Summary
Здесь мы опишем технику для изучения гиппокампа послеродовой нейрогенез помощью органотипической технику ломтик культуры. Этот метод позволяет для манипуляций в пробирке нейрогенез и позволяет прямое применение фармакологических препаратов в культурной гиппокампа.
Abstract
Здесь мы опишем технику для изучения гиппокампа послеродовой нейрогенез в мозге грызунов при помощи органотипической технику ломтик культуры. Этот метод сохраняет характерный топографическую морфологии гиппокампа, позволяя прямое применение фармакологических препаратов для развивающихся зубчатой извилине гиппокампа. Кроме того, срез культуры может поддерживаться до 4 недель и тем самым позволяют изучать процесс созревания новорожденных нейронов гранул. Срез культуры обеспечения эффективного фармакологического манипуляции срезах гиппокампа, исключая сложные переменные, такие как неопределенности, связанные с глубокой анатомической локализации гиппокампа, а также гематоэнцефалический барьер. По этим причинам, мы стремились оптимизировать органотипической культур ломтик специально для послеродового исследования нейрогенеза.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных соответствовала здоровья и благополучия руководящих принципов животных кафедры сравнительной медицины в университете Торонто.
1. Подготовка срезов гиппокампа
- Стерилизовать следующие инструменты применением сухого автоклав при 125 ° C: Скальпель ручку (# 3) (2), установленного образца щипцы, большой (1), Малый диссектор ножницами (под углом в сторону) (1), Micro ложка (ложка и плоским шпатель концы) (1), Микро-шпатели (округлые и округлые конические концы) (2), Тонкая кисть (1), Пожарная полированные пипетки Пастера (2), марлевые квадраты, 2 х 2 дюйма (5).
- Когда стерильной, вводятся инструменты в стерильный контейнер и держать крытая до использования. Непосредственно перед рассечением, погружают инструменты в 70% -ном растворе этанола.
- Подготовка культуры пластину 6-а с культурой вставки перед началом процедуры вскрытия путем добавления 1 мл культуральной среды / лунку и хранения пластину в инкубаторе при 35 ° C Aй 5% СО 2.
2. Организовать рассечение инструментов в капот Стерильный ламинарный поток
- Спрей капот ламинарного потока с 70% этанола и удалить стерилизованные рассечение инструментов от алкоголя. Разрешить инструменты, чтобы высушить во время отдыха на стерильную чашку Петри, чтобы избежать контакта между алкоголем и расчлененный мозговой ткани.
- Депозит 5-7 мл стерильной ледяной рассекает раствора в 2 больших стерильные чашки Петри. Один блюдо будет охладить и очистить голову (Dirty), другой для охлаждения и промывки зачерпнул мозг (чистый). Поместите стерильную фильтровальную бумагу в одном из тарелки крышками Петри для рассечения из мозга.
- Поместите небольшое, стерилизованное фильтровальную бумагу в одном из небольшой чашки Петри крышкой для рассечения из гиппокампа. Депозит 3-5 мл стерилизованной охлажденному льдом раствору вскрытии в два небольших стерильные чашки Петри. Один блюдо будет держать зачерпнул гиппокамп, продержится разделы в процессе разделения гиппокампа разделовпод микроскопом рассечение.
- Подготовка ткани вертолет лентой кусок стерилизованной фильтровальной бумаги на сцену резки и монтажа стерильную лезвие. Смочите фильтровальную бумагу со стерилизованным раствором вскрытии.
- Спрей чистой био-мешок с алкоголем и поместить его в ламинарный поток чистой поверхности.
3. гиппокампа Вскрытие
- Спрей крысят P7 Sprague Dawley с 70% этанола за пределами ламинарного потока чистой скамейке и быстро обезглавить животное с использованием больших стерильные хирургические ножницы внутри скамейке ламинарного потока. Пусть головки падение в охлажденному льдом раствору вскрытии в одном из чашек Петри.
- В чашке Петри, смыть кровь и быстро передавать с головы до стерилизованной фильтровальной бумаги, брюшной стороне вниз.
- Использование скальпеля, разрезать вдоль спинной поверхности в сагиттальной плоскости, чтобы выставить основной череп. Вырезать через кожу, но не основной кости, который является мягким и легко проницаемой у крыс тего возраст. Отложите эту «грязную» скальпель и не использовать на ткани головного мозга.
- Использование маленькие ножницы диссектора (расположенные под углом в сторону) и щипцы, разрезать череп вдоль сагиттального шва черепа, чтобы темени, анатомическую точку на черепе, где венечного шва пересекается перпендикулярно от сагиттального шва. Используйте пинцет, чтобы вытащить черепа закрылки вверх и в сторону от средней линии черепа.
- Поместите микро ложку на нижней части головного мозга, под ствола мозга, чтобы осторожно поднимите мозга из черепа. Поднимите мозг, чтобы разоблачить зрительные нервы и обонятельной луковицы на базальной поверхности мозга. Сокращение этих структур с маленькими ножницами, чтобы полностью отделить мозг от черепа. Снимите и передать нетронутыми мозга к другой большой чашке Петри, содержащей ледяной решение рассекает.
- Использование микро ложку, передача мозг небольшой крышкой чашки Петри, содержащей стерильную фильтровальную бумагу. С стерильной пастеровской пипетки, промыть мозг с помощью нескольких капель DISресекающихся решение сохранить ткани влажным.
- Использование "чистой" лезвие скальпеля вырезать два полушария друг от друга. Трансфер левое полушарие обратно в большую чашку Петри с микро ложкой и поместите полушария Пиа стороной вниз в ледяной рассекает решение для последующего использования.
- Просмотр медиальной поверхности правого полушария и определить края свода, известного полосу белого вещества вдоль медиального края гиппокампа. Используя стерильный скальпель, чтобы сагиттальный разрез через свод, но будьте осторожны, потому что только 0,5 см от кончика скальпеля будет достаточным, чтобы разрезать свода.
- Использование 2 микро-лопатки, удалить первый гиппокамп от правого полушария, помещая правой руки шпатель на стволе головного мозга и подъема лежащего кору с левой лопаткой. Аккуратно поднимите мозга, чтобы выявить бокового желудочка и медиальной поверхности гиппокампа. Белый изогнутые линии, бахромка, теперь должны быть видны.
- Совместите кривизну шпателем с Кервары из бахромка и слегка нажмите на шпатель под бахромка. Вставьте шпатель влево и ездить по ростральной-каудальном оси, а затем поднимите шпателем в направлении спинного удалить гиппокамп.
- Передача гиппокамп к 2-й небольшой чашки Петри с охлажденному льдом раствору вскрытии. Повторите ту же процедуру на левом полушарии, чтобы удалить левую гиппокамп.
- Использование микро шпателя, тщательно передачи гиппокампа на сцену ткани измельчителя. Расположить их рядом и параллельно друг другу и перпендикулярно к оси прерывателя лезвия. Используйте кисть, чтобы расположить ткань и добавить несколько капель вскрытии решения на верхней части гиппокампа.
- Отрежьте ткань в 400 мкм ломтиками, не останавливаясь, чтобы удалить отдельные кусочки (как правило, они не будут придерживаться лезвия). После Вся гиппокамп был сокращен, используйте кисть, чтобы мягко перевести к участку 2-й небольшой чашке Петри с рассечение решения.
- Под объявлениемissecting микроскоп, осторожно отделите плавающие фрагменты Используя amicro-шпатель и кисть.
- Снимите заранее подготовленный культуры пластины с культурой вставкой из инкубатора и место в ламинарном потоке.
- Использование огневой полировкой пипетки Пастера, рисовать 4-5 ломтика в пипетку и передачи ломтиками апикальной поверхности культура вставки мембраны. Затем отрегулируйте расположение с кистью и оставить пространство между отдельными секциями и границы культуры вставки.
- С помощью стерильной пипетки Пастера, удалить избыток рассекает раствор из апикальной поверхности мембраны.
ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении решение не привлекать срезов ткани в пипетку. Кроме того, с помощью обычной пипетки (P200 или P1000) с стерилизованных наконечники пипеток медленно удалить решение. - Место культуры пластины с содержащей сыворотку культуральной среды и в срезах гиппокампа обратно в инкубатор при 35 ° С и 5% СО 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если эксперимент звонкидля создания культур от нескольких животных, тщательно очистить ламинарного потока чистой скамейке между вскрытия. Вернуться инструменты, чтобы спиртового раствора и заменить все чашках Петри, фильтровальную бумагу и стерильные лезвия до второго вскрытия.
4. Питание и обслуживание Органотипической фрагменты
- Кормовые культуры в стерильной ламинарного потока чистой скамейке.
- Выполнение первого кормления культивируемых участках 2 дней после вскрытия. Отберите старый культуральной среды с использованием стерилизованную стеклянную пипетку.
- Используйте стерильные 5 мл серологические пипетки для добавления 1 мл свежей, стерильной, не содержащей сыворотки среде, содержащей в лунки.
- Аккуратно поставьте культуры вставки и заботиться, чтобы удалить воздушные пузырьки, которые могли образоваться под поверхности мембраны.
- После первого кормления, изменить средний через день.
5. Инкубация ткани Ломтики тимидином аналогов Этикетка новорожденных Нейроны
- С целью изучениясозревание и интеграция зубчатой зернистых клеток в гиппокампе, инкубировать органотипической ломтики с аналог тимидина, таким как бромдезоксиуридин (BrdU) или Chlorodeoxyuridine (CldU). Здесь мы используем CldU из-за его высокой растворимости в солевом растворе.
- После 3DIV, добавить 1 мкл 10 мг / мл CldU маточного раствора в физиологическом растворе в 1 мл культуральной среды до конечной концентрации 10 мкг / мл. Если используется BrdU, исправить концентрацию различий в молекулярной массе. Добавить среду с CldU с культурой скважин и инкубировать ткани с CldU среде, содержащей в течение 2 ч при 35 ° С.
- После 2 ч инкубации при 35 ° С, удалить CldU среде, содержащей и заменить регулярной среде подачи, чтобы возобновить нормальный график подачи (описанной выше).
6. Ткань Фиксация и хранение
- Создать график для применения процедуры и фиксации образцов тканей перед началом культуры экспериментов (рис 2б). <Li> в заданном день после вскрытия, подготовки следующих в лабораторных вытяжном шкафу: 10-50 мл химический стакан, содержащий 4% параформальдегида (PFA) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS); пустой стакан выброшенные культуральной среде; небольшие щипцы; и 1000 мл пипетки с одноразовыми наконечниками.
- Снимите культуры пластину (ы) из инкубационной камеры и передачи в вытяжном шкафу. Наклоните отдельных скважин пластины-вставки пинцетом. Затем, с помощью пипетки, чтобы удалить культуральную среду и перенос в стакан утилизации. Наклоните культуры пластины под углом, чтобы обеспечить, что все культуры среду удаляют.
- Завершение удаления среды для одного культурального планшета одновременно. Когда среда была удалена, добавьте 1 мл 4% PFA для каждой культуры хорошо и печатью луночного планшета с парафином. Повторите столько культуральных планшетах, при необходимости, и передачи пластин в холодильнике при 4 ° С в течение 24 ч.
- После 24 часов, подготовить следующее в вытяжном шкафу: 10-50 мл химический стакан, содержащий 0,1% азид натрия в PBS; пустоМЕНЗУРКУ выброшенные PFA (соблюдать меры предосторожности по безопасности, в которой удаление токсичных веществ); небольшие щипцы; и 1000 мл пипетки с одноразовыми наконечниками.
- Следуйте указаниям, приведенным в 6.4 для добавления PFA, но добавить 1 мл PBS с азида натрия вместо этого. После того, как полностью переданы, уплотнение луночные планшеты для использования в будущем путем обертывания краев в парафином и хранить в холодильнике при 4 ° С.
7. Структурирование ткани для иммуногистохимии
- Выполните ткани секционирования с помощью vibratome. Следующая серия шагов поможет максимизировать выход пригодных срезов ткани органотипических культур.
Примечание: Сразу же после вскрытия гиппокампа и обшивки ломтиками, ткань имеет толщину примерно 400 мкм. Тем не менее, через 2-3 недели в инкубационной камере, кусочки ткани начнет выравниваться, в результате чего в конечной толщины сечения 150-300 мкм. - Подготовьте следующие пункты в раздел культурного ткани: A # 11 скальпель бобременял и обрабатывать, стекло чашку Петри, содержащую ледяной PBS, микро-рассечение пинцет и чистую этап vibratome резки монтировать ткани.
- Использование скальпель, чтобы сократить тщательно по периметру круговой вставки мембраны таким образом, что он может быть отделен от пластикового корпуса вставки. Оставьте достаточно места между культурной фрагмента и скальпеля.
- Передача удаленные вставки мембраны в чашку Петри, содержащую PBS. После промывки в PBS, использовать щипцы для передачи мембрану на монтажном этапе vibratome.
- Затем, используя скальпель, чтобы устранить излишки мембраны, окружающей культурные кусочками и отрезать излишки материала, чтобы создать чистые края. Этот шаг обеспечит мембрану является плоской и может легко прилипают к режущей поверхности.
- Поместите 1-2 капли клея на сцене vibratome резки и распространение в ровным слоем с помощью иглы 22 G. Распространение клея в форме прямоугольника с длинной кромке параллельно режущей лопасти vibratome. Выполните этот шагбыстро, чтобы предотвратить клей от высыхания.
- Используйте пинцет, чтобы передать обрезанную мембрану, содержащую срезах гиппокампа на сцену резки и аккуратно поместите мембрану на клей и убедитесь, что нет пузырьков воздуха.
- Как суперклей сохнет, передача этап vibratome с клееного мембраны обратно в PBS, содержащем Петри. Подготовка лезвие vibratome и 48-луночного планшета азид, содержащий натрия для хранения срезов тканей.
- Использование vibratome генерировать 30 мкм секций Органотипической среза ткани и передачи в 48-луночный планшет, содержащий азид натрия для хранения и последующего иммуногистохимического окрашивания.
- Обратитесь к ранее существовавшего протоколы для иммуногистохимического окрашивания 26,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Определение, если органотипической культуры были бы пригодны для нейрогенез исследований, необходимых, чтобы они удовлетворяли двум критериям: 1), что ломтики сохранить характерные морфологические особенности срезах гиппокампа после 10-21 дней в пробирке (DIV), и 2) что новорожденные РСК может быть количественно с использованием стандартных иммуногистохимических методов, обычно используемые во взрослой исследований нейрогенез. Что касается первого критерия, 1А и 1В выделить сохранившиеся гиппокампа морфологию. Характерные особенности, такие как зубчатой извилине (DG), CA1, и CA3 регионы было легко идентифицировать.
Что касается второго критерия, Фиг.1С (верхняя панель) обеспечивает репрезентативную выборку новорожденных РСК коэкспрессирующей эндогенного нейронный маркер, Даблкортин (DCX) в зеленый и экзогенный аналог тимидина, 5-хлор-2'-дезоксиуридина (CldU) в красный. Эти нейроны расположены в суб-GRфиброзного кольца зона гиппокампа DG. В целях обеспечения правильного знакомства рождения нейронов, мы отождествляем CldU + ядра, CO-экспресс DCX. Конфокальной микроскопии необходимо на данной стадии, чтобы определить, успешно двойные-меченных нейронов, так как кандидаты клетки должны совместно экспрессируют маркер интерес в течение всего Z-оси клетки. Выборка данных, полученных с таким выходом дважды маркировки примерно 17% от CldU + клеток, которые выразили DCX и 35% CldU + клеток, которые выразили CaBP на 12 дней после нанесения CldU. Значение DCX очень похожи, тогда как значение CaBP значительно ниже, чем аналогичный показатель, полученный в естественных условиях 26. Стандартные условия культуры тканей могут быть ответственны за относительно низкий процент от + клеток CaBP.
2А представлены шаги рассечение, протекающих слева направо (1-8): начиная с обезглавливания животного (1), удаление мозга (2), передачи мозга на льду раствору вскрытия (3), рассекатьион гиппокампа из левого и правого полушарий (4), хранение рассеченной гиппокампе в охлажденному льдом раствору рассечение (5), передача обоих гиппокампе в Stoelting ткани измельчитель и срезов при 400 мкм (6), разделение отдельных кусочков под микроскопом рассекает (7), и покрытие ткани на клеточной культуре вставками (8). Действуя таким образом, помогает поддерживать стерильную среду в течение всего процесса культивирования.
Наконец, поскольку времени курс развития является важной особенностью гиппокампа нейрогенеза, мы выбрали для инкубации культивируемых ломтики CldU ровно 2 часа после 3 DIV, чтобы метки деления нервных стволовых клеток. Узкое окно времени для введения CldU был выбран, чтобы повысить вероятность, что меченных нейронов представляет собой гомогенную популяцию клеток приблизительно в то же созревания этап (рисунок 2). Что касается CldU маркировки, одна критическая функция нейрогенеза для гиппокампа функции является то, что в гивэн раз есть гетерогенную популяцию зубчатой ЗК на разных созревания этапов 27,28.
Рисунок 1. Пример флуоресцентного микроскопа фотографии по сохранилась гиппокампа морфологию. () Органотипической ломтик от 12 дней после вскрытия immunolabeled для CldU (зеленый) и CaBP (красный), 20x воздуха составное изображение (масштаб бар = 500 мкм). (B) Пример микрофотография среза от 21 дней после вскрытия immunolabeled для CldU ( красный) и DCX (зеленый) (напротив цвета схема на рисунке 1а), 20x воздуха (Масштаб бар = 100 мкм). (C) Верхняя панель. Представитель конфокальной микроскопии фотографию клеток коэкспрессирующей ClXdU и эндогенной незрелых нейронов маркер, DCX. РСК коэкспрессирующей DCX (зеленый) и CldU (красный), учитываются как новорожденных нейронов. Стрелка указывает двойное Labeпривело ячейку на ранней стадии развития, 40Х масляной иммерсии (масштаб бар = 10 мкм). Сопоставимые клетки были обнаружены 10 дней после маркировки в естественных условиях 26. Нижняя панель. Представитель флуоресцентные изображения клеток коэкспрессирующей CldU (зеленый) и CaBP (красный). Стрелка указывает на двойной-меченых клеток, 40X флуоресцентный микрофотография (Шкала бар = 10 мкм). DG-зубчатой извилине. GCL-ЗК слой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. () Иллюстрация последовательных шагов для гиппокампа вскрытия ламинарного потока чистой скамейке. Пунктирная линия указывает "нестерильных" (слева) и "стерильные" (справа) зоны области вскрытия. (B) сроки для органоTypic срез культуры, полученные из P7 крысят (СНВ). Обозначения, обозначения применение аналог тимидина, CldU * и "лечения", которое может включать в себя различные фармакологические препараты, подходящие для экспериментального вопрос. Культуры фиксировали параформальдегидом в нужное время задержки затвора от применения CldU (FIX культуры). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| Название реагента / Оборудование | Компания | Номер по каталогу | Комментарии / Описание |
| 5-хлор-2'-дезоксиуридин (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Опасные, канцерогенные |
| Культура клеток вставляет, диаметр 30 мм, 0,4 мкм рРазмер руды | Thermo Scientific | 140660 | Нуклон дельта покрытие на этих вставок обеспечивает лучшее сцепление тканей и улучшает качество среза. |
| Коническая центрифуга трубки (стерильный) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Диссектор ножницы (под углом в сторону) | Изобразительное Инструменты Наука | 14082-09 | |
| Минимальная поддерживающая среда (MEM) | Гибко | 11095; жидкость | Хранить при 4 ° С |
| Затмение Ni-U флуоресцентного микроскопа | Nikon | ||
| Клей для ткани | Крейзи Клей | KG585 | Используйте минимальное количество клея для достижения адгезии как любая ткань подвергается клей будет испорчен для IHC. |
| Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) (500 мл) | Гибко | 14025-092 | Хранить при 4 ° С |
| Лошадиной сыворотки инактивированной нагреванием (500 мл) | Гибко | 16050-122 | Сделайте 50 мл аликвоты и хранят при температуре -20 ° C |
| Kimwipes | Kimberly-Кларк | TW 31KYPBX | |
| Модифицированные стеклянные пипетки (в нижней части пипетки Пастера удалены и края сглаженные Бунзена пламени) | |||
| Петри (100 мм х 15 мм) и (60 мм х 15 мм) | Фишер Марка | FB0875712 и FB0875713A | |
| Скальпель лезвия # 11 | Изобразительное Инструменты Наука | 10011-00 | |
| Скальпель ручка # 3 | Изобразительное Инструменты Наука | 10003-12 | |
| Серологические пипетки | Sorfa медицинский пластиковые Co. | P8050 | |
| Стандартная модель щипцы | Изобразительное Инструменты Наука | 11000-12 | |
| Стерильные вакуум-фильтра | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Хирургические ножницы | Изобразительное Инструменты Наука | 14054-13 | |
| Шприц приводом от двигателя фильтр | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Ткань измельчитель с подвижной стадии | Stoelting | 51425 | |
| Тонкой кистью наконечник |
Таблица 1. Расходные материалы и реагенты
| Решение | Ингредиенты и инструкции |
| Вскрытие решение | а) 500 мл Хэнка и# 39, S сбалансированный солевой раствор (HBSS) (Gibco-14025-092). |
| б) Добавить 2,2 г D-глюкозы. | |
| в) добавляют 0,5 г сахарозы. | |
| d) Добавить 1,787 г HEPES. | |
| е) смешивания в течение 30 мин с магнитной мешалке. | |
| е) Использование рН-метр, чтобы обеспечить решение имеет конечный рН = 7,4. | |
| г) Используйте осмометра, чтобы обеспечить окончательный осмотическое давление = 320-330 мОсм. | |
| з) стерилизацию раствора в стерильной ламинарном боксе помощью вакуум-фильтрации через 0,2 мкм фильтр. | |
| Содержащей сыворотку культуральной среды: 100 мл минимальную поддерживающую среду (MEM) Игла (Gibco 11095), 50 мл сыворотки лошади (Gibco 16050-122), 50 мл HBSS. | ) Добавить после 50 мл HBSS в стакан и растворяют в 37 ° С на водяной бане. Смешать с магнитной мешалкой. |
| б) 1,3 г D-глюкозы. | |
| в) 36 мг MgSO 4. | |
| d) 17,6 мг аскорбиновой кислоты. | |
| е) 5 мкл 2 М CaCl 2 маточного раствора. | |
| е) Добавить 50 мкл антибиотикам противогрибкового средства (100x акции, стерильные; Gibco 15140-062). | |
| г) 1 мкг / мл инсулина. | |
| з) стерилизовать выше раствора фильтрацией через фильтр 0,2 мкм. | |
| I) Смесь фильтруют раствор с 100 мл MEM и 50 мл лошадиную сыворотку в ламинарном боксе. | |
| J) Марка 50 мл аликвоты в стерильные конические пробирки центрифуги (Fisher Scientific-14-432-22) и хранят при температуре 4 ° С. | |
| 4% раствор Параформальдегид фиксатор. | ) Подготовка фосфатно-солевой буфер (PBS), добавив следующее 300 мл дистиллированной H 2 O и перемешивания на магнитной мешалке. |
| б) Добавить 2,7 г натрия фосфат одноосновной (NaH 2 PO 4). | |
| в) Добавить 11,5 г Phosphat натрияе двухосновной (NaHPO 4). | |
| г) Добавить 9,0 г хлорида натрия (NaCl). | |
| е) Нагрейте ок. 700 мл дистиллированной H 2 O до 55 ° С и выключить тепло. | |
| е) Добавить 40 г параформальдегида (PFA) и перемешивают в 700 мл воды с использованием магнитной мешалки. | |
| г) Объединение PBS (A, B, C, D) и PFA (E, F) решения, доведения рН до 7,4 и макушки до конечного объема 1000 мл. | |
| 0,1% азид натрия Решение | ) Добавить 1 г порошкообразного азида натрия (NaN 3) до 1 л раствора PBS. |
| б) Mix с помощью магнитно-мешалки и хранят при 4 ° С. |
Таблица 2. Решения и рецепты
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
После CldU (BrdU) или введения, график применения фармакологических агентов могут быть выбраны для целевой новорожденных РСК в течение определенных окон развития. Например, гипотетический агент может быть применен во второй инъекции неделю после CldU, который предложил совпадают с возрастом незрелых нейронов, которые находятся на стадии развития, где ГАМК деполяризующими. Будущие исследования, использующие этот протокол может адаптировать фармакологический агент и окно экспозиции «портной» подход к конкретной экспериментальной интересующий нас вопрос.
Важным критерием для определения того, что срез культуры являются действительными модель для послеродового исследований нейрогенез способность окрашивать и количественно новорожденных нейронов в гиппокампе. К двум основным выводам в поддержку этой гипотезы было то, что микроскопический анализ показал, иммуногистохимическое реактивность для CldU и эндогенных белковых маркеров в одних и тех же нейронов.При использовании в сочетании с эндогенными нейронных маркеров, тимидиновые аналоги, такие как ВДУ и CldU являются мощными инструментами для нейрогенеза исследования.
Применение тимидина аналогов, таких как BrdU, с помощью внутрибрюшинных инъекций обычно используют нейрогенеза исследования для этикеток нейронов, проходящих S-фазу митоза 29. Аналогичные подходы могут быть использованы в органотипических культур с некоторыми модификациями. Например, предыдущие исследования вводить BrdU (0,5 мкМ в течение 3 дней), чтобы нарезать культур после ~ 14 DIV 18. Рассматривая данные, представленные в этой работе, показывает, что некоторые из показателей используется для количественной оценки нейрогенеза не используют стандартные методы, используемые в области нейрогенез, т.е. стереологической количественное 30. Например, при освещении совместной экспрессии в BrdU и нейронных-ядер (NeuN) положительных клеток, они указывают на общее количество клеток "в культуре" вместо предоставления информируетция о участка ткани или объема.
Последующие исследования улучшили этого метода секционирования культивируемых срезов отдельных 10 мкм разделов, в котором улучшено визуализации и иммуногистохимии протоколов, позволяя антитела более легко проникать образцы ткани 31. Двухъярусная др. 28 сообщили, двойной маркировки с BrdU (10 мкМ в течение 3 дней), сколько ко-меченых клеток в разделе 10 мкм, но не предоставляют информацию о сравнительных области или конкретной области гиппокампа учился т.е. CA1, СА3 или DG. Кроме того, анализ конфокальной и флуоресцентной микроскопии изображений не убедительно показывают, что гиппокамп морфология успешно эксплуатируется.
Важно отметить, что оба эти исследования использовали период экспозиции BrdU 3 дней, что имеет соответствующее недостатки. BrdU маркировки значительно способствовало нейрогенеза исследования, позволяя исследователям отслеживать вновь разделить клетки в ванасколько серьезными областях головного мозга. Тем не менее, BrdU токсичности также хорошо описана. Его использование было показано, что причиной морфологических и поведенческих отклонений 32,33 и негативное воздействие на клеточный цикл, дифференциации, миграции и выживания нервных стволовых клеток 34-36. Длительное применение ВДУ в ранее упомянутых исследований могут ввели смешанные переменные, которые изменены в гиппокампе физиологию и, хотя некоторые побочные эффекты от введения BrdU может быть неизбежным, наш экспериментальный протокол был разработан, чтобы ограничить некоторые из этих осложнений путем инкубации ткани с тимидина аналогов для 2 ч. Кроме того, мы решили использовать CldU вместо ВДУ потому что он показал лучшую растворимость, чем ВДУ при подготовке инкубационного раствора. Хотя протокол 3 день может быть полезен для некоторых экспериментальных конструкций, например, максимизации маркировки пролиферирующих клеток, этот протокол 2 ч имеет преимущество широтно-маркировки относительно небольшой населеции клеток, которые могут быть изучены в нужное время выживания (рис 2б).
Сравнивая уровень нейронов производства после двух различных методов ВДУ применения, Намба и др. Внесли важный вклад в методы маркировки в органотипических культур срез 37. Авторы сравнению внутрибрюшинно (IP) инъекции BrdU (50 мг / кг) в день постнатального 5 (P5) крыс с культур в пробирке, получивших культуральную среду, содержащую 1 мкМ BrdU в течение 30 мин сразу после эксплантации ткани. Они сообщают, статистически значимой разницы между в естественных условиях и в начале пробирке инъекций BrdU в культуре ткани. Авторы не представляем четкие изображения с изложением гиппокампа структуру, но они сообщают BrdU иммунореактивности в процентах от общего числа клеток в гранулах слоя клеток. В то время как они используют стереологической счета, обеспечивая меру площади или объема было бы полезно. В целом, Приведенные исследования дают органотипической культуры, как тщательно подробно послеродовых гиппокампа культур ломтик, с приложениями для изучения нейрогенеза и фармакологических возмущений. При использовании этого метода, срезы гиппокампа может поддерживаться в течение до 21 дней в пробирке (DIV), и препараты могут быть добавлены к среде в любой момент периода культивирования для изучения влияния на нейрогенез.
Наша цель в том, чтобы маркировать дискретный, относительно однородное население РСК с краткого "импульса" Применение CldU в течение 2 ч. Одно из наиболее часто используется стратегия для изучения нейрогенеза включает в себя идентификацию созревания этапе нейрона с помощью иммуногистохимического окрашивания для различных эндогенных маркеров с аналог тимидина. Конфокальной и флуоресцентной микроскопии подтвердили наличие ядер, входящих в аналог тимидина CldU и поэтому были активно проходящих митоз в период культуры. Рисунок 2 в естественных может быть адаптирована для срез культуры.
В частности, широко используемый метод нейрогенеза исследования для выполнения иммуногистохимического окрашивания для ассоциированный с микротрубочками белок, DCX, который преимущественно экспрессируется в незрелых нейронов из 3-21 день и зрелого нейронов маркер, кальбиндин (CaBP), который полностью выражается следующей 28 дней после митоза. Фенотип CldU + клеток определяли с помощью этих эндогенных маркеров 26.
Усовершенствованные методы для поддержания срез культуры в течение более длительного периода времени может иметь дополнительное преимущество позволяет более CldU + нейроны, чтобы достигнуть зрелого, CaBP + сцены. В настоящее время, одно ограничение подхода Органотипической культуры в том, что ткань непрерывно изменяется во время периода культивирования. Например, сразу после гиппокампа рассечение и покрытие срезов, TiСГУП имеет ширину примерно 400 мкм. Тем не менее, через 2-3 недели в инкубационной камере, кусочки ткани начнет тонкие, что приводит к конечной ширины между 250-350 мкм. Это ограничивает количество ткани, которые могут быть использованы для иммуногистохимического и следует учитывать при планировании, сколько животных для использования в проекте. Дополнительные исследования помогут охарактеризовать функциональные изменения в гиппокампе физиологии, которые происходят в пробирке.
Протокол для секционирования и окрашивания срезах гиппокампа был разработан для анализа клеточных и морфологические изменения, происходящие в период культивирования. Срез культуры дают возможность испытать воздействие различных фармакологических агентов, а гиппокампа РСК пройти через различные стадии развития во время созревания и представляют собой ценный инструмент для будущих исследований нейрогенез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | Hazardous, Carcinogenic |
| Cell culture inserts, 30 mm diameter, 0.4 µm pore size | Thermo scientific | 140660 | Nuclon delta coating on these inserts provides better tissue adhesion and improves slice quality. |
| Conical Centrifuge tubes (sterile) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissector scissors (angled to side) | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Gibco | 11095; liquid | Store at 4 °C |
| Eclipse Ni-U fluorescent microscope | Nikon | ||
| Glue for tissue | Krazy Glue | KG585 | Use minimum amount of glue to achieve adhesion as any tissue exposed to glue will be unusable for IHC. |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | Store at 4 °C |
| Horse Serum Heat Inactivated (500 ml) | Gibco | 16050-122 | Make 50 ml aliquots and store at -20 °C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modified glass pipettes (bottom of Pasteur pipette removed and edge smoothed with Bunsen flame) | |||
| Petri Dish (100 mm x 15 mm) and (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875712 and FB0875713A | |
| Scalpel blades #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Serological Pipettes | Sorfa Medical Plastic Co. | P8050 | |
| Standard Pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Sterile vacuum filter | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14054-13 | |
| Syringe driven filter unit | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Tissue chopper with moveable stage | Stoelting | 51425 | |
| Fine tip paintbrush |
References
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Opitz-Araya, X., Barria, A.
- Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
- Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
- Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
- Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
- Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
- Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
- Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
- Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
- Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271 (2012).
- Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
- Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
- Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H.
- Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
- Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
- Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
- Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
- Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409 (2006).
- McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
- Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
- Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
- Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
- Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
- Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
- Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
- Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).
