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Article de méthode

Collecte de sang répétées pour des tests sanguins dans le poisson zèbre adulte

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DOI :

10.3791/53272

⸱

30 août 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Medical Science, Graduate School of Medicine, Mie University, 2Department of Molecular and Cellular Pharmacology, Pharmacogenomics, and Pharmacoinformatics, Graduate School of Medicine, Mie University

Dans cet article

Résumé

Des prélèvements sanguins répétés sont nécessaires et importants dans la recherche animale. Nous avons mis au point une méthode nouvelle, non létale et fiable pour le prélèvement répété de sang chez le poisson-zèbre adulte, et nous avons appliqué cette méthode à l’étude de la biochimie du sang, y compris le métabolisme du glucose.

Résumé

Collecte de sang répétées est une des techniques les plus courantes effectuées sur des animaux de laboratoire. Cependant, un protocole non létal pour le prélèvement de sang à partir du poisson zèbre n'a pas été établie. Les méthodes précédentes pour la collecte de sang de poisson zèbre sont mortelles, comme incision latérale, la décapitation et la queue ablation. Ainsi, nous avons développé une nouvelle méthode "répétée" de collecte de sang, et présente ici un protocole détaillé décrivant cette procédure. Cette méthode est peu invasive et se traduit par un taux de mortalité très faible (2,3%) pour le poisson-zèbre, permettant ainsi répété le prélèvement de sang à partir du même individu. Le volume maximal de prélèvement de sang est fonction de poids du corps du poisson. Le volume pour un échantillonnage répété de sang à des intervalles doit être ≤0.4% du poids du corps de chaque semaine ou ≤1% toutes les 2 semaines, qui ont été évalués par des mesures de l'hémoglobine dans le sang. En outre, l'hémoglobine, la glycémie à jeun, le plasma triacylglycérols (TG) et c totaleniveaux de holesterol chez le poisson zèbre adultes mâles et femelles ont été mesurés. Nous avons également appliqué cette méthode pour étudier la dysrégulation du métabolisme du glucose dans l'obésité induite par l'alimentation. Cette méthode de collecte de sang permet de nombreuses applications, y compris le glucose et le métabolisme des lipides et des études hématologiques, ce qui augmentera l'utilisation du poisson zèbre comme organisme modèle de maladie humaine.

Introduction

Zebrafish gagnent en popularité comme un modèle précieux de maladies humaines parce que leurs organes et la génétique sont similaires à ceux des humains 1,2. Dans le domaine de la biologie du développement, de nombreuses études ont démontré que le poisson zèbre et de montrer humaine marqués similitude dans l'hématopoïèse 3, hémostase 4,5 et 6 myélopoïèse. Poisson zèbre adultes sont également utilisés pour l'étude immunologique 7, 8 et les maladies neurodégénératives liées à l'obésité 9 car cet organisme modèle actions voies communes avec ceux perturbé dans les maladies humaines. Pour l'obésité et les maladies liées à l'obésité (diabète, la stéatose hépatique non alcoolique et la stéatohépatite et athérosclérose), le poisson-zèbre niveaux de lipides et de glucose dans le sang ont été examinées à fond dans plusieurs modèles transgéniques et l'obésité induite par l'alimentation 10-13.

Répétée prélèvement de sang d'animaux individuels permettra de réduire l'utilisation des animaux et diminuerRease différences interindividuelles. Cependant, la collecte de l'échantillon répété est techniquement difficile chez les petits animaux tels que le poisson-zèbre à cause de leur volume de sang relativement faible et le manque de récipients facilement accessibles. Plusieurs méthodes de collecte de sang ponctuelle de poisson zèbre ont été développés, bien que ces méthodes ont leurs propres inconvénients, y compris la létalité, lésions tissulaires associées et le volume sanguin limitée. Par exemple, 1 à 5 ul de sang peut être récolté à partir d'une incision latérale d'approximativement 0,3 cm de longueur dans la zone de l'aorte dorsale 5. Décapitation avec des ciseaux en coupant à travers la ceinture scapulaire peut recueillir le sang de 5-10 ul 10. Une autre méthode de prélèvement de sang est commode queue ablation 14. Ponction cardiaque est une méthode alternative potentielle pour la collecte de sang répétées du même poisson, mais la très petite quantité obtenue (environ 50 nl) avec cette procédure limite le nombre d'analyses qui peuvent être performed 11. En conséquence, un nouveau protocole est nécessaire pour permettre un échantillonnage répété de sang non-létale, ce qui serait une avancée critique nécessaire pour cet organisme d'être un organisme modèle standard pour les maladies humaines. Cette technique permettrait d'essai réponse pharmacologique, la découverte de marqueurs biologiques moléculaires pour le diagnostic, la détermination du pronostic et la surveillance de diverses maladies telles que les maladies métaboliques, des maladies dégénératives et plusieurs types de tumeurs malignes.

Nous avons donc développé une méthode minimalement invasive pour obtenir le sang de poisson zèbre en série 15. Ici, nous démontrons la procédure visuellement et fournissons un protocole détaillé pour cette technique. En utilisant cette méthode, la valeur normale sur la base de différents paramètres, dont l'hémoglobine, la glycémie à jeun, et de lipides dans le sang du poisson zèbre adultes en bonne santé ont été évalués. En outre, nous avons également évalué si cette méthode est adaptée pour les études qui nécessitent des échantillons en série par murveillance les changements temporels dans les niveaux de glucose sanguin au cours des expériences suralimentation.

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Protocole

Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le comité d'éthique de l'Université de Mie, et ont été réalisées conformément à la réglementation de protection des animaux japonais 'loi sur la protection et la gestion des animaux »(ministère de l'Environnement du Japon) et respectées aux lignes directrices internationales.

1. Préparation de l'aiguille

NOTE: Toutes les expériences ont été réalisées sous anesthésie, et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance. Pour l'euthanasie, les poissons ont été immergés dans un bain d'eau glacée (5 parties glace / 1 partie d'eau à ≤4 ° C) pendant ≥20 min.

  1. Préparer les aiguilles de microcapillaires de verre en tirant un capillaire en verre de 1,0 mm de diamètre extérieur avec un extracteur d'aiguille (Figure 1A).
  2. Coupez les pointes des aiguilles à l'aide de ciseaux fins oblique (figure 1B). Le diamètre de la pointe idéal devrait être d'environ 100 - 200 um (figure 1C). Si la pointe diameter est trop étroite, le sang ne sera pas entrer dans l'aiguille.
  3. Dissoudre l'héparine dans une solution saline à une concentration de 5 mg / ml.
  4. Placer une aiguille prédécoupé à la fin de la tourelle d'un ensemble de tube d'aspiration et maintenez l'embout buccal dans la bouche, ou de connecter l'aiguille à un distributeur de l'ampoule. Plonger la pointe de l'aiguille dans la solution d'héparine, et hépariner l'aiguille par aspiration et de soufflage à travers la solution (figure 1D et 1E).
    Remarque: L'ensemble de tube d'aspiration a été utilisée pour la cryoconservation de sperme de poisson zèbre 16. Long tube de caoutchouc peut arrêter tout le sang battant dans la bouche. Définition d'un filtre dans le milieu du tube peut éviter les dangers.
  5. Stocker les aiguilles héparinés dans un plat de 10 cm de Petri et sécher à l'air pendant au moins 1 h. Un grand nombre d'aiguilles peut être préparé à l'avance.

2. Anesthésie

  1. Préparer la solution anesthésique dans un petit boîtier en plastique en mélangeant 200 ml d'eau de poissons avec 100 ul de 2-phénoxyéthanol (2-PE). La concentration finale des anesthésiques est de 500 ppm.
    ATTENTION! 2-PE a un effet rapide.
  2. Retirer nombre désiré de poissons (souche AB) à partir du système de circulation.
  3. Utilisez un filet de transférer le poisson dans les anesthésiques pour les 1 - 2 min (figure 1F). Observer les poissons nager progressivement, étaler les nageoires pectorales horizontalement, halètement, et avoir des mouvements de operculum rapide en 1 min.
  4. Comme le temps passe, observer les poissons gisait sur le fond de l'affaire et finalement arrêter la natation. Le plan chirurgical d'anesthésie atteindra quand le poisson arrête à haleter et les mouvements sont lents opercule. À ce stade, le poisson est prêt pour la collecte de sang.
  5. En utilisant une écumoire soulever le poisson anesthésié de la 2-PE et doucement le placer sur une serviette en papier imbibé d'anesthésiques (figure 1G). Couvrir la tête du poisson avec du papier de soie douce aussi imbibé avec une solution 2-PE afin d'éviter la sécheresse oculaire et utiliser un autre papier tissu doux et sec pour doucementsécher la surface du corps.

3. Collecte de sang

  1. Placer une aiguille héparine à la fin de la tourelle de l'ensemble de tube d'aspiration (ou le distributeur de l'ampoule) et maintenir l'extrémité de l'embout de l'ensemble de tube d'aspiration dans la bouche.
  2. Saisir l'extrémité de nez et l'aiguille ensemble, et retirez soigneusement les échelles interférant avec la pointe de l'aiguille. Insérez l'aiguille à un 30 - angle de 45 ° dans le site de collecte de sang. Éviter la perforation du tube digestif (figure 1H). En cas d'utilisation de l'ampoule distributeur, appuyer sur l'ampoule avec le pouce et le majeur, et de bloquer le trou à la pointe de l'ampoule avec le premier doigt, puis insérer l'aiguille comme décrit ci-dessus.
    Remarque: Le site de collecte de sang est le long de l'axe du corps et en arrière de l'anus dans la région de l'aorte dorsale. L'aorte dorsale (DA) et la veine cardinale postérieure (PCV) sont juste ventrale à la colonne vertébrale (figure 2).
  3. Commencer à sucer leembout buccal extrémité de l'ensemble de tube d'aspiration lorsque l'aiguille se fait sentir touchant la colonne vertébrale. Si le sang ne se lève pas, déplacer la pointe de l'aiguille subtilement à la main pour favoriser la circulation sanguine. Notez qu'une fois que le sang est à la hausse dans l'aiguille, arrêter immédiatement secousses et sucer doucement (Figure 1I). En cas d'utilisation de l'ampoule distributeur, relâcher la pression de l'ampoule pour aspirer le sang.
  4. Observez le sang va augmenter lentement dans l'aiguille d'une manière pulsatile sans aspiration, qui est probablement en raison de la pression artérielle. Ainsi, il est inutile d'aspirer si l'aiguille pénètre dans l'artère correctement.
  5. Arrêtez aspiration après le volume approprié de sang est recueilli. Retirez l'aiguille du poisson et appuyez sur le site de ponction à l'aide de papier tissu doux pour arrêter les saignements. Observez l'arrêt des saignements après environ 10 - 20 sec de la pression du doigt (figure 1J).
  6. Après le saignement est arrêté, transférer immédiatement le poisson à un articleun-eau chaude (~ 28 ° C) du réservoir. Aidez le poisson à récupérer en remuant doucement l'eau vers les branchies jusqu'à ce qu'il commence à nager.
    Remarque: Gardez jusqu'à 5 poissons postsampling dans un réservoir de 2 L et raccorder le réservoir au système de circulation pour oxygéner le poisson. L'addition d'antibiotiques à l'eau des poissons est pas nécessaire. Maintenir le poisson avec le logement et l'alimentation normale.
  7. Expulser le sang de l'aiguille sur une surface propre d'un morceau de parafilm (figure 1K).
  8. Mesurer la glycémie en utilisant toute glucomètre portatif commerciale (figure 1L).
    Remarque: Le glucomètre utilise une déshydrogénase-flavine-adénine-dinucléotide électrode de glucose et nécessite un volume de 0,6 ul d'échantillon.
    1. Insérez une bandelette de test complètement dans le compteur et directement toucher la goutte de sang. Observez le tirage au sort de sang dans la bande de test automatiquement et obtenir le résultat de la glycémie 5 sec sur la zone d'affichage. Enregistrez le résultat et jetez la bandelette de test. Utiliser unnouvelle bande pour chaque mesure d'essai.
  9. (étape optionnelle) Prendre des quantités précises de sang par un pipetage et transférer le sang dans un tube à centrifuger pour d'autres analyses (hémoglobine, triacylglycérols (TG), le cholestérol total, etc.). Si nécessaire, diluer le sang total d'un poisson avec une solution saline. Centrifuger les échantillons de sang pendant 3 min à 680 x g à la température ambiante et récolter le plasma. Transférer le plasma dans un nouveau tube. À ce stade, il est prêt à être utilisé dans des analyses biochimiques.

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Résultats

Cette méthode de collecte de sang provoque des lésions minimes à poisson zèbre (un <1 mm perforation; Figure 1J) et donne un taux de mortalité très faible de 2,3%. Nous avons examiné le volume maximum de sang qui pourraient être recueillies à partir d'un seul poisson et évalué la relation à son poids de corps (Figure 3). Nous avons constaté que le volume de sang recueilli a été maximale linéairement corrélée avec le poids corporel (R = 0,813). Le plus grand volume de sang prélevé...

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Discussion

Nous présentons ici un protocole détaillé pour l'obtention de série sang de poisson zèbre adulte. Cette méthode est simple à réaliser et nous l'utilisons dans le laboratoire sur une base quotidienne. Cette méthode de collecte de sang est basée sur insérant une aiguille capillaire en verre dans l'aorte dorsale du poisson zèbre. Au cours de cette procédure, il est essentiel de veiller à ne pas pratiquer l'ablation de la colonne vertébrale, car il est le critère pour la recherche de l'aorte dorsale. La ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 et 25590073. Nous tenons à remercier Mme Yui Namie pour l’illustration dessinée à la main, ainsi que M. Koshi Kataoka et Mme Sayuri Ichikawa pour leur aide à l’entretien du poisson-zèbre.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Capillaires en verre avec filamentNarishigeGD-11,0 mm de diamètre extérieur.
Extracteur d’aiguilleNarishigePC-10Pour produire les aiguilles
HéparineWako Pure Chemical Industries081-00136Pour l’héparinisation
Ensemble de tube d’aspirateurDrummond2-040-000Pour le prélèvement sanguin
Distributeur d’ampouleDrummond1-000-9000Pour le prélèvement sanguin
2-phénoxyéthanolWako Pure Chemical Industries163-12075Pour l’anesthésie du poisson
DRI-CHEM3500VFujifilm-Pourla mesure de l’hémoglobine
DRI-CHEM SlidesFujifilmHb-WIIPour la mesure de l’hémoglobine
Glutest Neo Super SanwaKagaku Kenkyusho-Pourla mesure de la glycémie
bood Wako L-type TG kitWako Pure Chemical Industries464-44201Pour TG mesure
Wako L-type CHO kitWako Pure Chemical Industries460-44301Pour la mesure du cholestérol total
Parafilm MAlcan PackagingPM996Pour expulser le sang sur

Références

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