Summary
Комета анализ измеряет разрывы ДНК, индуцированных различными факторами. Если все эти факторы (за исключением окислительного стресса), вызывающие повреждение ДНК поддерживаются постоянными, количество повреждений ДНК является хорошим косвенным показателем оксидативного стресса. Цель этого протокола заключается в использовании кометы анализа для косвенного измерения окислительного стресса.
Abstract
Высших эукариот не могут жить без кислорода; Тем не менее, как это ни парадоксально, кислород может быть вредным для них. Молекула кислорода химически относительно инертны, потому что он имеет два неспаренных электронов, расположенных в разных р * Anti-связывающих орбиталей. Эти два электрона имеют параллельные спины, означает, что они вращаются в одном направлении вокруг собственных осей. Поэтому молекулы кислорода не очень реактивной. Активация кислорода может происходить по двум различным механизмам; либо за счет сокращения через одного электрона в момент времени (снижение) одновалентного или через поглощения энергии, достаточной, чтобы изменить спин одного из неспаренных электронов. Это приводит к продукции активных окислительных видов (ROS). Есть несколько способов, в которых человеческое тело устраняет ROS в физиологическом состоянии. Если АФК превышает емкость ремонт, окислительные результаты стресс и повреждения различных молекул. Есть много различных методов, с помощью которых окислительный стресс может быть мнеasured. Эта рукопись фокусируется на одном из методов, названных клеток гель-электрофорез, также известный как "кометы" анализа, который позволяет измерять разрывов ДНК. Если все факторы, как известно, вызывают повреждение ДНК, кроме окислительного стресса остаются постоянными, количество повреждений ДНК измеряли комет является хорошим показателем оксидативного стресса. Принцип прост и основывается на том, что молекулы ДНК отрицательно заряженной. Нетронутыми молекула ДНК имеет такой большой размер, чтобы он не мигрировать при электрофорезе. Разрывы ДНК, тем не менее, если они присутствуют в результате более мелкие фрагменты, которые перемещаются в электрическом поле к аноду. Небольшие фрагменты мигрируют быстрее. Как фрагменты имеют различные размеры конечный результат электрофореза не отличается линия, а континуум с формой кометы. Система позволяет количественно определить в результате "Комета" и, таким образом, из разрывов ДНК в клетке.
Introduction
Комет была впервые разработана шведскими учеными Остлинг и Йохансон 1. ДНК отрицательно заряженные молекулы. Во время электрофореза мелкие, поврежденные фрагменты ДНК движутся быстрее в сторону положительно заряженному аноду 2. Меньше фрагменты ДНК, быстрее их миграция к аноду, образуя характерный «комету» с «головы», состоящей из целой, неповрежденной ДНК и "хвост", состоящий из поврежденных фрагментов ДНК 3. Поврежденные ДНК могут быть устранены путем различных механизмов в организме 4, которые держат поколение разрывов ДНК достаточно сбалансированным 5. Если, однако, баланс в пользу разрывов ДНК, разрывы могут накапливаться и в конечном счете, будет способствовать развитию заболевания.
Наша ДНК страдает примерно 0.000165% урона в данный момент времени 6. Одноцепочечной разрывы ДНК см дефекта на одном из двух нитей двойной спирали ДНКв то время как двухцепочечные разрывы ДНК возникают, когда обе нити двойной спирали ДНК повреждены. Существуют различные факторы, которые могут увеличить количество разрывов ДНК в данный момент времени, такие как возраст клетки, сигаретного дыма, различных препаратов или окислительным стрессом 7-9. Если все факторы, ведущие к повышенной разрывов ДНК остаются постоянными, то количественное определение разрывов ДНК с помощью комет является хорошим косвенным показателем оксидативного стресса.
Метод комет чаще используется сегодня в медицине, включая офтальмологии. Одной из причин этого является то, что окислительный стресс является более признается в качестве патогенетической механизма для различных заболеваний и 8-11 комет является одним из методов, с которой окислительный стресс косвенно может быть определена количественно.
Protocol
Исследования комет, проведенные в университете Базеля, Кафедра офтальмологии были одобрены локальными этическими комитета Базеле
1. Подготовка реагентов
- Подготовка Дульбекко фосфатный буферный физиологический раствор (PBS) (Ca ++, Mg ++ бесплатно) решение, добавив PBS (1 л) и пакет 990 мл дН 2 O в средствах массовой информации. Доводят рН до 7,4. Хранить при комнатной температуре.
- Готовят лизирующий раствор: Для приготовления 1000 мл добавить 2,5 М NaCl (146,1 г), 100 мМ ЭДТА (37,2 г) и 10 мМ Trizma базу (1,2 г) в дН 2 O.
- Подготовка электрофореза буфер (300 мМ NaOH / 1 мМ ЭДТА), добавив 30 мл 10 М NaOH и 7,5 мл 0,2 М ЭДТА, QS 1500 мл дН 2 O и хорошо перемешать. Общий объем зависит от способности гель коробки. Перед использованием измерения рН буфера для обеспечения рН> 13.
- Подготовка нейтрализации буфера, содержащего 0,4 М Трис (48,5 г добавляют к ~ мл 800 дН 2 O, доведения рН до 7,5), концентрируют (& #62; 10 М HCl) в 1000 мл с дН 2 O. Хранить раствор при комнатной температуре.
- Подготовка окрашивания раствора. Чтобы бромистый этидий (EtBr; 10x складе, 20 мкг / мл) добавляют 10 мг EtBr в 50 мл дН 2 O и хранить при комнатной температуре. Для 1x складе - смешать 1 мл с 9 мл дН 2 O. Осторожны! Ручка EtBr с адекватной меры предосторожности, как это известный канцероген.
2. Выделение лейкоцитов
- Получение образцов крови человека (20 мл) с антикоагулянтом, такие как гепарин с помощью венозного прокол.
- Отдельные лимфоцитов с использованием сепаратора клеток в градиенте плотности, такие как Histopaque.
- Кратко, разбавленные кровь в соотношении 1: 1 с PBS или RPMI (без FBS) и слоя над 600 мкл жидкости сепаратора клеток.
- Центрифуга 1800 мкг в течение 20 мин при 4 ° С. Аспирируйте слой '' Баффи в 3-5 мл PBS / RPMI и центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин для осаждения лимфоциты.
- Получить лимфоциты из всего выше границы между PBS (RPMI) И сепаратор клеток жидкости, используя пипетку. Удалить лейкоцитов полосы от поверхности раздела между плазмой и жидких слоев сепаратора клеток в каждую пробирку и собирать в один 50 мл трубки.
- Довести общий объем до 50 мл с холодной Игла в модификации Дульбекко (DMEM). Промыть клеточной суспензии три раза DMEM при 300 х г в течение 10 мин.
- Подсчитать общее число клеток с использованием гемоцитометра. Приостановить клеток в PBS и aliquote в микропробирок на 10 7 клеток / пробирку.
- Пипеткой 0,4 мл клеток в 5 мл пластиковые одноразовые трубки. Добавить 1,2 мл 1% легкоплавкий агарозы при 40 ° С. Смешайте и быстро и пипеткой 1,2 мл клеточной суспензии на агарозном покрытые поверхности предварительно покрытой слайда. Избегайте производить пузыри.
- Разрешить агарозы, чтобы гель около 2 мин. Согласовываться с временем и температурой, используемой для гелеобразования, и обеспечить, чтобы агарозном полностью установлены до погружения в раствор для лизиса. После полного летET, погрузиться в лизирования решение в ~ 4 ° C.
3. Лизис и электрофорез
Примечание: Эта процедура описана для электрофореза при рН> 13 щелочных условиях.
- После по меньшей мере 2 ч при ~ 4 ° С, осторожно удалить слайды из лизирующим решения. Место скользит бок о бок на поле горизонтальной гель на одном конце, сдвинув их ближе друг к другу, насколько это возможно.
- Заполните буферные резервуары с свежеприготовленный рН> 13 буфер для электрофореза, пока уровень жидкости полностью не покрывает слайды (избежать пузырей более агарозы).
- Пусть скользит сидеть в щелочной буфер в течение 20 мин, чтобы позволить для раскручивания ДНК и экспрессии щелочно-лабильной повреждений.
- Включите питания до 25 вольт (~ 0,75 В / см) и отрегулируйте ток 300 мА, повышая или понижая уровень буфера. Electrophorese слайды в течение 30 мин.
- Выключите питание. Аккуратно поднимите слайды из буфера и ркружева на подносе слива. По каплям пальто слайды с нейтрализации буфера. Разрешить слайды сидеть, по крайней мере 5 мин. Слейте слайды и повторите еще два раза.
- Пятно слайды с 80 мкл 1x бромид этидия (EtBr) и оставить на 5 мин, а затем окунуться в охлажденном дистиллированной водой, чтобы удалить избыток пятно. Затем поместите покровное над горкой и сразу сохранять их. Магазин слайды в течение месяца при комнатной температуре в сухом месте.
Примечание: Другие пятна ДНК (например, SYBR-зеленый) также могут быть использованы. Внимание! носить защитные перчатки, как большинство красители мутагенными свойствами.
4. Количественное определение разрывов ДНК
- Для визуализации повреждений ДНК, наблюдать EtBr-окрашенных слайд ДНК под 40х объективной флуоресцентного микроскопа.
- Оценка повреждения ДНК количественно в клетках путем измерения длины миграции ДНК и процент перенесенной ДНК (фиг.1А). Количественно повреждения ДНК (рис 1B) по настоящее время задка и оливкового Momeнт. Определения хвост момент и оливкового -Moment ранее было дано 8-10.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем опыте это достаточно придерживаться одного из параметров. Клетки фотографировали, установив автоматизированный инструмент, который сканирует над микроскопом слайд и фотографии клеток. Количественное определение разрывов ДНК может быть сделано с помощью пакетов программного обеспечения для анализа изображений. Есть несколько различных пакетов программного обеспечения, которые на заказ, чтобы сделать снимок клеток и количественно повреждение ДНК. Мы рекомендуем использовать один и тот же пакет программного обеспечения на протяжении всего эксперимента. Лаборант определяет интактных клеток или комета будет забил на компьютер и нажимает мышью на нем. Комета или интактных клеток затем автоматически забил.
Representative Results
Хотя метод комет делает воспроизводимые результаты, это может зависеть от множества факторов. Одним из таких факторов является ли или нет лейкоциты крионированным до лизиса и гель-электрофореза или это шаг выполняется на свежеприготовленные лейкоциты. Рисунок 2 показывает, что в группе 2, где лейкоциты КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ до лизису и гель-электрофореза ДНК SS- перерывы были значительно выше, чем в группе 1, где лизис и гель -electrophoresis было сделано на и свежеприготовленные клетки.
Анализ также может быть использован, чтобы косвенно оценить системную окислительный стресс. Таблица 1 показывает, описательная статистика для момент дверь задка и момента оливково у курильщиков и здоровых субъектов. Данные показывают, что курение половину пачки сигарет в день больше, чем в два раза оцДНК перерывы в оборотных лейкоцитов 9.
Рисунок 1. () Изображает микроскоп используется во время кометы пробирного анализа. (B), Δ изображен типичный "комету" с ярким головы и хвоста (повреждение мелких фрагментов ДНК). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. оцДНК разрывы были значительно выше, когда лейкоциты криоконсервации (группа 2), чем при свежеприготовленные лейкоциты были использованы до лизиса и гель-электрофореза.
Discussion
Шведские ученые Остлинг и Йохансон были первыми в своей области, чтобы использовать кометы анализа количественно повреждение ДНК в клетках 1. В нейтральных условиях, что две ученые использовали, однако, разрешено только обнаружение двухцепочечных разрывов ДНК. Сингх и др. Позже адаптирована для анализа для использования щелочных условиях, который произвел чувствительный вариант, который может оценивать двухместные и одноцепочечной разрывы ДНК и выявления щелочно-лабильные сайты 12. С момента своего первоначального развития, анализ был изменен на различных этапах, чтобы сделать его пригодным для оценки типов повреждений ДНК в различных типах клеток 13-15.
Как и со всеми методами, обращая строгое внимание на технические детали важно для получения точных результатов 16. Основываясь на нашем опыте, наилучшие результаты получаются, если каждый методологический шаг от приготовления раствора до кометы количественное-осуществляется экспертной лаборатории технicians. Использование свежей и правильно подготовленной информации, адекватных методов пипеток, точного времени и (как уже упоминалось ранее в разделе результатов) с использованием свежеприготовленных лейкоцитов необходимы для того, чтобы лизиса и электрофореза в геле, чтобы получить точные результаты 17.
Все отдельные шаги в этом анализе одинаково важны для получения достоверных результатов. 16 В целом лучшие результаты получаются, если каждый методологический шаг от приготовления раствора до кометы количественного осуществляется экспертной лаборатории technicians.Important кажется использование свежих и правильно подготовленных СМИ адекватные методы пипетки, точные сроки и, как уже говорил в разделе результатов использования свежеприготовленных лейкоцитов для лизиса и гель-электрофореза для получения адекватных результатов от анализа 17.
Как и другие методологии, комета техника тест имеет свою AdvanTages и недостатки. Будучи чувствительным методом, анализ уязвима для факторов (например, УФ-светом), которые можно было бы повысить разрывы ДНК и, таким образом, влияют на результаты. Любой фактор, который может усиливать окислительный стресс, за исключением того, что в настоящее время исследованы, следует избегать. Стресс может увеличить уровень окислительного стресса не только в лейкоцитах, но и во всех других средах крови и лимфоцитов. Как уже упоминалось ранее, существует много различных и более прямые способы измерения окислительного стресса 18,19. Комет является одним из многих методов, которые имеет определенные преимущества. Они включают в себя его относительно низкую стоимость, небольшое количество клеток, необходимых (<10000 клеток) и, таким образом небольшие образцы крови, необходимые на пациента, в относительно короткий период времени, необходимый для количественного повреждение ДНК в клетках (приблизительно 3 дня), его чувствительность и его широкое распространение применимость к повреждению ДНК ослов в различных клеточных типов. В прошлом мы решили работать с лейкоцитами, так как мы имели опыт с этимтипа клеток, и это было применимо для конкретного исследования планировалось. Еще одно преимущество кометы анализа является то, что он может быть использован для обнаружения различных типов и уровней повреждений ДНК и, таким образом, может применяться в различных других областях исследований, кроме окислительного стресса, таких как репарации ДНК исследований, испытаниях добавок или генотоксичность исследований.
Окислительный стресс в настоящее время признается играет решающую роль в патогенезе нескольких заболеваний. Метод комет, в то время как один из многих способов измерения оксидативного стресса 18,19, является относительно простым, универсальным и недорого. Когда освоил, этот метод может быть использован во всех областях медицины, в котором окислительный стресс играет роль 8-10,20,21.
Disclosures
Ни.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить LHW Stiftung, в Тризен Лихтенштейна, финансовую поддержку наших исследований на окислительный стресс.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
| Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
| Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
| Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
| Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
| Trizma Base | Spectrochem | ||
| Materials required for gel electrophoresis | |||
| Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
| Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
| Methanol - Qualigens | |||
| Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
| Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
| Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
| Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides | |||
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Phillips, J. L., Singh, N. P., Lai, H. Electromagnetic fields and DNA damage. Pathophysiology. 16 (2-3), 79-88 (2009).
- Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell Biol Toxicol. 25 (1), 5-32 (2009).
- Aiub, C. A., Pinto, L. F., Felzenszwalb, I. DNA-repair genes and vitamin E in the prevention of N-nitrosodiethylamine mutagenicity. Cell Biol Toxicol. 25 (4), 393-402 (2009).
- Bartsch, H., Nair, J. Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair. Langenbecks Arch Surg. 391 (5), 499-510 (2006).
- Martin, L. J. DNA damage and repair: relevance to mechanisms of neurodegeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 67 (5), 377-387 (2008).
- Choy, C. K., Benzie, I. F., Cho, P. UV-mediated DNA strand breaks in corneal epithelial cells assessed using the comet assay procedure. Photochem Photobiol. 81 (3), 493-497 (2005).
- Mozaffarieh, M., et al. Comet assay analysis of single-stranded DNA breaks in circulating leukocytes of glaucoma patients. Mol Vis. 14, 1584-1588 (2008).
- Mozaffarieh, M., Konieczka, K., Hauenstein, D., Schoetzau, A., Flammer, J. Half a pack of cigarettes a day more than doubles DNA breaks in circulating leukocytes. Tob Induc Dis. 8 (14), (2010).
- Mozaffarieh, M., Schotzau, A., Josifova, T., Flammer, J. The effect of ranibizumab versus photodynamic therapy on DNA damage in patients with exudative macular degeneration. Mol Vis. 15, 1194-1199 (2009).
- Pertynska-Marczewska, M., Merhi, Z. Relationship of Advanced Glycation End Products With Cardiovascular Disease in Menopausal Women. Reprod Sci. , (2014).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells). Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).
- Gaivão, I., Sierra, L. M. Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives. Front Genet. 5, 304 (2014).
- Zhang, J., et al. DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients. Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).
- Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesné, C., Fessard, V. Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity. Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).
- Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. H. Validation of the comet-X assay as a pharmacodynamic assay for measuring DNA cross-linking produced by the novel anticancer agent RH1 during a phase I clinical trial. Cancer chemotherapy and pharmacology. 60, 851-861 (2007).
- Moller, P., Moller, L., Godschalk, R. W., Jones, G. D. Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group. Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).
- Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress. BioMed Res Int. , 157-547 (2013).
- Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus. Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).
- Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station. Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).
- Cabarkapa, A., et al. Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes. Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).
