager une adoption plus large de cette technologie, car elle a le potentiel de réduire l’utilisation des animaux, d’en réduire les coûts et de raccourcir les délais d’expérimentation fondamentale et translationnelle.

Introduction

Un système de culture cellulaire a été établi dans lequel les cellules souches embryonnaires de souris (mESC) sont différenciées en cellules T in vitro.¹ Ce système exploite la capacité de la signalisation Notch à piloter la différenciation des lymphocytes T. ² La lignée cellulaire OP9-DL1 a été créée en transduisant des cellules OP9³ dérivées de la moelle osseuse avec un ligand Notch, Delta-like 1 (DL1). ⁴ L’activation de la cascade de signalisation Notch in vitro facilite le développement des lymphocytes T à l’exclusion d’autres lignées cellulaires. Avec l’inclusion de cytokines appropriées, ce système fo....

Protocole

1 Préparation de milieux de culture, cytokines et plaques GELATINISE

1. Préparer support de cellules ES en utilisant la modification de Dulbecco du milieu de Eagle (DMEM) avec l'hyperglycémie et du pyruvate de sodium. Ajouter 20% ESC Qualifié de sérum bovin fœtal (FBS), 1% pénicilline / streptomycine, 1% de L-glutamine, 1% tampon HEPES, acides aminés 1% non essentiels, 0,1% de gentamicine (50 mg / ml) et 0,1% ( 55 pM) β-mercaptoéthanol. Stériliser les médias de cellules ES par filtration.
2. Préparation de supports en faisant OP9 1 L de milieu essentiel minimum alpha (α-MEM) de poudre selon les instructions du fabricant. Ajouter 20% de sérum bovin ....

Résultats

Lorsqu'il est cultivé sur MEF en présence de LIF, mESCs peuvent être maintenues dans un état indifférencié. Dans des conditions idéales, ils apparaissent sous forme de colonies compactes de cellules entourées par un halo lumineux en microscopie à contraste de phase (figure 1). Ces cultures doivent être contrôlés quotidiennement. Selon la confluence des cellules, les médias peuvent être modifiés ou cellules peuvent être divisées. Voisins colonies de Mesc ne doivent pas venir au point de contact avec l'au.......

Discussion

Le système OP9-DL1 co-culture a été utilisée pour étudier le rôle des différents produits de gènes au cours du développement de types de cellules sanguines à partir de cellules souches. ^8,12,13 Il s'est également avéré un modèle efficace pour étudier la fonction de l'ADN de régulation de gènes cours de la différenciation cellulaire ^9,14. Grâce à cette approche comme une alternative aux modèles entiers de la souris peut produire des économies considérables en temps et en coût d'expérienc.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Corning	15-013-CV
Cellules souches qualifiées FBS	Gemini	100-125
Pénicilline/Streptomycine	Corning	30-002-CI
L-alanyl L-glutamine	Corning	25-015-CI
Tampon HEPES  ;	Millipore	TMS-003-C
Acides aminés non essentiels	ThermoScientific	SH30853.01
Gentamicin Regent Solution (50 mg/ml)	Life Technologies  ;	15750-060
bêta ;-mercaptoéthanol (55 mM) dans DPBS	Life Technologies  ;	21985-023
Unité de filtration	Millipore	SCGPU05RE	0.22 &mu ; m membrane PES
Eau de qualité culture cellulaire	Corning	25-055-CM&
alpha ;-MEM  ;	Technologies de la vie  ;	12000-022	Poudre, reconstituée selon les recommandations du fabricant
Bicarbonate de sodium  ;	Sigma	S5761-500G
FBS	ThermoScientific	SH 30396.03	Test de lots individuels requis  ;
Sulfoxyde de diméthyle  ;	Sigma	D2650
Ligand humain recombinant Flt-3 R	& D Systems	308-FK
Souris recombinante IL-7	PeproTech	217-17
LIF  ;	Millipore	ESG1107
Utrapure eau avec 0,1 % de gélatine	Millipore	ES-006-B
MEF traités à la mitomycine C	Millipore	PMEF-CF	Tous les MEF arrêtés par mitotique peuvent être utilisés
DPBS	Corning	21-031-CV
Filtre à cellules (40 &mu ; m)	Fisher	22363547
Boîte de culture tissulaire 100 x 20 mm	BD Falcon	353003
Multipuits 6 puits	BD Falcon 353046
1,5 ml microtubes à centrifuger	USA Scientific	1615-5500
Tubes à centrifuger de 15 ml	BD Falcon	352096
50 ml Tubes à centrifuger	BD Falcon	352070
Tube en polystyrène à fond rond de 5 ml avec capuchon de filtre cellulaire	BD Falcon	352235	Tubes pour FACS  ;
Cellules ES R1	Cellules
OP9	Les cellules peuvent être obtenues à partir du Riken Laboratory Cell Repository (Japon).
Cellules OP9-DL1	;   ;   ;   ;		Les cellules peuvent être demandées auprès du Zú ; ñ ; iga-Pflü ; Laboratoire Cker.
Logiciel FlowJo  ;	analyses de données Tree	Star
Cytomètre	en flux BD		FACScan, FACSCalibur et FACSVantage ont été utilisés dans notre laboratoire

inactivées par la chaleur & ATCC SCRC-1011 Les FACS