Summary
Electrospun nanovezels hebben een hoge oppervlak tot gewichtsverhouding, uitstekende mechanische integriteit gewicht en ondersteunen celgroei en proliferatie. Deze nanovezels hebben een breed scala van biomedische toepassingen. Hier fabriceren we keratine / PCL nanovezels, met behulp van de electrospinning techniek en karakteriseren van de vezels voor mogelijke toepassingen in de tissue engineering.
Abstract
Electrospinning, vanwege zijn veelzijdigheid en mogelijke toepassingen op diverse gebieden, wordt vaak gebruikt om nanovezels te fabriceren. De productie van deze poreuze nanovezels is van groot belang vanwege hun unieke fysisch-chemische eigenschappen. Hier werken wij de fabricage van keratine bevattende poly (ε-caprolacton) (PCL) nanovezels (dwz PCL / keratine composietvezel). Water oplosbare keratine werd eerst geëxtraheerd uit menselijk haar en gemengd met PCL in verschillende verhoudingen. De gemengde oplossing van PCL / keratine werd getransformeerd in nanofibrous membranen met behulp van een laboratorium ontworpen elektrospinproces opgezet. Vezelmorfologie en mechanische eigenschappen van de verkregen nanovezel waargenomen en gemeten met behulp van scanning elektronenmicroscopie en trekbank. Verder afbreekbaarheid en chemische eigenschappen van de nanovezel bestudeerd met FTIR. SEM beelden vertoonden uniform oppervlak morfologie PCL / keratinevezels van verschillende samenstellingen. De PCL / keratin vezels toonden ook uitstekende mechanische eigenschappen zoals modulus en faalpunt. Fibroblast cellen in staat waren om te bevestigen en te laten groeien en het blijkt een goede levensvatbaarheid van de cellen. Op basis van de kenmerken hierboven besproken, kunnen we stellen dat de sterk gemengde nanovezels van natuurlijke en synthetische polymeren een uitstekende ontwikkeling van composietmaterialen die kunnen gebruikt worden voor verschillende biomedische toepassingen kan vertegenwoordigen.
Introduction
Electrospinning wordt erkend als een gangbare methode voor het bereiken polymeer nanovezels. De vezels kunnen worden geproduceerd op nanoschaal en de vezel eigenschappen kunnen worden aangepast 1. Deze ontwikkelingen en de kenmerken van electrospun nanovezels zijn vooral interessant voor hun toepassingen in biomedische engineering geweest vooral in tissue engineering. De electrospun nanovezels bezitten overeenkomsten met de extracellulaire matrix en aldus bevorderen celhechting, migratie en proliferatie 2. Vanwege de gelijkenis van de extracellulaire matrix (ECM), kunnen electrospun vezels worden gebruikt als materialen om te helpen bij wondverbanden, geneesmiddelafgifte en voor engineering weefsels zoals lever, bot, hart, spier en 3.
Een grote verscheidenheid aan polymeren van synthetische en natuurlijke oorsprong zijn gebruikt om electrospun vezels voor verschillende biomedische toepassingen 4 maken. Onlangs er is gegroeid inlangstelling in de ontwikkeling van composiet nanovezels door het mengen van synthetische en natuurlijke polymeren 4. In deze preparaten met name de eindproducten erven de mechanische sterkte in verband met het synthetisch polymeer, terwijl ook de vaststelling van biologische signalen en de eigenschappen van de natuurlijke polymeer.
In dit experiment, PCL en keratine worden als synthetische en natuurlijke polymeren worden toegepast voor de synthese van een samengestelde nanovezel. Keratine is een natuurlijk polymeer dat wordt gevonden in het haar, wol en nagels. Het bevat vele aminozuurresten; opmerkelijke belangstelling is cysteïne 4,5. Idealiter een natuurlijk voorkomend polymeer zou biorenewable, biocompatibel en biologisch afbreekbaar zijn. Keratine bezit deze drie kenmerken tegelijkertijd verbeteren van celproliferatie en celhechting aan de biomaterialen het is in 6 opgenomen.
Polycaprolacton (PCL) is een resorbeerbaar synthetisch polymeer dat significanttissue engineering 4. Dit polymeer is eerder geprezen voor de structurele en mechanische stabiliteit, maar het mist cel affiniteit en vertoont een lang afbraaksnelheid. De hydrofobe aard van PCL is waarschijnlijk verantwoordelijk voor het gebrek aan affiniteit 7 cel. Echter, PCL maakt voor de beperkingen door zich zeer mengbaar met andere polymeren. Een PCL / keratine composiet moet de mechanische eigenschappen van PCL te tonen en op te nemen van de biologische eigenschappen van keratine, waardoor het een ideale keuze voor verschillende biomedische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocol volgt de richtlijnen van de North Carolina A & T State University Bureau voor Onderzoek Compliance and Ethics.
1. Chemische Voorbereiding voor Keratine Extraction 4
- Ter voorbereiding 1000 ml 2% gew / vol oplossing van perazijnzuur (PAS), onder een afzuigkap voeg 20 ml perazijnzuur aan 980 ml gedeïoniseerd (DI) water.
- Tot 1000 ml van 100 mM Tris-base-oplossing (TBS) te bereiden, voeg 12,2 g Tris Base tot 1000 ml DI water en roer tot volledig opgelost.
- Bereid verdunde zoutzuuroplossing (DHAS) in een zuurkast door gieten 4 ml geconcentreerd zoutzuur in 30 ml DI water.
- Procure ongeveer 20 g menselijk haar knipsels die niet chemisch zijn behandeld of gewijzigd. Haar kan elke lengte zijn.
- Was het haar grondig, met de hand, met warm water en zeep. Gebruik gedeïoniseerd (DI) water voor de laatste spoeling.
- Zet het haar in twee 600 ml bekers en plaats in een 80 ºC oven voor 1 uur.
- Giet de vloeistof uit de bodem van het bekerglas en zet terug in de oven tot het haar volledig droog.
- Verdeel droog haar gelijkmatig tussen de 600 ml bekers, het plaatsen van 10 g van haar in elke beker. Heeft het haar om meer dan 500 ml vullen niet toestaan.
- Giet 500 ml PAS in elk bekerglas zorg ervoor dat alle haren te bedekken. Bedek de bekers met parafilm en op te slaan voor 12 uur.
2. Voorbereiding van de Keratine Extract Solution
- Scheid het haar van PAS met een 500 urn zeef. Verzamel het afval PAS in een aparte container. Spoel het haar grondig met DI water om eventuele overgebleven PAS verwijderen.
- Plaats de gespoeld haar in een 500 ml kolf. Schenk 400 ml TBS in de kolf, om ervoor te zorgen dat het haar bedekt is. Cuvette in een schudbad ingesteld op 38 * C, 65 rpm gedurende 1 uur.
- Na 1 uur, te verwijderen uit het schudden bad en giet de vloeistof, ongeveer 400 ml van keratine extractie-oplossing (KES), into een 1000 ml beker.
- Giet 400 ml DI water in de kolf die het haar verzekeren dat het haar is bedekt en terugplaatsen in de schudbad gedurende 1 uur. Neem de kolf uit het bad te schudden en giet de resterende 400 ml van de KES in de 1000 ml beker met de eerder verzamelde KES. Het haar is niet meer nodig en kan uit de fles worden gedumpt en weggegooid in de dichtstbijzijnde prullenbak bakje.
3. Concentratie van Keratine Extract Solution
- Vul rotodistiller bad naar de bovenste regel met gedestilleerd water en ingesteld op 90 ºC. Stel rotatiesnelheid 200 rpm. Zet het koelmiddel chiller-pomp en ingesteld op -10 ºC.
- Een pH-meter om de pH van de KES bewaken Gebruik een pipet 1 mM DHAS langzaam toevoegen KES, totdat de pH 7,0. Roer langzaam de oplossing wordt toegevoegd.
- Giet het geneutraliseerde KES in de 500 ml rondbodemkolf tot ongeveer kwart gevuld. Voer de distilleerder volgens de fabrikantprotocol voor 1,25 uur.
- Herhaal stap 3,3 tot alle KES is gedistilleerd. Zorg ervoor dat de kolf stevig is aangesloten.
4. Dialyse van Keratine Extract Solution
- Giet KES oplossing even in 12 afzonderlijke 14 ml conische buizen. Centrifugeer de buizen bij 1050 xg gedurende 10 min.
- Giet de gecentrifugeerd KES in een schone beker, en zorg ervoor om weg te gieten van de verzamelde puin. Herhaal dit tot alle van de KES werd gecentrifugeerd.
- Vul een 2000 ml maatcilinder met DI-water.
- Snijd dialyseslang cellulose membraan 24 inch, en clip een uiteinde van de buis te houden sluiten.
- Dompel de lengte van de buis in de cilinder DI water om het flexibeler en gemakkelijker te openen.
- Open de niet-geknipt uiteinde van de dialysebuis cellulose membraan en giet langzaam 60 ml gecentrifugeerd KES oplossing in de slang. Met andere clip bij het uiteinde van de slang te sluiten.
- Zet de dialysis buis in de 2.000 ml cilinder van DI water en laat het zitten voor 24 uur. Wijzig de DI water in de cilinder om de 3 tot 4 uur.
- Na de 24 uur periode leeg de KES gedialyseerde oplossing in potten afgedekt, waarbij u ruimte bovenaan plaats laat in de vriezer bij -20 ° C gedurende 24 uur.
5. Vriesdrogen van Keratine Extract Solution
- Stel de vriesdroger tot -86 ºC.
- Verwijder de potten met bevroren KES uit de vriezer, neem de doppen off van de potten, en plaats ze in de vriesdroger ampullen. Plaats de zegels op de ampullen en draai de knop om een vacuüm druk van 0,133 mbar te creëren. Lyofiliseren de monsters gedurende ongeveer 48 uur, totdat al het vocht is verdwenen.
6. Voorbereiding van Electrospinning Solutions (10 gew% Keratine Solution)
- Verwijder de keratine poeder uit de vriesdroger en wegen.
- Voeg gedeïoniseerd water aan de Keratine poeder tot een 10% gew / gew creërenKeratine oplossing.
7. Bereiding van 10% gew PCL Solution
- Verkrijgen PCL (ε-caprolacton polymeer, Mn 70-90 kDa) en trifluorethanol (TFE). Bereid een 10% gew PCL in TFE door roeren O / N en een homogeen mengsel te verkrijgen.
8. Bereiding van Keratine / PCL Solution
- Verkrijgen de 10 gew% PCL oplossing die vooraf was bereid en 10 gew% keratine oplossing. keratine toevoegen aan de PCL oplossing druppelsgewijs om 10 ml PCL / keratine oplossingen van 90:10, 80:20, 70:30 en 60:40 ratio creëren.
- Gebruik een vortexer om een homogeen mengsel van PCL / Keratine oplossing te verkrijgen voordat elektrospinning.
9. Productie van electrospun PCL / keratinevezel
- Leg ongeveer 8 ml van de PCL / keratine oplossing in een 10 ml wegwerpspuit voorzien van een 0,5-mm kunststof buis. Plaats de spuit in een spuitpomp waarin de stroomsnelheid is ingesteld op 2,5 ml / uur.
- Wikkel de collector trommel met aluminiumfolie voordat u het monster. Zorg ervoor dat de aluminiumfolie stabiel is door toepassing van de etikettering tape aan beide zijden.
Opmerking: De vezels worden op de aluminiumfolie vormen (zie figuur 2), slaan de vezel bedekte folie bij kamertemperatuur.
10. Mechanische Analyse van de PCL / Keratine Nanovezels
- Snijd het monster in 60 mm bij 8 mm. Zorg ervoor dat de dikte opnemen door het gebruik van digitale micrometer. Voor elke samenstelling bereid, gebruikt vijf monsters.
- Bevestig de 60 x 8 mm monster in de treksterkte tester. Gebruik een speciaal ontworpen preparaathouder om het monster te bevestigen. Sandwich van het monster tussen preparaathouders die is gemaakt van een index-kaart met behulp van dubbel-dubbelzijdige tape. Breng de 10 N belastingscel met een verplaatsingssnelheid van 10 mm / min.
Noot: De monsterhouder werd ontworpen om 62 mm bij 40 mm met een inwendige raam van 50 mm bij 38 mm. - Record uitbreiding en load waarden door middel van software op basis van software-protocol.
- Bereken stress door het verdelen van het geweld door deel van het onderzochte monster. Bereken vervolgens stam door de lengteverandering van aanvankelijke lengte snijdt.
- Genereren van de spanning-rek kromme door het uitzetten van stress in y-as voor overeenkomstige spanningswaarde in de x-as.
- Bereken de Young's modulus van het lineaire gebied waar de helling gelijk aan elasticiteitsmodulus. Bepaal treksterkte van de stress spanning plot door het nemen van 0,2% te compenseren in stam en het tekenen van een parallelle lijn aan de lineaire regio curve.
- Voer de statistische analyse van de mechanische gegevens die zijn verkregen in drievoud eerder met behulp van one-way variantie-analyse met behulp van analysesoftware 8. P-waarden <0,05 weopnieuw als statistisch significant.
11. Surface morfologie en structurele karakterisatie
- Met scanning elektronenmicroscoop (SEM) met parameters van versnellingsspanning van 15 kV en stroom van 5 uA tot de morfologie van de vezels electrospun observeren.
- Voorafgaand aan de beeldvorming met SEM, snijd een 2 cm 2 sectie van de vezel en bevestig deze aan een SEM stadium gebruik van koper tape. Plaats het podium in de sputter coater en jas met goud op 15 mA gedurende 1 minuut en 30 seconden naar een goudlaag ongeveer 11 nm dik te maken. Laad het monster in de kamer van de SEM. Let op de vezel monsters.
- Gebruik Fourier transformatie infraroodspectroscopie (FTIR) om de chemische binding tussen de PCL- en keratine karakteriseren. Plaats de 2 cm 2 sectie van het electrospun nanovezel membraan in een magnetische houder en het zuiveren van het systeem met droge lucht voor het testen. Verkrijgen spectra 200 scans en analyseren van de spectra met behulp standard software volgens softwareprotocol.
- Uitvoeren spectrum analyse met behulp van standaard software gebruiken drievoud van elke verhouding nanovezels volgens het protocol van de fabrikant.
12. Onderzoek Cell-vezel Interactie
- Snijd vezels tot 16 mm 2 monsters. Gebruik van een biocompatibele, siliconen gebaseerde lijm aan elk monster dekglaasjes vast met een diameter van 12 mm.
- Lijm ene uiteinde van de vezel monster op de achterkant van het dekglas, wikkel het monster rond dekglaasje, lijm dan het vrije uiteinde van het monster aan de achterkant van het dekglas ook, waardoor de bovenkant van de slip bedekt met alleen de fiber monster.
- Plaats de vezel monsters in een 24-wells plaat. Steriliseer de monsters door onderdompeling in 80% ethanol gedurende 1 uur.
- Spoel de ethanol uit de monsters met behulp van DI-water. Vervolgens pipet 2 ml basaal medium op de monsters, en zorg ervoor dat het gehele monster te dekken. Verwijder het medium na 5 min.
- Gebruik fibroblast 3T3 cellen aan de vezel monsters zaad. Suspendeer de cellen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) aangevuld met antibiotica en 10% foetaal runderserum (FBS), zodat er ongeveer 62.000 cellen / cm2 per 1 ml DMEM.
- Drop 1 ml van de 3T3-cellen bevattende DMEM oplossing in elke well plaat zodat elk monster vezel bedekt is met ongeveer 62.000 cellen / cm2. Incubeer de platen goed voor 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2. Opmerking: Gebruik 5% CO 2 omdat dit niveau meestal handhaven van de pH van het celmedium in fysiologische bereik dagen.
13. Afbraak van Nanovezel Matrix
- Cut gedroogde PCL / keratine nanovezel membranen in vierkante ongeveer 30 mm x 30 mm.
- Steriliseer de 900 mm 2 monsters met 80% alcohol voor een 10 minuten incubatieperiode en grondig wassen met DI water. Incubeer de monsters in 15 ml PBS, pH 7,5, bij 37 ° C. Vervang de buffer om de 3 dagen.
- Neem de membranen uit de oplossing op bepaalde tijdstippen, 1 week en 7 weken en spoelen met DI water.
- Plaats het membraan monsters in vriesdroger ampullen. Plaats de zegels op de ampullen en draai de knop om een vacuüm te creëren. Lyofiliseren gedurende 24 uur, tot het volledig droog.
- Bevestig de gedroogde monster naar een SEM stadium gebruik van koper tape. Plaats het podium in de sputter coater en jas met goud op 15 mA gedurende 1 min en 30 sec.
- Laad het monster in de kamer van de SEM. Let op de vezel monsters bij een versnellend voltage van 1,5 kV en 5 uA stroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
vezel morfologie
SEM beelden van de vezels werden verkregen voor de vezelsamenstelling. Zie figuur 3. Image Fiber bevestigt dat de vezels willekeurig zijn georiënteerd.
mechanische testen
Mechanisch sterke vezels zijn meestal nodig voor verscheidene toepassingen weefselmanipulatie. Deze vezels moeten voldoende sterkte en flexibiliteit onder bepaalde stress en omgevingsomstandigheden 9 behouden. In het algemeen worden steigers gewenst moduli dicht bij die van het doelweefsel om stress shielding te vermijden en om voldoende sterkte te handhaven tijdens in vivo en / of in vitro celgroei 10. Tensile Tester werd gebruikt om de Young's modulus en breuksterkte van de vezel te meten. Young modulus (MPa) van PCL / keratine bij verhoudingen van 100: 00, 90:10, 80:20 en 70:30 wzoals gevonden te zijn 10 ± 2 8 ± 1, 5 ± 1,5 en 4,5 ± 1,6 respectievelijk 4. Evenzo breuksterkte (MPa) van PCL / keratine bij verhoudingen van 100: 00, 90:10, 80:20, 70:30 en bleek 3 ± 1,2, 2 ± 0,5, 1 ± 0,2 en 0,3 ± 1 zijn respectievelijk 4 zoals getoond in tabel 1. Figuur 4 toont de grafische trend variatiecoëfficiënt van Young modulus versus PCL.keratin ratio. De trendlijn in de grafiek helpt bij het verder begrijpen van de rekgrens tarief.
Structurele en morfologische karakterisering
In figuur 5, FTIR transmissie spectra PCL / keratine samengestelde nanovezels tonen banden bij 2950 cm -1, 1050 cm -1 en 1240 cm -1 vanwege asymmetrische rektrillingen CH 2 respectievelijk CO en COC groepen. De carbonylgroep absorptiepiek bij 1720 cm -1 that is kenmerkend voor PCL is ook zichtbaar 4,11. Absorptiebanden bij (3286 cm -1), (3056 - 3075 cm -1), (1600 - 1700 cm -1), (1480 - 1580 cm -1) en (1220 - 1300 cm -1) zijn indicatief voor keratine eiwitten. De banden zijn aangeduid als amide A, B, I, II en III resp.
De banden en pieken aanwezig in de FTIR spectra verandering de keratine verhoogde concentraties in het composiet. Hun verschijning de aanwezigheid en structurele conformatie van keratine kettingen echter de interactie tussen de pieken en bands had enige problemen geven. Bijvoorbeeld, de amide I band aanwezig bij 1600 - 1700 cm -1 wordt gewoonlijk gebruikt om keratine studie echter de band enigszins vervormd door de PCL piek. Gelukkig zal de amide II band volstaan om keratine aanwezigheid, keratine ketting conformatie en binding interacties tussen de PCL en te bewijzenkeratine functionele groepen.
Cell-Fiber Interaction
Gebruik Scanning Electron Microscopy de cel-vezel interactie werd onderzocht. Figuur 6 toont de SEM foto van de 3T3 fibroblastcellen die gekweekt op de nanovezel monsters 24 uur waren. De hechting van de cellen aan de nanovezel monsters zichtbaar en geeft aan dat de cel filopodia neiging om de uitlijning van de nanovezels volgen wanneer zij vergelijkbare diameter. Almar Blue (AB) werd uitgevoerd om de levensvatbaarheid van 3T3 cellen te kwantificeren in de vezels. AB is de chemische Resazurin. Deze niet-fluorescerende kleurstof komt in de levende cellen, mitochondriale reductasen vermindert resazurin om resorrufin die roze en fluorescerend. Er was geen significant verschil in giftigheid niveaus van verschillende verhoudingen van PCL / keratine.
< br /> Figuur 1. Foto's van de Keratine Extraction Process (A) Schoongemaakt menselijk haar vóór de extractie.; (B) Hair na keratine extractie; (C) Keratine extract oplossing; (D) gevriesdroogde keratine poeder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Digitale Camera's electrospun Fibers. Beelden van als gesynthetiseerde vezels van CL / keratine met verschillende ratio's verzameld op aluminiumfolie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
e 3 "src =" / files / ftp_upload / 53381 / 53381fig3.jpg "/>
Figuur 3. SEM afbeeldingen van PCL / keratine Nanovezels. (AC) beelden van de nanovezels gesponnen uit oplossingen met PCL / keratine verhoudingen van 70:30, 80:20 en 90:10, respectievelijk. De inzetstukken tonen sterkere vergroting beelden van elk beeld overeenkomstige SEM. SEM beelden (DF) en (GI) vertegenwoordigt de in beelden (AC) vezels na 1 en 7 weken afbraaktesten, respectievelijk. De schaal bar in het inlegwerk vertegenwoordigt 500 nm (zie schaal bar in afbeelding C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Grafiek van Modulus versus PCL / Keratine ratio's. Een grafiek van keratine concentratie versus Young's Modulus toont de grafische trend van de variatie van de Young's Modulus. De trendlijn extra ondersteuning breken rek tarief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. FTIR-spectra van met PCL / keratine Nanovezels met verschillende verhoudingen. Het spectrum bevestigt de binding van PCL keratine. De grote piek gemeten op 1722 cm -1 is het eens met standaard elementaire metingen van PCL absorptie band en is zichtbaar in alle spectra. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. SEM beelden die de morfologie van 3T3 fibroblastcellen gezaaid op PCL / keratine Nanovezel membraan. Afbeeldingen A, B en C vertegenwoordigen de PCL / keratine waarbij verhoudingen van 90/10, 80/20 en 70/30, respectievelijk. Beelden (A), (B) en (C) hoger vergroting afbeeldingen (A), (B) en (C) respectievelijk. De donkere gebieden op de beelden geven de locatie van elke fibroblast cellen bevestigd op de top van en in de nanovezel topografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| verhoudingen | Young's modulus (MPA) | Breaking Strength (MPA) |
| 100/0 | 10 ± 2 | 3 ± 1.2 |
| 90/10 | 8 ± 1 | 2 ± 0,5 |
| 80/20 | 5 ± 1.5 | 1 ± 0,2 |
| 70/30 | 4,5 ± 1.6 | 1 ± 0,3 |
Tabel 1. mechanische eigenschappen van PCL / keratinevezels
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Extractie van keratine van mensenhaar werd met succes bereikt. De perazijnzuur fungeerde als oxidatiemiddel op het menselijk haar, waardoor de keratine te extraheren door de Tris Base. De productie van keratine poeder werd kleinschalig door het feit dat het alleen gedaan voor onderzoeksdoeleinden. Deze procedure is reeds vastgesteld in de industrie voor grootschalige productie. Te onttrekken kleinschalige keratine was verontreiniging, batch variabiliteit en kosteneffectiviteit regelen.
Keratine extractie is de beperkende stap van deze procedure. De opbrengst aan keratine poeder is zeer laag, 0,7-2%. 20g van mensenhaar leverde 0,14-0,4 g keratine. Een andere belangrijke stap bij het produceren van de vezels electrospun formuleert een oplossing die geschikt is voor elektrospinnen. Keratine was gemakkelijk gedispergeerd in gedeïoniseerd water, maar op electrospinning de keratine / wateroplossing niet tot vezelvorming. Om de noodzakelijke m biedenolecular interacties nanovezels creëren een copolymeer werd aan de oplossing. PCL opgelost in TFE, kon sterker interageren met keratine door middel van waterstofbinding. De TFE is grotendeels verantwoordelijk voor de stabiliteit van de complexen copolymeer vanwege de elektronegativiteit en zuur gedrag.
Mengen van de oplossing met de keratine PCL oplossing voor nieuwe problemen vanwege het feit dat PCL bekend is hydrofoob terwijl de keratine bekend hydrofiel zijn. Als we de verhouding van keratine verhoogd was het moeilijk om het homogene mengsel te verkrijgen. Dit probleem werd opgelost door het toevoegen van keratine oplossing druppelsgewijs aan de PCL oplossing en handmatig vortexen het voor 30 min.
SEM beelden tonen uitstekende oppervlakte morfologie die ideaal is voor celgroei en proliferatie. De vergelijkende resultaten tonen FTIR goede mengbaarheid tussen PCL en keratine in de vezels electrospun. Dit kan zijn vanwege intermoleculaire waterstof bonding tussen PCL en keratine. Een andere factor is de snelheid waarmee electrospun vezels stollen voorkomen PCL aggregatie in het mengsel. De structurele en mechanische integriteit leeft van moleculaire interacties tussen de PCL- en keratine, waardoor het materiaal geschikt is voor regeneratieve geneeskunde toepassingen. Deze electrospun vezels bleken te hebben jonge moduli sluiten dat van de inheemse weefsel. Mechanisch sterke vezel kan celadhesie en proliferatie ondersteunen. De PCL / keratine nanovezels vertoonde goede uniformiteit, structurele integriteit, geschikte mechanische eigenschappen, en cellulaire compatibiliteit. Young's modulus (MPa) voor PCL / keratine bij verhoudingen van 100: 00, 90:10, 80:20, 70:30 en bleek 10 ± 2 8 ± 1, 5 ± 1,5 en 4,5 ± 1,6, respectievelijk te . De moduli daalde de verhouding van keratine toegevoegd toegenomen. Celadhesie en proliferatie van de PCL / keratinevezels bevestigt dat de vezels niet giftig en ondersteuning voor celgroei.De groei filopodia langs de nanovezels geeft gunstige interactie tussen de fibroblasten en de PCL / keratinevezels.
Electrospinning techniek werd met succes gebruikt om de PCL / Keratine gebaseerd nanovezels te synthetiseren. Deze techniek, in tegenstelling tot andere bestaande methoden, is betrouwbaar gebleken en kosteneffectief te zijn en kunnen eventueel worden gebruikt in grootschalige productie nanovezel. Uit deze studie geconcludeerd dat PCL / Keratine gebaseerd composiet nanofibrous scaffolds hebben het potentieel om te worden gebruikt voor biomedische toepassingen en bootsen natuurlijke ECM voor weefselregeneratie toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Auteurs willen graag bedanken National Science Foundation door middel van Engineering Research Center for radicale Metallic Biomaterialen (ERC-0812348) en Nanotechnologie Undergraduate Education (EEG 1.242.139) voor de financiering van steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Hair | Obtained from Local Barber Shop in Greensboro | ||
| Peracetic acid | Sigma Aldrich | ||
| PCL (e-caprolactone polymer) | Sigma Aldrich | 502-44-3 | Mn 70-90 kDa |
| Trifluoroethanol (TFE) | Sigma Aldrich | 75-89-8 | |
| Tris Base (TrizmaTM Base Powder) | Sigma Aldrich | >99.9% crystalline | |
| Hydrochloric Acid | Fischer Scientific | A144C-212 Lot 093601 | Waltham, MA |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | Sarasota, FL | |
| Cellulose membrane | Sigma Aldrich | 12 - 14 kDa molecular cut off | |
| optical microscope | Olympus BX51M | BX51M | Japan |
| scanning electron microscope | Hitachi SU8000 | SU8000 | Japan |
| Table-Top Shimadzu machine | North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series | AGS-X Series | Columbia, MD |
| Fourier transform infrared spectroscopy | Bruker Tensor 2 Instrument | Billerica, MA | |
| Microcal Origin software | Northampton, MA | ||
| X-ray diffraction (XRD) | Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer | Madison, WI | |
| Fibroblast 3T3 cell | American Tissue Type Culture Collection | Manassas, VA | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM | Invitrogen | Grand Island, NY | |
| Spectra max Gemini XPS microplate reader | Molecular Devices | Sunnyvale, CA | |
| Student- Newman-Keuls post hoc test | SigmaPlot 12 software |
References
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. J Biomed Mater Res. 60, 613-621 (2002).
- Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Adv Healthc Mater. 1, 10-25 (2012).
- Edwards, A., Jarvis, D., Hopkins, T., Pixley, S., Bhattarai, N. Poly(-caprolactone)/keratin-based composite nanofibers for biomedical applications. J Biomed Mater Res B. 103, 21-30 (2015).
- Dowling, L. M., Crewther, W. G., Parry, D. A. Secondary structure of component 8c-1 of alpha-keratin. An analysis of the amino acid sequence. Biochem J. 236, 705-712 (1986).
- Yamauchi, K., Maniwa, M., Mori, T. Cultivation of fibroblast cells on keratin-coated substrata. J Biomat Sci-Polymer. 9, 259-270 (1998).
- Shea, L. D., Wang, D., Franceschi, R. T., Mooney, D. J. Engineered Bone Development from a Pre-Osteoblast Cell Line on Three-Dimensional Scaffolds. Tissue E. 6, 605-617 (2000).
- Fortin, M. -J.
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors. Tissue E. 7, 679-689 (2001).
- Bhattarai, N., et al. Natural-Synthetic Polyblend Nanofibers for Biomedical Applications. Adv Mater. 21, 2792-2797 (2009).
