Summary
ここでは、器官型スライス培養技術を用いて海馬の出生後の神経新生を研究するための技術が記載されている。この方法では、成人の神経新生のin vitro操作を可能にし、培養海馬への薬理学的薬剤の直接適用することができます。
Abstract
ここでは、器官型スライス培養技術を用いて齧歯類の脳内の海馬出生後の神経新生を研究するための技術が記載されている。開発海馬歯状回への薬理学的薬剤の直接適用を可能にしながらこの方法では、海馬の特徴的地形形態を維持します。さらに、スライス培養は、最大4週間維持することができ、したがって、一つは新生児顆粒ニューロンの成熟過程を研究することを可能にする。そのような海馬の深い解剖学的位置だけでなく、血液脳関門に関連する不確実性などの複雑な変数を除外してスライス培養は、海馬スライスの効率的な薬理学的操作を可能にします。これらの理由から、我々は、出生後の神経新生の研究のために特異的器官切片培養を最適化しようとした。
Protocol
注：すべての動物の手順は、トロント大学の比較医学部の動物の健康と福祉のガイドラインに適合。
海馬スライスの調製
- 125℃で乾燥したオートクレーブを用いて、以下の機器を滅菌：メスハンドル（＃3）（2）、標準パターン鉗子、大（1）、小切開はさみ（左右に角度を付け）（1）、マイクロスプーン（スプーンとフラットスパチュラ端）（1）、丸みを帯びたマイクロスパチュラ（およびテーパ端部を四捨五入）（2）、ファイン絵筆（1）、火災研磨パスツールピペット（2）は、ガーゼ正方形、2×2インチ（5）。
- 場合には、滅菌、無菌の容器に器具を入れ、使用するまで覆われ続ける。すぐに解剖する前に、70％エタノール溶液中で楽器を浸す。
- 35°C aでインキュベーター中でプレートをウエル/培養培地1mlを添加し、記憶することによって切開手順を開始する前に、培養インサートを6ウェル培養プレートを準備しND 5％CO 2。
2.無菌層流フード中で解剖ツールを配置
- 70％エタノールで層流フードをスプレーし、アルコールから滅菌解剖器具を取り外します。アルコールと解剖脳組織との接触を避けるために、無菌のペトリ皿に載っている間楽器が乾燥することができます。
- 2つの大きな滅菌ペトリ皿で滅菌氷冷解剖溶液の堆積物5-7ミリリットル。一皿は、寒さと頭（汚い）、冷却とえぐら脳（クリーン）をすすぐための他の1をきれいにします。脳を解剖用シャーレのふたの1で滅菌ろ紙を置きます。
- 海馬を解剖するための小さなペトリ皿のふたの一つに小さな、滅菌ろ紙を置きます。 2小さな、滅菌ペトリ皿中の滅菌氷冷解剖溶液の堆積物3-5ミリリットル。一皿は1つが、海馬のセクションの分離中のセクションを保持する、えぐら海馬を開催します解剖顕微鏡下。
- 切削ステージに滅菌ろ紙の一部をテーピングし、滅菌カミソリの刃を装着することにより組織チョッパーを準備します。滅菌解剖溶液とろ紙を湿ら。
- アルコールできれいなバイオバッグをスプレーし、層流クリーンベンチに入れてください。
3.海馬解剖
- 層流クリーンベンチ外の70％エタノールとP7のSprague Dawleyラット子犬をスプレーし、すぐに層流ベンチの内側に大型無菌の外科用ハサミを用いて動物を首を切る。頭がペトリ皿の1中の氷冷解剖ソリューションにドロップしてみましょう。
- ペトリ皿に、血を洗い流し、すぐに滅菌ろ紙、腹側を下に頭を転送する。
- メスを用いて、下にある頭蓋を露出させるように矢状面内の背側表面に沿って切断する。 Tのラットで柔らかく、容易に貫通可能で、基礎となる骨、皮膚を通してカットではなく、彼の年齢。さておき、この "汚い"メスを設定し、脳組織には使用しないでください。
- 小さな切開（側に傾斜し）はさみや鉗子を使用して、ブレグマに頭蓋骨の矢状縫合に沿って頭蓋骨を開き、冠状縫合を矢状縫合によって垂直に交差する頭蓋骨上の解剖学的な点をカット。頭蓋骨の正中線から持ち上げて頭蓋骨フラップを引っ張って鉗子を使用してください。
- そっと頭蓋骨から脳を持ち上げるために、脳幹の下に、脳の下側にマイクロスプーンを置きます。脳の基底面に視神経と嗅球を露出するために脳を持ち上げます。完全に頭蓋骨から脳を分離するために、小さなハサミでこれらの構造をカット。取り外し、氷冷解剖溶液を含む他の大きなペトリ皿に無傷の脳を転送する。
- マイクロスプーンを使用して、無菌のろ紙を含む小さなペトリ皿の蓋に脳を転送する。無菌のパスツールピペットを用いて、DIS数滴の脳をすすぐ湿った組織を維持するためのソリューションをsecting。
- 「クリーン」なメスの刃を使用して、離れて2半球を切った。マイクロスプーンでバック大型シャーレに左半球を転送し、その後の使用のための氷冷解剖溶液に半球PIA側を下に置きます。
- 右半球の内側の顔を見るとエッジ円蓋、海馬の内側縁に沿って白質の顕著なバンドを特定する。滅菌メスを使用すると、円蓋の矢状カットを作るが、メス先端のわずか0.5センチ円蓋をカットするのに十分であるので、注意してください。
- 2マイクロスパチュラを使用して、脳幹に右手へらを配置し、左側のヘラで上を覆う皮質を持ち上げて右半球からの第1の海馬を削除します。静かに海馬の側脳室および内側の表面が露出する皮質を持ち上げます。白い曲線、采は、表示されるようになるはずです。
- CURVAとへらの曲率を合わせます采のトゥーレと優しく采下にへらを押してください。左のヘラをスライドさせ、吻側 - 尾側軸に沿って乗って、次に海馬を削除するには、背側方向にへらを持ち上げる。
- 氷のように冷たい解剖溶液と第 2小ペトリ皿に海馬を転送します。左海馬を削除するには左半球で同じ手順を繰り返します。
- マイクロスパチュラを使用して、慎重に組織チョッパーステージに海馬を転送する。チョッパーブレードの軸に対して互いに垂直それらを隣接して平行に配置する。組織を置き、海馬の上に解剖ソリューションの数滴を追加するために絵筆を使用してください。
- 個々のスライスを削除するには一時停止することなく400μmの切片で組織を切断する（通常、彼らは、ブレードに付着しない）。全海馬が切断された後、穏やかに解離溶液と第 2小ペトリ皿にセクションを転送するために絵筆を使用。
- 広告の下で顕微鏡をissecting、慎重にamicro-へらと絵筆を使用して浮動スライスを分離する。
- 層流フード内インキュベーターと場所からカルチャーインサートが事前に準備された培養プレートを外します。
- ファイアーポリッシュパスツールピペットを用いて、カルチャーインサート膜の頂端表面にピペットと転送スライスに4-5スライスを描く。次に、絵筆を持つ位置を調整し、個々のセクションと文化インサートの境界線間にスペースを入れてください。
- 無菌のパスツールピペットを用いて、膜の頂端表面から余分な解剖溶液を除去する。
注：ピペットに組織切片を描画ソリューションの回避を除去しながら。代わりに、ゆっくりと溶液を除去するために滅菌ピペットチップとの定期的なピペット（P200またはP1000）を使用します。 - 血清含有培地と35℃のバックインキュベーターに海馬スライスし、5％CO 2で培養プレートを置きます。
注：実験呼び出す場合複数の動物からの文化を生成するために、徹底的に解剖の間に層流クリーンベンチをきれいに。アルコール溶液に楽器を戻し、すべてのペトリディッシュ、ろ紙及び第二解剖前に無菌のかみそりの刃を交換してください。
4.供給および器官型スライスを維持
- 無菌層流クリーンベンチ内の文化を養う。
- 培養されたセクションの最初の給餌2日後に解剖を行います。滅菌したガラスピペットを用いて吸引し、古い培地。
- ウェルに新鮮な、無菌の、血清含有培地の1ミリリットルを追加するために、滅菌5ミリリットルの血清学的ピペットを使用してください。
- 静かにカルチャーインサートを交換し、膜表面の下に形成された可能性のある気泡を除去するように注意してください。
- 最初の給餌の後、一日おきに培地を変更します。
新生ニューロンをラベルにチミジン類似体5.インキュベート組織スライス
- 研究するために海馬の歯状回顆粒細胞の成熟と統合は、そのようなブロモデオキシウリジン（BrdU）のまたはChlorodeoxyuridine（CldU）などのチミジン類似体と器官のスライスを、インキュベートする。ここでは、あるため、生理食塩水での高い溶解度のCldUを使用しています。
- 3DIVした後、10μg/ mlの最終濃度のために培地を1mlの生理食塩水中の10mg / mlのCldUストック溶液1μlを加える。 BrdUを使用する場合は、分子量の差についての濃度を補正する。培養ウェルにCldUとメディアを追加し、35℃で2時間CldU含有培地で組織をインキュベートする。
- 35℃でのインキュベーションの2時間後、CldU含有培地を除去し、（上記に概説）通常の給餌スケジュールを再開するために定期的に送り媒体と交換してください。
6.組織固定およびストレージ
- 治療を適用し、培養実験（図2B）を起動する前に、組織試料を固定するためのタイムラインを確立する。 <所定の日後の切開で李>は、実験室のドラフト内で次の準備：10〜50ミリリットルのビーカーに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を含有する。廃棄された培養液のための空のビーカー。小さな鉗子。使い捨てチップとし、千ミリリットルピペット。
- インキュベーションチャンバーから培養プレート（S）を取り外し、ヒュームフードに転送。ピンセットで個々のウェルプレートインサートを傾けます。次に、廃棄ビーカーに、培養培地と転送を削除するには、ピペットを使用しています。全ての培地を除去していることを確認するために角度を培養プレートを傾ける。
- 一度に1つの培養プレート用媒体を除去完了します。培地が除去されたときに、各培養ウェルに4％PFAを1mlを追加し、パラフィルムでプレートウェルシールする。 24時間4℃の冷蔵庫に必要な、転送プレートと同じ数の培養プレートのために繰り返します。
- 24時間後、ヒュームフードに次のように準備します。10-50 PBS中の0.1％アジ化ナトリウムを含むミリリットルビーカー。空の廃棄されたPFA（有害物質を廃棄する際に安全上の注意に従ってください）用のビーカー。小さな鉗子。使い捨てチップとし、千ミリリットルピペット。
- PFAを追加するための6.4で説明する手順に従いますが、その代わりにアジ化ナトリウムを含むPBSの1ミリリットルを追加します。一度完全にパラフィルムのエッジをラップし、4℃の冷蔵庫に保存することによって、将来の使用のためのシールウェルプレートに移した。
7.免疫組織化学のための組織をセクショニング
- ビブラトームを使用して切片組織を実行します。以下の一連の工程は、器官培養物から使用可能な組織切片の収率を最大限に高める。
注：直ちに海馬解剖とスライスのメッキ以下では、組織は、約400μmの厚さを有している。しかし、インキュベーションチャンバー内の2〜3週間後に、組織切片は、150〜300ミクロンの最後のセクションの厚さで、その結果、平らにし始めます。 - ＃11メスB：セクション培養組織に以下の項目を準備クレード、ハンドル、氷冷PBS、マイクロ解剖鉗子、および組織をマウントする段階をカットクリーンビブラトームを含むガラスシャーレ。
- それはプラスチック製インサートハウジングから取り外すことができるように、外科用メスで慎重に円形インサート膜の周囲に沿って切断する。培養されたスライスと、メスの間に十分なスペースを入れてください。
- PBSを含むペトリ皿に切り離され、インサートメンブレンを転送します。 PBSですすいだ後、ビブラトーム取り付けステージに膜を転送するために鉗子を使用しています。
- 次に、培養されたスライスを囲む過剰膜を除去し、クリーンなエッジを作成するために余分な材料を切り取るためにメスを使用しています。このステップでは、膜は平坦であり、容易に切断面に付着することが確実になる。
- ビブラトーム切削ステージ上に接着剤の1-2滴を置き、さらには22 G針を使用して層内に広がった。ビブラトームの切断刃に長辺と平行な矩形状に接着剤を広げた。このステップを実行しますすぐに、乾燥からの接着を防止する。
- 切削ステージに海馬スライスを含むトリミング膜を転送し、軽く糊上の膜を配置し、気泡がないことを確認するために鉗子を使用してください。
- 瞬間接着剤が乾燥したように、バックPBS含むペトリ皿に接着膜でビブラトーム舞台を移す。ビブラトームブレードと組織切片を格納するためのアジ化ナトリウムを含有する48ウェルプレートを準備する。
- 貯蔵およびその後の免疫組織化学的染色のためにアジ化ナトリウムを含む48ウェルプレートに器官スライス組織と転送の30μmのセクションを生成するためにビブラトームを使用してください。
- 免疫組織化学染色26,29のために、既存のプロトコルを参照してください。
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Representative Results
1）スライスは、インビトロで 10-21日間（DIV）の後に海馬スライスの特徴的な形態学的特徴を維持すること、および2）新生児DGCsを定量することができる：器官培養成体神経発生の研究に適しているかどうかを決定する彼らは二つの主な基準を満たすことが必要一般的に成人の神経発生研究に用いられる標準的な免疫組織化学的技術を使用して。第一の基準については、 図1Aおよび1Bは 、保存海馬の形態を強調表示します。そのような歯状回（DG）などの特徴が、CA1、およびCA3領域は、簡単に識別。
第二の基準に関しては、 図1C（上段パネル）は新生児DGCsが緑色で内因性神経マーカー、ダブルコルチン（DCX）および外因性チミジン類似体、5-クロロ-2'-デオキシウリジン（CldU）での共発現の代表的なサンプルを提供赤。これらのニューロンは、サブGRに位置しています海馬DGのanularゾーン。ニューロンの正しい誕生デートを確保するために、我々はDCXを共発現するCldU +核を識別する。共焦点顕微鏡は、候補セルは、セルのZ軸を通して目的のマーカーを共発現する必要があるため、正常に二重標識されたニューロンを同定するために、この段階で必要とされる。サンプルデータは、二重標識収率でDCXとCldU適用後12日目のCaBPを発現しCldU +細胞の35％に発現CldU +細胞の約17％を得た。のCaBP値は、生体 26 で得られた比較可能な数字よりもかなり低いのに対し、DCXの値が非常に似ています。標準的な組織培養条件のCaBP +細胞の比較的低い割合の原因である可能性がある。
図2Aは、右（1-8）左から進む切開手順を示す：（2）の氷冷溶液に解剖脳の転移（3）、解剖し、脳を除去し、動物を断頭（1）から始まる左右の半球からの海馬のイオン（4）の氷冷解剖溶液中の解剖海馬の記憶装置（5）、Stoelting組織チョッパーの両方の海馬の転送と400ミクロンで切片を解剖顕微鏡下で個々のスライスの（6）の分離（7）および（8）細胞培養インサート上で組織をメッキする。この方法で進むと培養プロセスを通して無菌環境を維持するのに役立ちます。
開発の時間経過は、海馬の神経新生の重要な特徴であるので、最後に、我々は、神経幹細胞を分割する標識するために3 DIVの後に正確に2時間CldUと一緒に培養スライスをインキュベートすることにしました。 CldU投与のための狭い時間窓がニューロンがほぼ同じ成熟段階（ 図2）での細胞の均一な集団を構成した標識された可能性を改善するために選択した。 CldUラベリングに関しては、海馬機能のために、神経発生の一つの重要な特徴は、ギである時間VENさまざまな成熟段階27,28における歯状回顆粒細胞の異種集団が存在する。
保存海馬の形態を強調1.サンプルの蛍光顕微鏡写真を図。 （A）器官型スライス12日から21日からCldUについて免疫解剖（緑）、スライスののCaBP（赤）、20X空気合成画像（スケールバー= 500μm）で。（B）サンプル顕微鏡写真を投稿（解剖はCldUについて免疫投稿する赤）とDCX（緑） 図1Aの（反対色-スキーム）、20X空気（スケールバー=100μm）を。（C）上のパネル。細胞の代表的な共焦点顕微鏡写真共発現ClXdUおよび内因未熟ニューロンマーカー、DCX。 DGCs共発現DCX（緑）、CldU（赤）は、新生ニューロンとしてカウントされます。矢印は、二重ラベを示し、開発の初期段階で細胞を率い、40X油浸（=10μmのスケールバー）。匹敵する細胞は、インビボ 26 で 10日後に標識が観察されている。下のパネル。細胞の代表的な蛍光画像がCldU（緑）のCaBP（赤色）を共発現する。矢印は、二重標識細胞、40X蛍光顕微鏡写真（スケールバー= 10μm）を示している。 DG-歯状回。 GCL-顆粒細胞層。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.層流クリーンベンチにおける海馬解剖用逐次工程の（A）イラスト 。点線は、解剖領域の「非無菌」（左）および「滅菌」（右）のゾーンを示している。オルガノための（B）のタイムラインをP7の仔ラット（開始）から調製typicスライス培養。表記は、チミジン類似体、CldU *、実験問題に適した様々な薬理学的物質を含むことができ、「処置」の適用を示す。培養物は、（文化を修正）CldUアプリケーションから希望滞留時間でホルムアルデヒドで固定されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 試薬/機器の名称 | 会社 | カタログ番号 | コメント/説明 |
| 5-クロロ-2'-デオキシウリジン（CldU） | MPバイオメディカル | 105478 | 発がん性、有害 |
| 細胞培養インサート、直径30mm、0.4μmのpは鉱石サイズ | サーモサイエンティフィック | 140660 | これらの挿入にNuclonデルタコーティングは優れた組織接着を提供し、スライスの品質を向上させる。 |
| コニカル遠心チューブ（無菌） | フィッシャーサイエンティフィック | 14-432-22 | |
| 解剖器具はさみ（左右に角度を付け） | ファイン科学ツール | 14082から09 | |
| 最小必須培地（MEM） | ギブコ | 11095。液体 | 4℃で保存 |
| ニッケルU蛍光顕微鏡日食 | ニコン | ||
| 組織のための接着剤 | クレイジー接着剤 | KG585 | 接着剤にさらされる任意の組織はIHCのために使用できなくなりますように接着を達成するために接着剤の最小量を使用してください。 |
| ハンクス平衡塩溶液（HBSS）（500ml）に | ギブコ | 14025-092 | 4℃で保存 |
| ウマ血清熱不活性化（500ミリリットル） | ギブコ | 16050-122 | -20℃で50ミリリットルアリコートとストアを作る |
| キムワイプ | キンバリー·クラーク | TW 31KYPBX | |
| 修正されたガラスピペット（ブンゼン炎で平滑化パスツールピペット削除され、エッジの底部） | |||
| ペトリ皿（100ミリメートル×15ミリメートル）と（×15mmの60ミリメートル） | フィッシャーブランド | FB0875712とFB0875713A | |
| スカルペルブレード＃11 | ファイン科学ツール | 10011から00 | |
| スカルペルハンドル＃3 | ファイン科学ツール | 10003から12 | |
| 血清学的ピペット | Sorfaメディカルプラスチック株式会社 | P8050 | |
| 標準パターン鉗子 | ファイン科学ツール | 11000から12 | |
| 無菌の真空フィルター | サーモサイエンティフィック | 565-0020 | |
| 外科はさみ | ファイン科学ツール | 14054から13 | |
| シリンジ駆動フィルターユニット | ミリポア、ミレックス | SLGP033RS | |
| 可動ステージと組織チョッパー | Stoelting | 51425 | |
| ファイン先端絵筆 |
表1.用品および試薬
| ソリューション | 食材や手順 |
| 解剖ソリューション | a）は、ハンク·500mlの＃39; sの平衡塩溶液（HBSS）（ギブコ-14025から092）。 |
| b）は2.2グラムのD-グルコースを追加します。 | |
| C）0.5グラムのスクロースを追加します。 | |
| D）1.787グラムのHEPESを追加します。 | |
| e）の磁気撹拌プレートで30分間混合する。 | |
| f）の溶液を確保するための使用pH計は、最終pH = 7.4を有している。 | |
| G）= 320から330 mOsmで、最終的な浸透圧を確保するために浸透圧計を使用してください。 | |
| h）は、0.2μmのフィルターを通して真空濾過を用いて無菌層流フード内で溶液を滅菌する。 | |
| 血清含有培地：100ミリリットル最小必須培地（MEM）（ギブコ11095）、50ミリリットルウマ血清（ギブコ16050から122）、50ミリリットルHBSS。 | a）のビーカー50mlのHBSSに以下を追加し、37℃の水浴中で溶解する。マグネチックスターラーで混ぜる。 |
| b）は、1.3グラムのD-グルコース。 | |
| C）36 mgのMgSO 4を。 | |
| D）17.6 mgのアスコルビン酸。 | |
| E）、2MのCaCl 2ストック溶液を5μL。 | |
| ギブコ15140-062）と、f）50μlの抗生物質 - 抗真菌（100X株式、無菌を追加します。 | |
| g）を1μg/ mlのインスリン。 | |
| H）0.2μmのフィルターで濾過することにより溶液の上に滅菌する。 | |
| i）のミックスを100mlのMEMと、層流フード50mlのウマ血清を用いて溶液を濾過した。 | |
| j）を4℃で50ミリリットルの無菌コニカル遠心管中でアリコート（フィッシャーサイエンティフィック-14-432-22）とストアを行います。 | |
| 4％パラホルムアルデヒド固定液ソリューション。 | a）は、蒸留H 2 O 300mlに以下の磁気撹拌プレート上で混合することを追加することによって、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備。 |
| b）は、2.7グラムの一塩基性リン酸ナトリウム（のNaH 2 PO 4）を加える。 | |
| C）11.5グラムナトリウムphosphatを追加電子の二塩基性（のNaHPO 4）。 | |
| d）の9.0グラムの塩化ナトリウム（NaCl）を加える。 | |
| e）の約加熱する。 700〜55℃の蒸留H 2 Oの溶液と熱をオフにします。 | |
| f）に40gのパラホルムアルデヒド（PFA）を追加し、磁気撹拌プレートを用いて水700ml中に撹拌した。 | |
| g）をPBS（a、b、c、dを）組み合わせ、PFAの（e、f）はソリューションが1000 mlの最終容積7.4、トップアップにpHを調整する。 | |
| 0.1％アジ化ナトリウムソリューション | a）のPBS溶液を1 Lに粉末アジ化ナトリウム（NaN 3を）の1グラムを加える。 |
| b）のミックスを4℃で、磁気撹拌プレート及びストアを使用。 |
表2.ソリューションとレシピ
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Discussion
CldU（またはBrdU）の投与後に、薬理学的薬剤の適用のタイムラインは、特定の発生の窓の間に新生児DGCsを標的とするように選択することができる。例えば、仮想的な薬剤は、GABAが脱分極される発達段階にある未成熟ニューロンの年齢と一致することが提案されている第二週後CldU注射中に適用することができる。このプロトコルを使用して今後の研究では、薬剤と「テーラー「目的の特定の実験的な質問へのアプローチへの暴露のウィンドウを適応させることができます。
そのスライス培養は出生後の神経新生の研究のための有効なモデルであるかを決定するための重要な基準は、海馬の新生ニューロンを染色し、定量する能力である。この仮説を支持する二つの主な調査結果は、顕微鏡分析はCldUと同じニューロンにおける内因性タンパク質マーカーの免疫組織化学的反応性を明らかにしたことだった。内因性の神経細胞のマーカーと組み合わせて使用される場合、そのようなBrdUおよびCldUとしてチミジン類似体は、神経発生の研究のための強力なツールである。
腹腔内注射を介してなどのBrdUなどのチミジン類似体の適用は、一般的に有糸29のS期を経るニューロンを標識するために、神経発生の研究に利用されている。同様のアプローチは、一定の修正を加えた器官培養に用いることができる。例えば、これまでの研究は、〜14 DIV 18の後に文化をスライスするのBrdU（3日間0.5μm）を投与した。その論文に提示されたデータを確認すると、神経発生を定量化するために使用されるメトリックのいくつかはすなわち 、立体解析定量化30、神経新生の分野で使用される標準的な技術を使用しないことを明らかにしている。 BrdUおよびニューロン、核（NeuNの）陽性細胞の共発現を報告するとき、例えば、それらは、通知を提供する代わりに、「培養当たり」細胞の合計数を示す組織領域またはボリュームに関するATION。
その後の研究は、抗体がより容易に組織サンプル31に浸透できるようにすることで、可視化し、免疫組織化学プロトコルを改善し、個々の10μmの切片に培養されたスライスを区画することにより、この方法に改善しました。二段ら 28は、10μmのセクションごとの共同標識細胞の数などのBrdUで二重標識（3日間10μm）を報告したが、比較の領域または特定の海馬領域研究すなわち、CA1、CA3またはについての情報を提供しなかったDG。さらに、共焦点蛍光顕微鏡画像の分析は、説得力の海馬の形態学が正常に維持されたことを示していない。
重要なことは、両方の研究には欠点が関連付けられている3日間のBrdUの露光期間を使用する。 BrdU標識が大幅に研究者がVAで新しく分裂した細胞を追跡できるようにすることで、神経発生研究を支援しているrious脳領域。しかしながら、BrdUの毒性もよく特徴づけられている。その使用は、形態学的および行動異常32,33と神経幹細胞の34-36の細胞周期、分化、移動および生存に悪影響を引き起こすことが示されている。前述の研究におけるBrdUの長期投与は、海馬生理学を変更され、BrdUの管理からいくつかの副作用が避けられないかもしれないが、私たちの実験プロトコルは、チミジン類似体で組織をインキュベートすることによって、これらの合併症の一部を制限するように設計された交絡変数を導入している可能性があります2時間。インキュベート溶液を調製するときに、BrdUのより良好な溶解度を示したので、さらに、我々は代わりにのBrdU CldUを使用することにしました。 3日間のプロトコルは増殖細胞の標識化を最大に、たとえば特定の実験的な設計のために有用であるかもしれないが、この2時間のプロトコルは、比較的小さなPopulaのパルス標識の利点を有している希望生存時間で学ぶことができ、細胞のる（ 図2Bを参照）。
器官スライス培養37で標識技術への重要な貢献をした難 波ら BrdUのアプリケーション、の2種類の方法以下のニューロンの生成のレベルを比較することによって。 30分すぐに組織の外植追従1μMのBrdUを含む培養培地を受けたインビトロ培養と生後5日（P5）ラットにおけるBrdU（50mg / kg）の作者比べ腹腔内（IP）注射。彼らは、間に統計的有意差を報告し、生体内培養組織で、早期のin vitroのBrdU注射。著者は、海馬の構造を概説鮮明な画像を提示していなかったが、彼らは顆粒細胞層の全細胞の割合としてのBrdU免疫反応性を報告している。彼らは立体的カウントを採用しているが、面積や体積測定を提供することは有益であろう。一般に神経発生および薬理学的摂動の研究のためのアプリケーションと、引用された研究出生後の海馬スライス培養の詳細徹底したとして存在する器官培養物、。この技術を使用して、海馬スライスを、 インビトロ （DIV） で最長21日間維持することができ、薬物は、神経新生への影響を研究するための培養期間の任意の時点で培地に添加することができる。
私たちの目的は、2時間CldUの簡単な「パルス」アプリケーションを提供することで、DGCsの離散、比較的均一な集団を標識した。神経発生を研究するための1つの一般的に使用さ戦略は、チミジン類似体と様々な内因性のマーカーの免疫組織化学的染色を経由して、ニューロンの成熟段階の同定を含む。共焦点蛍光顕微鏡は、チミジン類似CldUを含有させることから積極的に培養期間の間、有糸分裂を受けた核の存在を確認した。 図2 、生体内の組織分析のために用いた免疫組織化学プロトコルは、スライス培養に適合させることができるという証拠を提供する。
具体的には、神経発生の研究で一般的に使用される方法は、一日3-21と完全に後に発現される成熟したニューロンマーカー、カルビンジン（のCaBP）、から主に未熟ニューロンにおいて発現される微小管関連タンパク質、DCX、のための免疫組織化学染色を行うことである28日後に有糸分裂。 CldU +細胞の表現型は、これらの内因性のマーカー26を使用して決定した。
長期間スライス培養を維持するための改良された方法は、よりCldU +ニューロンが成熟のCaBP +段階に到達することを可能にするという付加的な利点を有することができる。現在のところ、器官培養アプローチの一つの制限は、組織が連続培養期間中に変化することである。例えば、すぐにスライスの海馬解剖とメッキ、TI以下ssueは、約400μmの幅を有する。しかし、インキュベーションチャンバー内の2〜3週間後に、組織切片は、250〜350ミクロンの間で最終的な幅、その結果、薄いを開始します。これは、免疫組織化学のために使用することができ、プロジェクトのために使用する方法について多くの動物を計画する際に考慮されるべき組織の量を制限する。追加の実験は、in vitroで起こる海馬生理学の機能変化を特徴づけるのに役立ちます。
海馬スライスをセクショニングと染色のためのプロトコルは、培養期間の間に起こる細胞および形態学的変化を分析するために開発された。スライス培養海馬DGCsが成熟の間に明確な発達段階を通過して、将来の成人の神経発生研究のための貴重なツールを表すように、様々な薬理学的作用物質の効果をテストする機会を提供する。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
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