Introduction
A capacidade de utilizar em sistemas modelo in vitro melhorou substancialmente nos domínios da neurobiologia e as neurociências. Células em cultura fornecer uma plataforma eficiente para caracterizar a funcionalidade de proteínas e mecanismos moleculares subjacentes fenômenos específicos, para entender a patologia de doenças e infecções, e para realizar avaliações preliminares de testes de drogas. In Neurobiology, os principais tipos de modelos de culturas de células neuronais primárias incluem culturas derivadas de ratos e murganhos, e linhas celulares de neuroblastoma, tais como células B35 de rato 5, Neuro-2A 6, células de rato, e células PC12 de rato 7. Embora a utilização de tais linhas celulares tem avançado de forma significativa do campo, há vários factores de confusão associados com a manipulação de células e de tecidos não-humanos. Estes incluem espécies específicas compreender as diferenças nos processos metabólicos, fenótipos de manifestação da doença e patogênese quando comparado aos seres humanos. É também importante notar que are diferenças significativas entre mouse e expressão do gene humano e sinalização fator de transcrição, destacando as limitações dos modelos de roedores e a importância de compreender as vias metabólicas que são conservadas entre roedores e humanos 8-11. Outros têm utilizado o uso de linhas de células neuronais humanos, incluindo o N-Tera-2 (NT2), linha celular de teratocarcinoma humano e células estaminais pluripotentes indutíveis (iPSCs). Estas linhas celulares fornecem bons modelos para sistemas in vitro humanos. No entanto, a diferenciação de células NT2 com ácido retinóico (RA) resulta na geração de uma população mista de neurónios, astrócitos e células gliais radiais 12, que necessitam de um passo de purificação adicional para obtenção de populações puras de neurónios. Além disso, as células NT2 demonstrar um cariótipo altamente variável 13, com maior do que 60 cromossomas em 72% das células. iPSCs demonstram a variabilidade na diferenciação entre as diferentes linhas de células e diferenciação variar em eficiência 14. Por conseguinte, é desejável ter um modelo celular neuronal humana consistente e reprodutível para complementar estas alternativas.
SH-SY5Y células neuroblastos-like são um subclone da linha celular de neuroblastoma parentais SK-N-SH. A linha de células parental foi gerado em 1970 a partir de uma biópsia de medula óssea que contém as células epiteliais do tipo 15-neuroblastos como e. As células SH-SY5Y ter um cariótipo estável que consiste de 47 cromossomas, e podem ser diferenciados a partir de um estado de neuroblastos-como em neurónios humanos maduros através de uma variedade de diferentes mecanismos, incluindo o uso de AR, ésteres do forbol, e neurotrofinas específicas, tais como cérebro-derivado factor neurotrófico (BDNF). Antes evidência sugere que a utilização de diferentes métodos podem seleccionar para os subtipos de neurónios adrenérgicos específicos, tais como, colinérgico, e neurónios dopaminérgicos 16,17. Este último aspecto torna as células SH-SY5Y úteis para uma variedade de experiências de neurobiologia.
onteúdo "> Vários estudos notaram diferenças importantes entre as células SH-SY5Y em seus estados indiferenciados e diferenciadas. Quando as células SH-SY5Y são indiferenciadas, eles rapidamente proliferar e parecem ser não-polarizada, com muito poucos processos, curtos. Eles geralmente crescem em aglomerados e expressam marcadores de neurónios imaturos indicativos 18,19. Quando diferenciadas, estas células estender ramificada longa processos, a diminuição da proliferação e, em alguns casos polarizar 2,18. As células SH-SY5Y completamente diferenciadas foram anteriormente demonstrado para expressar um variedade de diferentes marcadores de neurónios maduros incluindo proteína associada ao crescimento (GAP-43), núcleos neuronais (NeuN), sinaptofisina (SYN), sináptica proteína vesicular II (SV2), a enolase específica neuronal (NSE) e microtúbulos proteína associada (MAP) 2,16,17,20, e a falta de expressão de marcadores gliais, tais como a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) 4. Em mais apoio diferenciadas que as células SH-SY5Y represeNT uma população neuronal homogénea, a remoção de BDNF resulta em apoptose celular 4. Isto sugere que a sobrevivência de células SH-SY5Y diferenciadas é dependente de factores tróficos, semelhantes a neurónios maduros.Utilização de células SH-SY5Y aumentou desde o subclone foi estabelecida em 1978 3. Alguns exemplos da sua utilização incluem a investigação da doença de Parkinson 17, a doença de Alzheimer 21, e a patogénese da infecção virai, incluindo poliovírus 22, enterovírus 71 (EV71) 23,24 , vírus da varicela-zoster (VZV) 1, citomegalovírus humano 25, e vírus do herpes simplex (HSV) 2,26. É importante notar que diversos estudos utilizando células SH-SY5Y foram utilizadas estas células na sua forma indiferenciada, especialmente no campo da neurovirology 27-36. A diferença no fenótipo observado de indiferenciada contra células SH-SY5Y diferenciadas levanta a questão de wheterap a progressão da infecção observada seria diferente em neurónios diferenciados maduros. Por exemplo, as células SH-SY5Y diferenciadas têm uma maior eficiência de HSV-1 captação versus, em proliferação células SH-SY5Y indiferenciadas, que pode ser devido a uma falta de receptores de superfície que ligam o HSV e modulam a entrada em indiferenciadas células SH-SY5Y 2. Portanto, é fundamental que ao projetar um experimento voltado a testar os neurônios in vitro, as células SH-SY5Y deve ser diferenciada a fim de obter os resultados mais precisos para a tradução e comparação de modelos in vivo.
O desenvolvimento de um método confiável para gerar culturas neuronais humanos é imperativo para permitir que os investigadores para realizar experimentos tradução que modelar com precisão o sistema nervoso humano. O protocolo aqui apresentado é um processo que delineia as melhores práticas derivadas de métodos anteriores 1-4 para o enriquecimento em neurónios humanos que são diferenciadosutilizando ácido retinóico.
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Protocol
1. Considerações Gerais
- Veja a Tabela de materiais / equipamentos para uma lista de reagentes necessários. Execute todas as etapas sob condições assépticas rigorosas.
- Use de soro fetal bovino inactivado pelo calor (hiFBS) para todos os meios de comunicação que incluem preparações de FBS. Para aquecer-inactivate, aquecer uma aliquota de 50 ml de FBS a 56 ° C durante 30 min, invertendo a cada 10 min (ver também a Tabela 1).
Nota: Quando é utilizado FBS sem calor inactivação, o fenótipo epitelial semelhante progride mais rapidamente ao longo culturas de células SH-SY5Y. - Antes de usar, permitem meios de comunicação para aquecer e equilibrar em uma incubadora de estabelecer um equilíbrio pH adequado antes de cada etapa. Por exemplo, 50 ml de meio leva aproximadamente uma hora para equilibrar completamente (pH 7, 37 ° C, 5% CO 2).
Nota: Este protocolo utiliza um processo de fraccionamento em dois passos que requer as células SH-SY5Y diferenciadas parcialmente a ser tratadas com tripsina e re-plaqueadas. Este é um estressanteProcesso para estas células excepcionalmente frágeis. Portanto, é importante para incubar as células em tripsina para uma quantidade mínima de tempo. Isto irá permitir a preferencial lift-off de neurónios, deixando as células epiteliais, como ainda ligado ao prato. - Realizar a trituração de células diferenciadas lentamente com uma pipeta de plástico de 10 ml com a ponta contra a parte inferior do tubo cónico contendo as células. Execute trituração em uma velocidade lenta, para cima e para baixo não mais do que cinco vezes.
2. A passagem de Culturas de manutenção SH-SY5Y
- culturas de manutenção de divisão quando as células atingiram 70-80% de confluência, e não excedem 10 a 15 passagens. As culturas tipicamente necessitam de ser passadas a cada 3-5 dias (culturas assumindo que não são diluídos mais do que 5 vezes durante splitting).
- Para células passagem de um frasco T-75, aspirar fora da mídia, em seguida, enxaguar com aproximadamente 10 ml de 1x PBS.
Nota: Não é recomendável dividir o SH-SY5Y culturas de manutenção further de 1: 5 durante a passagem em porque isso pode fazer com que as células a morrer devido ao baixo confluência. - Aspirar PBS, e em seguida, adicionar 2,5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (1x).
- Incubar numa incubadora 2-3 min e ponta suavemente para libertar as células da superfície do frasco.
- Adicionar 10 ml de mídia básico do Crescimento (ver Tabela 2) e triturar 1-2 vezes.
- Spin down por 2 min a 1000 xg, meios aspirado, em seguida, ressuspender sedimento em 5 ml Crescimento mídia Basic.
- Dilui-se as células a partir de 1: 3 a 1: 5 num volume total de 20 ml para revestimento normal no balão T-75, ou de contar e placa de diferenciação (ponto 5).
3. Congelamento células SH-SY5Y
- Congelar passagens precoces de células de neuroblastoma SH-SY5Y em crescimento básico de meios suplementados com 5% (v / v) de DMSO.
- Inicialmente, congelar alíquotas a -80 ° C durante 24 hr, em seguida, transferir para azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo.
Nota: Para referência, um confluentes (75-85%) T-75 frasco irá produzir cincoAlíquotas de 1 ml de células SH-SY5Y para congelamento. Cada uma destas alíquotas deve conter de 2-5 milhões de células totais.
4. As células Thaw e Cultura indiferenciado SH-SY5Y de neuroblastoma
- Prepare mídia básico Crescimento.
- Descongelar rapidamente células congeladas num banho de água a 37 ° C (cerca de 2 min).
- Ressuspender as células em 9 ml Crescimento de mídia básico em um tubo de 15 ml, e em seguida, centrifugar por 2 min a 1.000 x g.
- Aspirar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar as células peletizadas e células delicadamente ressuspender em 10 ml Crescimento mídia Basic.
- Células da placa em um frasco T-25 ou 60 mm2 prato.
- No dia seguinte, substituir meios para remover as células mortas.
5. Dia 0: cultivar células para Diferenciação
- Ver Figura 1 para a programação de diferenciação.
- Lavar as células indiferenciadas com 1x PBS, aspirado, e depois trypsinize usando 1-2 ml aquecido1x 0,05% de tripsina-EDTA.
- Quando as células estão em tripsina, incubar durante aproximadamente 3 min num incubador.
- Extingue-se a tripsina por adição de 10 ml de meio de crescimento básico, lavar as paredes do frasco ou prato, e triturar suavemente 1-3 vezes. Transferir o conteúdo para um tubo cônico de 15 ml.
- Centrifugar por 2 min a 1000 xg, e aspirar os meios de comunicação, tomando cuidado para não perturbar o sedimento.
- Ressuspender sedimento em 5 ml Crescimento de mídia básico e triturar 1-3 vezes.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro, depois dilui-se com meio de crescimento básico a 50.000 células / ml.
- Placa 2 ml de células por 35 mm2 prato para um total de 100.000 células por prato e coloque de volta para incubadora.
6. Dia 1: Mudar mídia (Diferenciação de mídia # 1)
- Alíquota de 50 ml de diferenciação Meios # 1 (ver Tabela 2) e incuba-se em um banho de água a 37 ° C.
- Quando a mídia é aquecido, permitir que ele atinja o equilíbrio em uma incubadora (37° C, 5% CO 2) durante pelo menos uma hora para estabelecer um equilíbrio do pH antes da utilização.
- Adicionar ácido retinóico (RA) (ver Tabela 1) aquecido e media equilibrada imediatamente antes de adicionar mídia para pratos.
Nota: O ácido retinóico é sensível à luz e deve ser armazenado em frascos escuros a 4 ° C - Aspirar cuidadosamente off velha mídia e descarte.
- Adicionar 2 ml de Diferenciação de mídia # 1 com RA por 35 mm2 prato e retornar à incubadora.
7. Dia 3: Mudança de mídia (Diferenciação de mídia # 1)
- Repita a Seção 6 (passos 1-5)
8. Dia 5: Mudar mídia (Diferenciação de mídia # 1)
- Repita a Seção 6 (passos 1-5)
9. Dia 7: Dividir células de 1: 1
- Adicionar RA a aquecido e equilibrada Diferenciação de mídia nº 1 imediatamente antes de adicionar mídia para pratos.
- Aspirar cuidadosamente off velha mídia e descarte.
- Adicionar 200 ulaqueceu-se 0,05% de EDTA 1x tripsina por 35 milímetros e dois prato quente na incubadora aproximadamente 2-3 minutos ou até que as células são visivelmente levantada a partir da placa, como observado sob um microscópio.
- Extingue-se a tripsina por adição de 2 ml de mídia Diferenciação # 1 com RA por 35 mm2 prato e usar a mídia para lavar restantes células neuronais lado da placa. Em seguida, transferir o conteúdo para um tubo cônico de 50 ml.
Nota: Durante a tripsinização passos, não trypsinize muitos pratos ao mesmo tempo. Isto ajuda a assegurar culturas neuronais não são incubados em tripsina durante demasiado tempo, que pode ser citotóxica. - Juntar o conteúdo de até 10 pratos no tubo de 50 ml e gentilmente triturar lentamente para cima e para baixo não mais do que cinco vezes com uma pipeta de plástico de 10 ml.
- Aliquota de suspensão de células de 2 ml em fresco de 35 mm pratos 2 e retornar à incubadora.
10. Dia 8: Mudar mídia (Diferenciação de mídia # 2)
- Adicionar RA (veja <strong> Tabela 1) aquecido e equilibrada mídia imediatamente antes de adicionar mídia para pratos.
- Aspirar cuidadosamente off velha mídia e descarte.
- Adiciona-se lentamente 2 mL de Diferenciação conteúdo # 2 (ver Tabela 2) com AR por 35 mm2 prato e retorno à incubadora. Não permitem neurónios para ser exposta ao ar por um período prolongado de tempo que pode secar rapidamente.
11. Dia 9: Prepare Matriz Extracelular (ECM) placas revestidas
- Descongelar um frasco de solução de ECM no gelo e diluir 1: 100 em DMEM frio.
- Dispensar 2 mL de mistura em cada 35 milímetros prato 2 e assegurar que toda a base do prato é coberto.
- Coloque dentro de uma incubadora (37 ° C, 5% CO 2) durante 1 hora ou durante a noite.
- mistura Aspirar e deixar secar ao ar durante aproximadamente 1 hora em uma capa. Armazenar à temperatura ambiente por até 2 meses.
12. Dia 10: Transferência de células nasECM placas revestidas com 1: 1
- Adicionar RA (ver Tabela 1) aquecido e media equilibrada imediatamente antes de adicionar mídia para pratos.
- Aspirar cuidadosamente off media e descarte.
- Adicionar 200 ul de tripsina a cada aquecido 35 milímetros prato 2 e deixa-se incubar à temperatura ambiente durante cerca de 1-2 minutos, ou até que os neurónios são visivelmente levantado do prato como observado sob um microscópio.
Nota: Executar esta etapa tripsinização à temperatura ambiente de modo a não sobre-incubar neurônios com tripsina e causar danos. Neurônios liberar a partir de placas muito mais rápido do que as células epiteliais-como nesta fase. - Extingue-se a tripsina por adição de 2 ml de mídia Diferenciação # 2 por 35 mm2 prato e usar a mídia para lavar restantes células neuronais lado da placa. Em seguida, transferir o conteúdo para um tubo cônico de 50 ml.
- Juntar o conteúdo de até 10 pratos no tubo de 50 ml e gentilmente triturar lentamente para cima e para baixo não mais do que cinco vezes comuma pipeta de plástico de 10 ml.
- Dispensar 2 ml de suspensão de células em pratos de 35 mm revestidos por dois ECM e retornar à incubadora.
13. Dia 11: Mudança de mídia (Diferenciação de mídia # 3)
- Adicionar RA (ver Tabela 1) aquecido e media equilibrada imediatamente antes de adicionar mídia para pratos.
- Aspirar cuidadosamente off velha mídia e descarte.
- Adiciona-se lentamente 2 ml de Diferenciação conteúdo # 3 (ver Quadro 2) com RA por 35 milímetros prato 2 e retornar à incubadora. Não permitem neurónios para ser exposta ao ar por um período prolongado de tempo.
14. Dia 14: Mudança de mídia (Diferenciação de mídia # 3)
- Repita a Seção 13 (passos 1-3)
15. Dia 17: Última mídia Change (Diferenciação de mídia # 3)
- Repita a Seção 13 (passos 1-3)
16. Dia 18: culturas neuronais pronto para usar
- Mudar mídia para Diff frescoerentiation conteúdo # 3 com RA a cada 3 dias para manter a saúde neurónio.
Nota: As células devem ser diferenciadas em neurônios e apresentam um fenótipo neuronal. As culturas são tipicamente estáveis durante até 14 dias após a diferenciação terminal, no entanto a duração da viabilidade neuronal é dependente do número de passagem das células indiferenciadas no início da diferenciação. números passagem maior rendimento neurônios diferenciados com uma vida útil mais curta.
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Representative Results
Neste momento, existem muitos casos na área da neurobiologia e neurovirology onde as células SH-SY5Y indiferenciadas estão sendo usados como um modelo funcional para os neurônios humanos 27-36 e, mais importante, as células indiferenciadas podem não ter fenótipos, tais como a absorção viral óptima 2, que são necessário para a interpretação precisa. É crítico que, ao usar células SH-SY5Y ou qualquer outro sistema neuronal in vitro, as células são apropriadamente diferenciadas em neurónios, de modo a obter dados que é a melhor representação do possível o que pode estar a ocorrer em neurónios in vivo. Os rendimentos protocolo acima, altamente, culturas neuronais viáveis homogéneos diferenciados dentro de 18 dias, que podem ser usados para posterior análises bioquímicas e de imagem. Células de neuroblastoma SH-SY5Y indiferenciada demonstrar uma grande fenótipo, plana,-epitelial como com numerosos processos curtos que se estendem para o exterior (Figura 2A), enquanto célula diferenciadas possuem várias projeções neuríticas que ligam às células vizinhas (Figura 2B). É importante que quando a diferenciação de células SH-SY5Y, as células são incubadas com tripsina durante um período mínimo de tempo para assegurar que apenas os neurónios são libertadas a partir do prato. Isto deixa para trás as células epiteliais indiferenciadas que de outra forma contaminar a população de células neuronais diferenciadas. As características neuronais de células SH-SY5Y diferenciadas são totalmente demonstrada por meio de técnicas tais como a detecção de imunofluorescência de marcadores neuronais clássicos (Figura 3).
As células SH-SY5Y demonstrar uma variedade de fenótipos diferentes durante o curso da diferenciação e é importante ser capaz de identificar os neurónios saudáveis daqueles que são forçados. No dia 1 diferenciação, antes da introdução de diferenciação Meios # 1, as células têm um fenótipo plana, com retraída curto, processos curtos e grossos (Figura 4A).Após 5 dias de privação de soro, as células SH-SY5Y começar a desenvolver projecções mais longas e demonstram um fenótipo mais neuronal (Figura 4B). Passaging é um processo duro para células SH-SY5Y, e nos dias imediatamente seguintes passaging, as células aparecem insalubre. Isto é evidenciado pela aglomeração corpo celular ea presença de menos processos, mais curtos. (Veja as imagens anteriores: Figuras 4C e 4E, e depois de imagens: Figuras 4D e 4F). Cerca de 48 horas depois de uma separação, as células parecem se recuperar, e neurônios totalmente maduras, diferenciadas são obtidos no dia 18 (Figura 2B). Isto é evidenciado por uma redução na aglutinação corpo celular, e a extensão de numerosos fina, ramificado processos neuriticos que muitas vezes ligam às células vizinhas.
Fatores que são essenciais para a obtenção de culturas neuronais reprodutíveis e viáveis incluem o uso de FBS inativado pelo calor, minimizando tripsina de incubaçãotempo, e trituração suave. Importante, este protocolo detalha a utilização de quatro formulações diferentes meios de comunicação com várias concentrações de hiFBS, criando assim uma transição suave para um estado privadas de soro para as células. Quando as células SH-SY5Y maduros são saudáveis, eles demonstram inúmeras projeções que se conectam a neurônios circundantes (Figura 5A). Deve notar-se que um fenótipo epitelial diferenciado ultrapassará as culturas neuronais, se forem mal utilizado durante o processo de diferenciação (Figura 5B). Além disso, se os neurônios começam a morrer, neurites será recolhido, corpos celulares começará a se aglutinarem e arredondar para cima, e os restos de degeneração neurite vai começar a acumular-se e em torno de processos celulares. Este processo é semelhante ao que é demonstrado nas Figuras 5C e 5D. Enquanto a Figura 5C mostra uma progressão mais natural de morte celular após a privação de nutrientes e ambiental,A Figura 5D mostra os neurónios diferenciados SH-SY5Y 4 h após a infecção com uma estirpe de VHS-1, Cos, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 6 PFU. Este protocolo foi cuidadosamente otimizado no laboratório e produz reprodutível, populações homogêneas de neurônios, que são essenciais para as análises a jusante e experimentação.
Figura 1:. Horários do processo de diferenciação do processo de diferenciação consiste em 11 etapas espalhadas ao longo de um período de 18 dias. No primeiro dia do protocolo de diferenciação (dia 0), entre 25.000 e 100.000 células são plaqueadas em pratos de 35 mm não revestidos. Nos dias 1, 3 e 5, a velha mídia é removido e Diferenciação de mídia # 1 é aplicada. No dia 7, as células são divididas 1: 1 em pratos de 35 mm não revestidos na diferenciação Meios # 1. No dia 8, a mídia é alterado para DiferenciaçãoMeios # 2, e no dia 10, as células são novamente divididas 1: 1, mas desta vez em 35 pratos revestidos por ECM mm na diferenciação conteúdo # 2. Nos dias 11, 14 e 17, a velha mídia é removido e Diferenciação de mídia # 3 é aplicada. No dia 18, os neurônios diferenciados estão prontos para usar para aplicações a jusante.
Figura 2:. Aparência morfológica das células SH-SY5Y diferenciadas e indiferenciadas (A) células indiferenciadas SH-SY5Y têm um fenótipo plana com poucos enquanto projecções (B) neurónios diferenciados SH-SY5Y demonstrar projecções neuríticas extensas e alongadas. As imagens foram obtidas em fase com ampliação de 20x utilizando um microscópio de epifluorescência invertida.
Figura 3:Os marcadores de diferenciação neuronal. Imunofluorescência ilumina características neuronais de células SH-SY5Y diferenciadas completamente. (A) Anti-SMI31 (verde) mancha a neurofilamento H fosforilada na extensa rede de neurites. (B) anti-MAP2 (vermelho) etiquetas proteína associada a microtúbulos 2, revelando a soma neuronal e a porção proximal do neurites. imagem de fase correspondentes para cada painel de imunofluorescência é mostrado à direita. As imagens foram obtidas a 10X de ampliação utilizando um microscópio de epifluorescência invertida. barra de escala, 100 mm.
Figura 4: passos intermédios do protocolo de diferenciação (A) Dia 1 de diferenciação.. As células mantêm um fenótipo retraída com projecções curtas. (B) Dia 5 de diferenciação. As células foram expostas a 5 diass de privação de soro (Diferenciação de mídia # 1). As células sobreviventes começam a alongar e formam processos mais longos que se conectam com as células vizinhas. (C) Dia 7 de diferenciação antes de dividir. Células demonstram um elevado número de processos longos, com menor número de células que demonstram um fenótipo epitelial-like. (D) Dia 8 de diferenciação, um dia após a primeira passagem. Após a separação, os corpos celulares formar grumos e processos aparecem curta, como resultado do processo de passagens em. (E) Dia 10 de diferenciação, antes de dividir em placas revestidas com MEC. Células demonstrar processos mais longos que fazem conexões com as células vizinhas. agrupamento corpo celular também é evidente. (F) Dia 11 de diferenciação, um dia após a segunda divisão. As células são forçados a seguir a segunda passagem e muitos neurônios são, finalmente, perdeu. No entanto, a população restante é viável, homogênea e neuronal no fenótipo. Os corpos celulares produzir lclusters e processos Ärger começam a emitir a partir da base dos aglomerados.
Figura 5:. Supercrescimento epitelial e da morte neuronal - dois resultados alternativos do processo de diferenciação (A) saudável, maduro neurônios SH-SY5Y demonstram projeções axonal difusa que ligam às células vizinhas. (B) Em alguns casos, as células com um fenótipo epitelial mais semelhante a ultrapassar culturas de manutenção. Esta sobre-população de células epiteliais-como pode ser devido a passaging pouco frequente das culturas de manutenção. Estas culturas devem ser descartadas, já que as células epiteliais, como irá continuar a ser mais numerosos neurónios. Setas indicam células epiteliais-like. Células (C), quando SH-SY5Y são insalubres e começam a morrer, corpos celulares completam-se e degradar processos, gerando uma quantidade significativa de detritos. (D 6 UFP.
| Componente | detalhes | estoque | instruções | ||||
| 10 uM RA | ácido retinóico all-trans | 5 mM | Ressuspender 50 mg RA em 33,3 ml EtOH 95%. RA é sensível ao calor, luz e ar. Conservar em frasco escuro e armazenar a 4 ° C por até 6 semanas. Use diluição de 1: 500 e dilui-se em meios de diferenciação imediatamente antes da utilização | ||||
| (300,44 g / mol) | |||||||
| 1x B-27 | B-27 Suplemento | 50x | Descongelar garrafa 1-10 ml e restante alíquota em alíquotas de uso único de 1 ml e armazenar a -80 ° C. Loja frascos de 10 ml a -20 ° C | ||||
| KCl 20 mM | Cloreto de potássio | 1 H | Adicionar 250 ml de água a 18,6 g de KCl e filtro estéril. Armazenar em temperatura ambiente | ||||
| (74,55 g / mol) | |||||||
| db-cAMP 2 mM | dibutiril AMP cíclico | 1 H | Ressuspender garrafa cheia pela adição de 2,04 ml de água para 1 g db-cAMP. Sensível à luz e umidade. Armazenar em alíquotas de 100 uL ou de 200 uL a -20 ° C ou -80 ° C | ||||
| (491,37 g / mol) | |||||||
| 50 ng / ml de BDNF | o factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) | - | frasco de centrífuga para obter pó para baixo.60; Ressuspender 10 ug frasco em 1 ml Neurobasal 1x + B27 ou 5 ug frasco em 0,5 mL de 1x Neurobasal + B27 para obter 10 ug / ml. Use a diluição 1: 200. Armazenar alíquotas de trabalho a -80 ° C (ex: 250 ul) | ||||
| hiFBS | Soro fetal de bovino inactivado pelo calor | - | Alíquota descongelada FBS em 50 ml tubos cônicos. Aquece-se a 56 ° C num banho de água durante 30 min. Remover e congelar alíquotas de trabalho a -20 ° C | ||||
Tabela 1: As soluções de reserva e componentes.
| Meio de Crescimento básica | ||
| Componente | De volume para 500 ml | Diluição |
| EMEM | 415 ml EMEM | |
| 15% hiFBS | 75 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 5 ml Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM de glutamina | 5 ml Glutamina | 1: 100 |
| * Mantenha durante 6 semanas no máximo | ||
| Diferenciação de mídia # 1 | ||
| Componente | De volume para 50 ml | Diluição |
| EMEM | 48 ml de EMEM | |
| 2,5% hiFBS | 1,3 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 ul Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM de glutamina | 500 Glutamina ul | 1: 100 |
| 10 uM RA | 100 ul RA (estoque 5 mM) | 1: 500 |
| * Mantenha por 2 semanas no máximo e adicionar RA imediatamente anteriorusar | ||
| * Não manter media extra, uma vez RA é adicionado - RA é instável | ||
| Diferenciação de mídia # 2 | ||
| Componente | De volume para 50 ml | Diluição |
| EMEM | 49 ml de EMEM | |
| 1% hiFBS | 500 hiFBS ul | |
| 1x Pen / Strep | 500 ul Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM de glutamina | 500 Glutamina ul | 1: 100 |
| 10 uM RA | 100 ul RA (estoque 5 mM) | 1: 500 |
| * Manter durante 2 semanas máxima e adicionar RA imediatamente antes da utilização | ||
| * Não manter media extra emce RA é adicionado - RA é instável | ||
| Diferenciação de mídia # 3 | ||
| Componente | De volume para 50 ml | Diluição |
| Neurobasal | 47 ml Neurobasal | |
| 1x B-27 | 1 ml B-27 (banco de 50X) | 01:50 |
| KCl 20 mM | 1 ml de KCl (1M estoque) | 01:50 |
| 1x Pen / Strep | 500 ul Pen / Strep | 1: 100 |
| GlutamaxI 2 mM | 500 GlutamaxI ul (100x estoque) | 1: 100 |
| 50 ng / ml de BDNF | 250 ul de estoque de BDNF (10 ng / ml) | 1: 200 |
| 2 mM de dibutiril-AMP cíclico (db-cAMP) | 100 ul db-cAMP (estoque 1M) | 1: 500 |
| 10 uM RA | 100 ul RA (5 mM) | 1: 500 |
| * Manter durante 2 semanas máxima e adicionar RA imediatamente antes da utilização | ||
| * Não manter media extra, uma vez RA é adicionado - RA é instável | ||
Tabela 2: receitas Media.
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Discussion
O protocolo acima fornece um método simples e reprodutível para gerar culturas neuronais humanos homogéneos e viáveis. Este protocolo utiliza técnicas e práticas que integram vários métodos publicados anteriormente 1-4 e tem como objetivo delinear as melhores práticas de cada um. Diferenciação de células SH-SY5Y depende de privação de soro gradual; a adição de ácido retinóico, factores neurotróficos e proteínas da matriz extracelular; e divisão de série para seleccionar para os neurônios maduros aderentes diferenciados. Esta linha celular começa como uma população heterogénea de células aderentes e em suspensão. Este protocolo visa preservar ambas as populações pela retenção de lavagens com PBS antes passaging ou mídia mudança, mas alguma perda de células em suspensão é necessária para permitir a remoção das células epiteliais mortas. O método apresentado produz uma população homogénea de neurónios diferenciados humano SH-SY5Y para posterior experimentação.
embora otheR agentes pode ser utilizado para guiar a diferenciação de neurónios colinérgicos em um ou adrenérgicos fenótipo 16,17, o uso de AR para diferenciar as células SH-SY5Y foi usado anteriormente para a produção de neurónios com um fenótipo dopaminérgico 37,38. A adição de RA tem demonstrado induzir a diferenciação celular através de um certo número de mecanismos, incluindo a prender a progressão do ciclo celular para fora da fase G0 / G1, o aumento da expressão da quinase dependente de ciclina (CDK) inibidores de p21 e p27 KIP1 e as proteínas anti-apoptóticas Bcl -2 e Bcl-xL, e aumentar a actividade / AKT de PI3K, que desempenha um papel no desenvolvimento de neurites e diferenciação 39.
É imperativo ao longo da execução deste protocolo a usar técnicas de manipulação suave e estéreis, como as células SH-SY5Y são muito sensíveis à mudança repentina. É por causa dessa sensibilidade que o protocolo gradual privação de soro é preferido sobre protocolos que exigem fazer mudanças rápidas no medComposição ia. Ao dividir células nos dias 7 e 10, é importante minimizar a quantidade de tempo que os neurónios parcialmente diferenciadas passar em tripsina. Isto reduz a probabilidade de neurónios prejudiciais e promove a libertação preferencial de neurónios contra as células epiteliais, que levam mais tempo a separar. Isto ajuda a estabelecer uma população neuronal mais homogénea de células e para minimizar a contaminação com a proliferação e células epiteliais indiferenciadas. Também é importante notar os reagentes utilizados para a cultura e a diferenciação de células SH-SY5Y devem ser substituídas de forma rotineira e não ser mantido indefinidamente. Por exemplo, mídia básico crescimento pode ser mantido até 6 semanas, enquanto Diferenciação de mídia só deve ser mantido por até 2 semanas. Isso garante reagentes tais como dbcAMP e BDNF são frescos e estável. Além disso, preparou RA só deve ser armazenado por até 6 semanas e no escuro antes de um novo lote deve ser feita. Temos observado uma maior consistência de resultados neuronais wom essas precauções.
Uma vez que as células foram diferenciadas em neurónios maduros, que pode ser mantido durante até 2 semanas pós-diferenciação terminal e utilizados para a experimentação. Na sequência de diferenciação terminal, a mídia deve ser trocado a cada 3-4 dias (Diferenciação de mídia # 3). Em contraste com os neurónios diferenciados, que contêm balões de manutenção de culturas de células SH-SY5Y indiferenciadas podem ser mantidas ao longo de muitos semanas com Passaging regular. É importante culturas de manutenção passagem regularmente, para evitar o excesso de população de células epiteliais do tipo que não são mais capazes de se diferenciar em neurônios. Quando estas células superam aqueles com neuro-potencial, privação de soro irá causar quantidades desproporcionadas de morte celular. culturas indiferenciadas só pode ser mantida durante aproximadamente 15 passagens. Uma vez que a cultura excedeu cerca de 15 passagens, células indiferenciadas começam a morrer e têm uma aparência áspera, insalubre. Além disso, differenciação de células SH-SY5Y alta de passagem é mais difícil quanto menos células irá sobreviver a cada divisão, e aqueles que o fazem, muitas vezes agregar ambos os corpos celulares e axônios, fazendo análises posteriores mais difícil.
Há uma diminuição nítida do número de células durante o processo de diferenciação de muitas células são perdidas ou não sobrevivem ao processo de divisão. Portanto, no início de cada experiência envolvendo células SH-SY5Y diferenciadas, uma deve contabilizar ~ perda de 30-40% dos neurónios e assegurar um número adequado de células foi semeada no início para conseguir o rendimento desejado. Enquanto chapeamento de 100.000 células produz abundância de, neurônios SH-SY5Y maduras saudáveis, menos ou um número maior pode ser inicialmente banhado dependendo da necessidade experimental.
É claro que os neurónios completamente diferenciados SH-SY5Y proporcionar uma maior aproximação dos neurónios maduros humanos encontrados in vivo do que os seus homólogos de células progenitoras indiferenciadas (Figura 2). Estes neurônios irá fornecer um modelo vantajoso para futuras caracterizações do seu neurobiologia, para o estudo de vírus neurotrópico, ou para o rastreio de toxicidade quimioterapêutico em neurónios.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
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