Summary
Vi beskriver en teknik för att märka nervceller och deras processer via antero eller bakåtsträvande spår injektioner i hjärnkärnor med hjälp av ett in vitro-beredning. Vi ändrade en befintlig metod för v vitro tracer elektroporering genom att utnyttja fluorescerande mutanter mus och grundläggande optisk utrustning för att öka märkning noggrannhet.
Abstract
Vi presenterar en teknik som kombinerar ett in vitro spårinjektionsprotokoll, som använder en serie av elektriska och tryckpulser för att öka färgupptagning genom elektroporering i hjärnan explantat med riktade laserbelysning och matchande filterglasögon under proceduren. Den beskrivna tekniken med in vitro-elektroporering av sig själv ger relativt god visuell kontroll för målsökande av vissa områden i hjärnan. Genom att kombinera den med laser excitation av fluorescerande genetiska markörer och deras utläsning genom band passerar filterglasögon, som kan plocka upp utsläppen av de genetiskt märkta celler / kärnor och fluorescerande spåra färgämnet kan en forskare avsevärt öka noggrannheten injektioner genom att finna området av intresse och styrning för det färg spridning / upptag i injektionsområdet mycket mer effektivt. Dessutom tillåter den laserbelysning teknik för att studera funktionen hos en given neurocircuit av provIding information om vilken typ av neuroner som skjuter ut till ett visst område i fall där GFP-uttryck är kopplat till den typ av sändare uttrycks av en underpopulation av neuroner.
Introduction
För att definiera en viss neuronal (mikro) krets, måste man börja med att hitta de olika deltagarna i kretsen, och deras anslutningsmönstret. Ända sedan Wallers publikation om neurofiber spårning genom lesionering en ett stort utbud av neuroanatomiska spårningsteknik har etablerats. Några av dessa tekniker kan tillämpas i fixerad vävnad efter slakt 2-4, andra förlitar sig på den aktiva transporten av färgämnet i levande neuroner, som upptäcktes i 1971 5-6. Det senare kan delas upp ytterligare i två grupper diskriminerande mellan metoder som utnyttjar aktiv retrograd (från det injicerade området till källan av en viss projektion, dvs. Somata av nervceller som skjuter till nämnda område) och aktiv antero (från den injicerade området till målet om en viss projektion, dvs. de axonal prognoser och axonal plintarna märkta neuroner) transport. Också, i vissa fall tracer material injiceras i levande djur som sedan överlever injektionen av flera dagar eller veckor (in vivo spår injektioner), medan det i andra fall explanterade hjärnor injiceras och inkubera under flera timmar efter injektionen i artificiell cerebrospinalvätska (in vitro spår injektioner) .
I detta protokoll ändrade vi en befintlig in vitro elektroporering teknik 7-8 att märka neuronal somata och processer i antero och bakåtsträvande spårning experiment med choleratoxin subenhet-b och tetrametylrodamin dextran som spårnings ämnen. Det övergripande målet med detta protokoll är att ge neuroforskare med ett effektivt verktyg för att spåra neuronala anslutningsmönster mellan olika hjärnkärnor, samtidigt dra nytta av tillgängliga transgen mus linjer och grundläggande optisk utrustning för att öka inriktning noggrannhet under spår injektioner. Även metoden för antero och bakåtsträvande spårning med hjälp avcholeratoxin och dextran amin och deras respektive fluorescensmärkta konjugat är inte ny 9-13 (som är metoden för elektroporering, t.ex.. Haas et al., 14), varvid kombinationen av spår injektioner med elektroporering i en in vitro beredning inbegriper block av hjärnvävnad är en senare utveckling 7. Dess främsta fördel jämfört med neuronala spårning tekniker med samma typ av spår färgämnen med levande djur är den ökade märkningsintensiteten, på grund av den högre effektivitet med vilken electroporated färgämnet tas upp av nervceller. En ytterligare fördel är en förkortad inkubationstiden (krävs för färgämnet transport) och dess ökade mål noggrannhet under spårämnesinjektion, eftersom laboratoriet har visuell kontroll över målområdet av injektionen. Det senare innebär också att ingen dyr stereotaktisk utrustning krävs för att hitta kärnan eller hjärnan intresseområde.
Till ytterlifall öka inriktning noggrannhet, vi drog fördel av en transgen mus linje, som uttrycker GFP i sin glycinerga subpopulation av neuroner 15 och grundläggande optisk utrustning består av en handhållen laserpekare av 405 nm våglängd och matchande bandpassfiltrerings glasögon (450 - 700 nm). Därmed nådde vi en betydande ytterligare ökning av inriktning noggrannhet genom att identifiera injektionsstället genom sin fluorescerande signal och genom att tillhandahålla ett finare sätt att kontrollera för färgämnet sprids inom injektionsstället genom observation av samspelet mellan den inhemska GFP signalen och spår fluorescens. Vår teknik gör det också möjligt att avslöja funktionaliteten hos en krets tillsammans med sin anslutning genom att identifiera GFP-positiva hämmande neuroner (eller stimulerande i andra muslinjer) som fylldes med spårämnet.
Sammanfattningsvis, förbättrade vi ytterligare ett kraftfullt neurovetenskaplig verktyg för att studera connectome av ryggradsdjur hjärnan och bedöma than olika neuroanatomiska egenskaperna hos en given neurocircuit. Genom att använda transgena möss tillsammans med billiga och lättillgängliga optisk utrustning kunde vi avsevärt öka den målsökande noggrannheten i våra injektioner. Dessutom transgena möss tillät oss att identifiera typen av spåras anslutningar, som hjälpte avslöja funktionaliteten hos en hämmande mikrokrets i hörselhjärnstammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optisk Genotypning
1. Optisk Genotypning av Mus Pups
- Kontrollera för expression av respektive fluorescerande markör med användning av en laserpekare av den lämpliga excitationsvåglängden (405 nm i de experiment som beskrivs här) och motsvarande filterglasögon som blockerar excitationsvåglängden men passerar emissionsvåglängden (450 - 700 nm i de experiment som beskrivs här) . Rikta laserpekaren på baksidan av huvudet eller ryggmärg från mus valp (se figur 1). Undvik lysande lasern i ögonen och långvarig exponering av huden för laserljus.
2. Optisk genotypning av äldre djur
- Djupt söva musen (åldrad P14 till P138 i de experiment som beskrivs här) med en överdos av pentobarbital genom en intraperitoneal injektion (120 mg / kg kroppsvikt). Bekräfta korrekt anestesi genom att kontrollera djurets reflexer (kort nypa spetsen av the örat eller ett av bakbenen för att framkalla indragnings reflex av örat eller benet).
- Anmärkning: Trots användningen av en överdos av pentobarbital (120 mg / kg kroppsvikt) hänvisar vi till injektionsproceduren som "djup anestesi" istället för eutanasi, eftersom djuret är idealt fortfarande lever (dvs. dess hjärta fortfarande slår), när kirurgi och perfusionen börjar. Detta säkerställer en effektivare perfusion av de inre organ inklusive hjärnan.
- När djuret inte visar några reflexer, försiktigt bort huden överliggande skallen (Figur 2A) genom att göra ett snitt i huden som täcker baksidan av huvudet och skära till mittsektionen av skallen. Exponera blott skallen för laserljus och observera fluorescensen genom filterglasögon såsom beskrivits ovan. Om en positiv GFP signal observeras, gå vidare till steg 2, om inte, offra djuret genom halshuggning (andra / säkerställa form av dödshjälp efter vårIACUC regler).
Obs: I ännu äldre möss (> 1 månad) kan observeras fluorescens genom ögonen på djuret.
2. transcardial Perfusion och Brain Förberedelse
- Perfundera transkardiellt med iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH 2 PO 4: 1,76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mM) med användning av en 30 G sprutnål för att till stor del avlägsna blod från djuret.
- Först, öppna försiktigt bröstkorgen med vass sax och tryck sedan in nålen i vänster kammare i hjärtat. Börja pumpa PBS in i hjärtat och aorta och omedelbart efter detta steg öppna högra förmaket av hjärtat med sax för att göra det möjligt för blodet att lämna kroppen. Obs: Perfusion tar 5 - 10 minuter beroende på storleken på djuret.
- Efter blodtappning genom perfusion, halshugga djuret, säkra sitt huvud med stift needles (eller 30 G kanyler) genom piercing dem genom ögonhålorna i en beredning skålen och ta bort hjärnan från skallen.
- Först använder skarpa sax för att klippa bort huden ligger över skallen: göra ett litet snitt på baksidan av huvudet, sedan skär längs mittlinjen på ryggsidan av huvudet, kapas till sidorna bara caudally av ögonen hos djuret och slutligen skära i den kaudala riktningen för att helt ta bort flikar av huden på baksidan av huvudet.
- Därefter upprepa samma skärmönster för skallen själv, se till att ta bort båda cochleas i processen, eftersom detta kommer att avsevärt förenkla avlägsnande av hjärnstammen i slutet. Efter detta förfarande caudal halvan av hjärnan bör ligga helt exponerad.
- I nästa steg, använd en vass rakblad eller en skalpell för att skära igenom hela framhjärnan i en vinkel på ca 45 ° och ca 2 mm rostralt från lillhjärnan. Ösa ut den separerade främre halv av hjärnan med abent spatel.
- Använd spateln för att höja den kaudala halv av hjärnan vid dess rostralt ände och därefter skära igenom kranialnervema som fortfarande är anslutna till hjärnstammen på dess ventrala sida. Som ett slutresultat, bör den kaudala halv av hjärnan inklusive hjärnstammen falla fritt av resten av det beredda djur huvud.
- Vänd bort svans halvan av hjärnan för att exponera sin ventrala sidan och skär längs den koronala planet bara rostralt (för antero injektioner) eller bara stjärtfenan (för bakåtsträvande injektioner) av ventralt placerade "lampor" som innehåller den trapetsformade kroppen (se steg 2,3).
- Använd alltid en vass rakblad eller en skalpell för skärförfarande för att minimera celldöd som orsakas av överdriven mekanisk påfrestning på vävnaden. Som ett slutresultat bör en hjärna Explantation spänner ungefär 1 cm i längd och innehållande den fullständiga överlägsen olivary komplex längs andra delar av hjärnan har erhållits.
Obs: Detta protokoll visar förfarandet för en spår injektion i den trapetsformade kroppen ligger i hörselhjärnstammen. Anpassa läget och orienteringen av skärplanen och injektionsställen som behövs. Om de fluorescerande hjärnregioner av intresse ligger tillräckligt nära hjärnans yta, så att de kan identifieras och injiceras utan att skära hjärnan (se figur 2B), sedan den koronala skärningssteget kan utelämnas.
- Identifiera den trapetsformade kroppen som två ventrala framstående "lampor" som innehåller ventrala kärnan av den trapetsformade kroppen (VNTB).
Obs: För ytterligare anatomiska referens om ungefärliga stereotaktisk placeringen av dessa skärplan, se Franklin & Paxinos 2008. Panelen 78 i atlas, Bregma ~ -5,7 mm visar den mediala kärnan i den trapetsformade kroppen (= MNTB) märkt som "Tz ". Panel 69 visar ventrala kärnan i trapets body (VNTB) märkt som "MVPO" (medioventral periolivary kärna) 19.
3. Antero / Retrograde tracing
Obs: Utför alla följande procedurer vid RT (25 ° C).
- Efter kapning, placera hjärnstammen explantatet i en beredning maträtt innehållande syresatt (95% O2, 5% CO2) dissekera lösning (NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl2: 1 mM, CaCl2: 0,1 mM, glukos : 25 mM NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCOa 3: 25 mM askorbinsyra: 0,4 mM, myoinositol: 3 mM, pyruvinsyra: 2 mM), säkra den med 30 G kanyler. Se till att injektionsområdet är vänt uppåt.
- Dra injektionspipetter från borosilikatglas och fylla dem med en av de följande tre lösningar: a) en 1,0 mg / ml lösning av choleratoxin subenhet-b konjugerat till en Alexa fluoroforen 555 i PBS 12-13 (främst för retrograd transport), b ) en 1% -dilution i 0,9% saltlösning av dextran tetrametylrodamin 555 (3000 MW, främst för retrograd transport) eller c) 1% -dilution i 0,9% saltlösning av 10000 MW dextran-TRITC 555 (främst för antero transport).
- Se till att injektions pipett motstånd intervallet 2,5-3,5 MOhm och att de är tillverkade i 3 - 4 dragcykler. För de experiment som beskrivs här, uppnå detta genom att välja en förprogrammerad drar algoritmen på pipetten avdragare.
- Belysa hjärnan explantatet med hjälp av ett statiskt monterad laserpekare med rätt våglängd (punkt nr 2 i figur 3A, 405 nm våglängd i de experiment som beskrivs här). Använd laserpekaren som en guide för injektionerna, och rikta laserstrålen mot den fluorescensmärkta hjärnan kärna eller celler av intresse som ska injiceras.
- Hitta och observera belysta målområdet genom en kikare mikroskop iklädd kompatibla filterglasögon (450 - 700 nm bandpassfilter i de experiment som beskrivs här). För in injektions elektroden via mikromanipulator i området av intresse.
- Injicera spårämnet. Injektionerna består av 2 - 10 tryckpulser vid 15 psi under 50 ms vardera, med användning av en tryckinjektionsanordning, riktad vinkelrätt in i regionen av intresse (ROI) i hjärnan sidan. Administrera varje tryckpuls med intervaller på 10 - 15 sekunder för att tillåta färgämnet att sprida sig.
- I fallet med de tetrametylrodamin (TRITC) injektioner, dessutom stimulera elektriskt för att förbättra färgämnesupptagnings genom elektroporering med elektroden placeras i hjärnan området av intresse (MNTB och VNTB i de experiment som beskrivs här).
- Använd 8 TTL pulser av 8 volt för 50 ms med 50 ms mellanpulsintervall, som drivs av en stimulator och förstärkta till 55 V med en stimuleringsisoleringsenhet (objekt nr 7 och 9 i figur 3B). Använd 10 - 20 repetitioner av detta protokoll, administrativttrerade under flera minuter 7,8. Var noga med att jorda elektroden ordentligt - jordkabeln ska anslutas till badet lösningen!
- Kontrollera för framgång av injektionen. Eftersom en fluorescerande spårämne med en längre våglängd emissions också avger en fluorescerande signal vid laserexcitation med kortare våglängder, visuellt kontrollera färgupptag / sprids i injicerade målområdet medan belysa området med laser och observera genom filterglasögon.
4. Inkubation
- Efter injektionen inkubera brainstems i oxygenerad artificiell cerebrospinalvätska (ACSF, NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl2: 1 mM, CaCla 2: 2 mM, glukos: 25 mM NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCOs 3: 25 mM, askorbinsyra: 0,4 mM, myoinositol: 3 mM, pyrodruvsyra: 2 mM, bubblades med 95% O2 - 5% CO2) vid rumstemperatur (RT, 25 ° C) under 1 - 4 h, medanfärgämnet transporteras. Bubbla lösningen under hela inkubationsperioden.
- Därefter överför brainstems i 4% paraformaldehyd (PFA) löst i PBS (ca 100 ml;. PH 7 för PFA / PBS-blandning) och inkubera dem vid 4 ° C för att tillåta efter fixering över natten (O / N).
5. Vävnadsskivning och Montering
- Nästa dag, tvätta hjärnstammen tre gånger i PBS (5 minuter för varje tvättsteg), täck den i 4% agar och skär sedan i 50 - 80 um tjocka skivor på en vibratome. Montera skivor med hjälp av en monteringsmedium på en glasskiva, och täck.
- Eventuellt märka sektioner med fluorescerande Nissl för 25 min (t ex blå Nissl vid en 1: 100 spädning i AB-media).
- För att framställa AB medier, blanda 250 ml 0,2 M fosfatbuffert (PB; 51 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml 5 M NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml DDH 2 O och 5 g bovint serumalbumin.
- Precede och efterträda Nissl märkning steg 3 tvättsteg i PBS (10 minuter vardera).
Obs: I de fall där tjockare sektioner måste monteras och analyseras (i experiment som beskrivs här sådana segment var 100 - 500 mikrometer tjock för att bevara axonal anslutningar över större avstånd), kan tekniken kombineras med vävnads clearing. Vi hittade ClearT2 12 att vara framgångsrik 20. När en vävnad clearing steg ingår, gör det innan montering av sektionerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figurerna 1 och 2 visar hur laserpekaren och laserglasögon kan användas för att snabbt och billigt genotyp GFP positiva djur från en kull. I fall av unga musungar, kan tekniken användas för att icke-invasivt identifiera GFP etikett i djurets hjärna genom skallen och överliggande huden (Figur 1A - D). Emitterad fluorescens kan ses genom huden och skallen av musungar åtminstone upp till postnatal dag tre (Figur 1C). Proceduren visas i figur 1 för vår grön-fluorescerande protein (GFP) märkt mus som uttrycker GFP i sin glycinerga subpopulation av neuroner (GlyT2-GFP). I äldre djur med tjockare skallar och pigmenterad hud, visar GFP etiketten mindre väl genom hud och ben, och därför huden på huvudet och / eller halsen måste tas bort innan den optiska genotypning (Figur 2A).
Efter perfusion avdjur hjärnan tas ut och belyst igen för att hitta de fluorescensmärkta kärnorna av intresse. De ljusa strukturer som lyser upp nära den ventrala ytan av hjärnstammen i figur 2B är de två ventrala kärnor i trapets kroppen, som vi använde både som guide och ett mål för våra spår injektioner. Figurerna 4 och 5 visar representativa resultat av en antero injektion i den ventrala kärnan av den trapetsformade kroppen (VNTB) med hjälp av tetrametylrodamin dextran (TRITC, Fig. 4) och två bakåtsträvande injektioner i den mediala kärnan i den trapetsformade kroppen (MNTB) med hjälp av choleratoxin subenhet-b (CTB, Figurerna 5A och B) och TRITC (fig 5C och D). Bright axonal märkning som anger (i detta fall hämmande) prognoser från VNTB till MNTB kan ses efter en antero injektion i VNTB (Figur 4). Figurerna 5A och 5C visar en översikt över platseninjektionsstället (MNTB) med kärnan innehåller retrograd märkta celler (VNTB) bredvid den. Figurerna 5B och 5D visar förstorade bilder av retrograd märkta somata av glycinerga VNTB celler i samma avsnitt som visas i figur 5A och 5C. Notera hur den retrograd spårning med CTB resulterar i en mer punktuell mönster 12-13 (figur 5B), medan VNTB celler retrograd märkta med TRITC uppvisar en mycket tät Golgi-liknande märkning 21 (fig 5D).
Figur 1:. Optisk genotypning av GlyT2-GFP-positiva och GlyT2-GFP-negativa möss GFP-positiva möss fotograferades under (A) normala ljusförhållanden, (B) vid laserbelysning med en 405 nm laserpekare utan växthus filtreringsglasögon och (C)vid laserbelysning med laser och UV skyddsglasögon. En stark GFP signal syns i området ovanför lillhjärnan och hjärnstammen. (D) däremot, gör GlyT2-GFP-negativa valpar från samma mus linje och ålder (p2) inte visar några tecken på fluorescens i samma områden ( bakhuvudet och ryggmärg). Den blå laserljus effektivt filtreras av glasögon.
Figur 2: Optisk genotypning och en Beredd Brain Explantation. (A) En p4 GlyT2-GFP mus pup skalle exponeras för laserbelysning och betraktas genom bandpassfiltrering glasögon. Den fluorescerande GFP kan observeras genom skallen. (B) En hjärna explantat från samma valpen i en beredning maträtt vid laserbelysning, sedd genom filtreringsglasögon. Glycinerga axoner och hjärnkärnor, såsom den ventrala kärnan i den trapetsformade kroppen (VNTB) kan ses som very ljusa strukturer nära hjärnans yta.
Figur 3: Översikt över ett in vitro Tryck Injection och elektroporation Setup. (A) 1: stereoskop, 2: monterad laserpekare (405 nm våglängd), 3: huvudsteg med injektionspipetten monterad på en mikromanipulator, 4: förberedelse maträtt som innehåller hjärnan Explantation, 5: en PC med installerad MC Stimulus programvara, 6: tryckinjektionsanordning, som är ansluten till injektionspipetten via rör (B) 7:. stimulans isoleringsenhet, 8: högintensiva belysningsanordning, 9: stimulatorn. Stimulatorn är ansluten till elektroden i pipetten via stimulering isoleringsenheten och drivs av datorn.
Figur 4: Antero spårning av Hämmande anslutningar från VNTB till Medial Nucleus i Trapezoid Body (MNTB). Visas högst projektion av ett konfokalt stack fattas i en horisontell skiva som spänner över cirka 200 mikrometer i djup i en rensas hjärnan hos en P14 GlyT2-GFP mus. Efter en tetrametylrodamin dextran (TRITC) injektion i caudo-mediala delen av VNTB, ljust märkta axonala förbindelser (och i vissa fall deras kopplings ändelser) från VNTB till MNTB kan observeras. Skala bar: 200 nm.
Figur 5:. Retrograde Tracer Injektioner i MNTB Reveal Fylld glycinerga Celler i VNTB Visade är största projektionerna av konfokala staplar tas i koronala skivor av ett P88 (A, B) och en p80 (C, D (som spänner över ca 50 pm.) ) GlyT2-GFP mus. (A) En översikt över en choleratoxin subenhet-b (CTB) injektion i den mediala delen av MNTB. (B) glycinerga celler i VNTB är fyllda med CTB (röd puncta inuti cellen somata) som ett resultat av injektionen visas i figur 5A. Några av puncta visas utsidan av cellerna, som skulle kunna vara en indikation på andra GFP-negativa (icke-glycinerga) celltyper i VNTB fylls, samt (på grund av skadade fibrer av passage i injektionsområdet, till exempel) . (C) En annan översikt av en bakåtsträvande TRITC injektion med inriktning på MNTB. Notera, hur ett antal celler fylls med TRITC i MNTB följande elektroporation (i motsats till den rent tryck injicerades CTB i figur 5A). (D) Retrograd märkning av glycinerga VNTB celler efter en TRITC injektion i MNTB (samma injektion såsom visas i figur 5C). De flesta av cellerna visar en tät gul eller orange märkning, på grund av blandning av två fluorescerande signaler (den inhemska GFP uttryck och fyllning med den röda TRITC). Jämför med en GFP-positiv cell som av någon anledninginte ta upp färgämnet (blå pil) och en spår-märkt GFP-negativa cell förekommer djupt röda och eventuellt fyllas på grund av en axonal skada i injektionsområdet (röd pil). Notera de olika färgningsmönstret av cell somata i bakåtsträvande spår injektioner med hjälp av CTB (Figur 5B) och TRITC (figur 5D). Skalstrecken: Figurerna 5A och 5C: 200 | im, fig 5B och 5D: 20 | im.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En allmän styrka in vitro-spårämne elektroporation, i motsats till in vivo spårning studier, är att den ger forskarna bättre tillgång till hjärnan området av intresse och därmed inte innebär dyra stereotaktisk (och ofta elektrofysiologiska) utrustning. Dessutom överlevnad tid som krävs för hjärnan explantaten spänner bara några timmar (1 - 4) istället för dagar eller veckor i fallet med in vivo spår injektioner (se en detaljerad genomgång av användningen av dextran aminer och andra spårämnen i in vivo injektioner av Lanciego och Wouterlood 2011 22, men också Rodriguez-Contreras, et al., 2008 23), så att misslyckade injektioner kan upptäckas så tidigt som under injektionsproceduren eller senast nästa dag på, så att injektionsparametrar kan justeras i enlighet därmed. Den korta överlevnadstiden för hjärn explants innebär också att det är oftast en mindre skillnad mellan <em> effektiva (område, där färgämnet togs upp av nervceller i antero eller axonal terminaler i retrograda injektioner) och den skenbara (område där färgämnet spillts, utan tas upp) injektionsstället, även om denna skillnad kan aldrig uteslutas fullständigt och kan endast kvantifieras / kontrolleras för post hoc, vilket i vissa fall kan vara helt omöjlig (se Albrecht et al., 2014 för en mera detaljerad diskussion 24).
Det bör påpekas, att anslutningar praktiskt taget alla längd kan studeras med denna metod, så länge försöks kan bevara både det behandlade området och dess mål eller källområde axonal prognoser i ett enda stycke av hjärnvävnad. Visualiseringen av sådana förbindelser kan uppnås genom antingen rekonstruktion av konfokala bildstaplar som förvärvats efter skivning och montering av hjärnan (som beskrivs här) eller hela hjärnan / hjärn platta avbildningstekniker efter verkställande vävnad klaring protokoll (se avsnitt 5 i detta protokoll för ett exempel).
Den stora fördelen med vår teknik för laserstyrda in vitro elektroporering är den betydande ökningen av inriktning noggrannhet under spår injektioner. Den ursprungliga metoden för in vitro elektroporering förlitar sig på bara visuell kontroll genom att rikta vissa topografiska markörer eller använda dem som ungefärliga guider för området injektionsstället. Detsamma gäller för färgämnet sprids i målområdet: en kan observera färgämnet sprids, men det är inte lätt att kontrollera färgämnet spridning i en finare sätt. Med laser modifiering av denna metod kan en forskare lätt hitta kärnor och celler av intresse och observera färgen sprids i kärnan / cellpopulationen av intresse genom samverkan mellan den inhemska genetiskt drivna fluorescens och fluorescens av färgämnet. Således, en forskare får mer kontroll över hans / hennes spårning experiment genom att minimera falska positiva i anterolateralt eller bakåtsträvandefyllningar, eftersom celler / axonal terminaler utanför kärnan / intresseområde fylldes under injektionen, liksom. Uppenbarligen, detta betyder inte en absolut kontroll över den effektiva injektionsstället, vilket, som tidigare nämnts, kan skilja sig från den skenbara området. En nackdel med denna teknik är naturligtvis tillgången på genetiskt modifierade organismer. Möss är en allmänt använd genetisk modellorganism i däggdjursstudier, vilket också är sant för den auditiva fält, men vissa däggdjursmodeller kunde anses bättre, eftersom de liknar den mänskliga audiogrammet mer exakt. Således kan andra tekniker användas för att märka neuronala populationer i vildtyp djur av andra arter som är bättre anpassade för en viss typ av forskningsområdet (t.ex. gerbiler eller chinchillor i studier av hörselsystemet 25-28): detta skulle kunna inbegripa virala injektioner dra nytta av vissa promotorer som riktar sig endast vissa avdelningar i hjärnan och uttrycka fluorescerent markörer i endast en delmängd av hjärnceller. Naturligtvis behöver extra omsorg vidtas för att säkerställa giltigheten av de uttryckta genetiska konstruktioner i rätt subpopulation av nervceller, oavsett om sådana konstruktioner uttrycks viralt i vildtyp djur eller den inhemska marknaden i knock-in mus linjer.
Som tidigare påpekats, fördelen av mus mutanter som uttrycker fluorescerande proteiner i vissa subpopulationer av neuroner möjliggör också funktionell karakterisering av hjärnkretsar (i vårt fall kunde vi karaktärisera hämmande prognoser från ett hörselhjärnstammen kärna till en annan 24 av ren visualisering av Resultaten av våra spåra experiment). Återigen måste giltigheten av de uttryckta genetiska konstruktionerna bekräftas innan tolkning av resultaten av spårningsförsök kan ske.
En annan allmän styrka in vitro elektroporering är dess förenlighet med othER-anatomiska metoder, såsom (immun) histokemi och hjärn clearing. Som framgår tidigare 24, är det inte påverkas av tillämpningen av ytterligare färgningstekniker såsom Nissl, eller en hjärna clearing metod som kallas ClearT2 12 20,24. Den stora nackdelen att man måste tänka på är att penetrationsdjup Nissl och fläckar antikropps minskar med ökande vävnadstjocklek, så måste man väga alternativen axonal process bevarande i tjockare skivor kontra signalstyrka ytterligare (immuno) histokemiska färgning i experiment där behövs både anatomiska märkningsmetoder. Naturligtvis är en annan faktor att beakta bandbredd separation av de olika fluorescerande markörer excitation / emission, eftersom minimalt antal etiketter börjar vid tre markörer på denna punkt (inhemska fluorescerande protein uttryck, spårämne och Nissl / antikroppsmärkning).
Uppenbarligen kan vår beskrivna metoden utökas tillinjektioner av något slag av fluorescerande markörer (inklusive kvant pärlor) i hjärnan explants eller ens hjärnan skivor av transgena möss. Eftersom injektions noggrannhet beror på både en tydlig måldetektering (observation av fluorescerande kärnor och celler) och en finare kontroll över utsläppet av fluorescerande färg, ska endast en av dessa två faktorer räcker för ökad injektion precision, även när andra är frånvarande. Detta innebär att olika icke-fluorescerande markörer (som virala konstruktioner eller andra DNA / RNA-vektorer) kan injiceras med större precision i hjärnans kärnor av intresse, så länge målet kärnorna är klart synliga för försöks. Denna senare tillämpning är särskilt intressant, eftersom elektroporering medger för effektivt upptag av DNA-material, samt 29-30, vilket gör vår metod nästan idealisk för den här typen av injektioner. Den enda nackdelen som måste övervägas är att DNA-konstruktioner tar tid att uttrycka och problemet med levande tissue bevarande uppstår. Detta skulle kunna övervinnas genom att upprätta organotypiska hjärnan slice kulturer 31-32 baserat på injicerade hjärnsnitt (eller åter skivad hjärnvävnadsblock), som möjliggör levande vävnad bevarande i storleksordningen veckor.
Och naturligtvis andra transgena mutanter mus kan användas för att undersöka anslutning av andra neuronala typer som kolinerga neuron (t.ex. ChAT-GFP möss 33), vilket gör denna metod ett mångsidigt verktyg för att studera anslutningar och funktioner i hjärnan (mikro) kretsar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Med stöd av NIH / NIDCD R01 DC 011582. Imaging experiment utfördes i University of Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Kärna stöds delvis av NIH / NCRR Colorado CTSI Grant Antal UL1 RR025780 och Rocky Mountain Neurlogical Disorders Kärna Center Grant NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac från Salk Institute försett oss med GlyT2-GFP möss.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y.
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
