Introduction
Prioner er alvorlige neurodegenerative sygdomme, der påvirker CNS. Prionsygdomme følge af fejlfoldning af den normale cellulære prionprotein, PrP C, af et infektiøst isomer kaldet PrP Res. Disse sygdomme rammer en bred vifte af arter, herunder bovin spongiform encephalopati i køer, scrapie, chronic wasting disease hos hjortedyr, og Creutzfeldt-Jakobs sygdom hos mennesker 1-3. Prioner forårsage neurodegeneration, der starter med synaptisk tab, og udvikler sig til vakuolisering, gliose, neuronal tab, og plaque indskud. Til sidst, hvilket resulterer i død af dyret / individuelle 4. I årtier har forskere undersøgt forbindelser beregnet til at bremse eller stoppe progressionen af prion sygdom. Men forskere har ikke fundet enten en vellykket terapi eller en effektiv systemisk levering køretøj.
Endogen PrP C-ekspression er nødvendig for udviklingen af prionsygdomme 5 ° ekspression medføre en forsinkelse eller lindring af sygdom. Flere grupper skabt transgene mus med reducerede niveauer af PrP ° eller injicerede lentivectors udtrykker shRNA direkte i murine hjernevæv for at undersøge den rolle, som PrP C ekspressionsniveauer i prionsygdom. Disse forskere fundet at reducere mængden af neuronal PrP C resulterede i at standse den gradvise neuropatologi af prionsygdomme og forlænget dyrenes liv 6-9. Vi har rapporteret, at PrP C siRNA behandlingsresultater i clearance af PrP Res i mus neuroblastomceller 10. Disse undersøgelser antyder, at anvendelse af terapier for at formindske PrP C ekspressionsniveauer, ligesom små interfererende RNA (siRNA), som spalter mRNA, kan tilstrækkeligt forsinke progressionen af prionsygdomme. Imidlertid blev de fleste terapier undersøgt for prionsygdomme leveret på måder, som ikke ville være praktiski et klinisk miljø. Derfor er en siRNA terapi behov for et systemisk leveringssystem, som leveres intravenøst og målrettet til CNS.
Forskere har undersøgt anvendelsen af liposomer som leveringsvehikler til genterapi produkter. Kationiske og anioniske lipider begge anvendes i dannelsen af liposomer. Kationiske lipider er mere udbredt end anioniske lipider fordi ladningen forskellen mellem det kationiske lipid og DNA / RNA muliggør effektiv emballage. En anden fordel ved kationiske lipider er, at de krydser cellemembranen lettere end andre lipider 11-14. Men kationiske lipider er mere immunogene end anioniske lipider 13,14. Derfor har forskere begyndt at skifte fra at bruge kationiske til anioniske lipider i liposomer. Genterapiprodukter effektivt kan pakkes i anioniske liposomer under anvendelse af positivt ladede peptid protaminsulfat, som kondenserer DNA / RNA-molekyler 15-19. Da anioniske Lipids er mindre immunogene end kationiske lipider, de kan have øget cirkulation gange, og kan være mere tolereres i dyremodeller 13,14. Liposomer er målrettet til specifikke væv ved hjælp af målrettet peptider, der er knyttet til liposomerne. RVG-9r neuropeptid, som binder til nicotinacetylcholinreceptorer, er blevet anvendt til at målrette siRNA og liposomer til CNS 17-20.
Denne rapport skitserer en protokol til at producere tre siRNA levering køretøjer, og til at pakke og levere siRNA til neuronale celler (Figur 1). Liposom-siRNA-peptidkomplekser (LSPCs) er sammensat af liposomer med siRNA og RVG-9r målrettende peptid elektrostatisk bundet til den ydre overflade af liposomet. Peptid rettet liposomindkapslet terapeutiske siRNA (PALETS) er sammensat af siRNA og protamin indkapslet i liposomet, med RVG-9r kovalent bundet til lipid PEG-grupper. Brug nedenstående metoder til at generere LSPCs og PALETS, PrP ° siRNA falder PrP ° ekspression op til 90% i neuronale celler, der besidder et fantastisk løfte at helbrede eller i det væsentlige sinke udviklingen af prionsygdom patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus blev avlet og holdt på Lab Animal Resources, akkrediteret af Association for Vurdering og akkreditering af Lab Animal Care International, i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Colorado State University.
1. Udarbejdelse af LSPCs
- Brug en 1: 1 DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propan): cholesterol ratio for LSPCs. For en 4 nmol liposompræparat, bland 2 nmol DOTAP og 2 nmol af kolesterol i 10 ml af en 1: 1 chloroform: methanol-opløsning i en kolbe.
- Fordampe 9 ml af chloroform: methanol-opløsning under anvendelse af N 2-gas i et stinkskab. Fordampe de sidste 1 ml opløsningsmiddel i et stinkskab natten over uden gas. Observere en tynd lipidfilm på bunden af kolben.
- Heat 10 ml af en 10% saccharoseopløsning til 55 ° C.
- Hæld den opvarmede 10% saccharoseopløsning på den tynde lipidfilm langsomt, dvs. 1 ml / min, mens gently hvirvlende kolben. Opretholde 10% sucrose og kolbe med lipider ved 55 ° C, således at lipidmolekylerne forbliver i gelen-væskefase. Rehydrering resulterer i multilamellære vesikel (MLV) formation.
- Tillad lipider at rehydrere ved 55 ° C i mindst en time før størrelsessortering liposomerne.
- Saml en ekstruder pr producentens anvisninger med 1,0 um filtre eller bruge 1,0 um sprøjtefiltre for dimensionering.
- Der tilsættes 1 ml opvarmet liposomsuspension til en af sprøjterne på ekstruderen, og passerer suspensionen mellem de to sprøjter 11 gange. Sørg for, at suspensionen er i den modsatte sprøjte end udgangspunktet sprøjte efter 11 passerer.
- Størrelse liposomerne igen gennem 0,45 um derefter 0,2 um filtre til at generere store unilamellare vesikler (LUV'er). Hold liposomsuspensionen opvarmet i lettere dimensionering.
- Inkuber 20 pi af 4 nmol liposomsuspension (200 uM) med 200 pi af en 20 pM (4nmol i alt) lager siRNA opløsning i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuber 80 pi af en 500 um (40 nmol i alt) stock RVG-9r opløsning med siRNA / liposom opløsningen i 10 minutter ved stuetemperatur. LSPCs bør anvendes så hurtigt som muligt, men kan bruges op til flere timer efter fremstilling. Opbevar LSPCs ved 4 ° C i flere timer efter tilberedning.
2. Udarbejdelse af PALETS
- Brug en 55: 40: 5 molært forhold på enten DSPE (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin): cholesterol: DSPE-PEG eller DOTAP: cholesterol: DSPE-PEG for PALETS. For en 4 nmol liposompræparat, blandes 2,2 nmol enten DSPE eller DOTAP, 1,6 nmol cholesterol og 0,2 nmol DSPE-PEG i 10 ml af en 2: 1 chloroform: methanol-opløsning i en kolbe.
- Forbered liposomsuspension nøjagtigt som beskrevet i trin 1.1 og 1.2 ovenfor. Rehydrér DSPE-liposomer i 10 ml 1x PBS opvarmet til 75 ° C, tilsætning af 1 ml / min. Tillad lipider at rehydrere ved 75 ° C imindst 1 time før dimensionering.
- Størrelse liposomsuspensionen nøjagtigt som beskrevet i trin 1,6-1,8.
- Pipetter 20 pi af hver af de 4 nmol (200 uM) liposomsuspensioner til engangsbrug alikvoter efter DOTAP og DSPE-liposomer har været dimensioneret, og lyofilisere i 30 minutter under anvendelse af en bordmodel-frysetørrer (figur 2).
- Inkuber 200 pi af en 20 pM (4 nmol i alt) lager siRNA-opløsning med 1,4 pi af en 26,6 pM opløsning af protaminsulfat i 10 minutter ved stuetemperatur i siRNA, der skal indkapsles i DSPE palets liposomer.
- Rehydrere DOTAP palets liposomer med 200 pi af en 4 nmol stamopløsning af siRNA eller rehydrere DSPE palets liposomer med 201,4 pi af siRNA / protamin-opløsning. Inkuber liposom / siRNA-opløsning i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt 10 gl af en 60 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid-hydrochlorid (EDC) opløsning til liposomet / siRNA løsning for både DOTAP og DSPE PALETS.
- Tilsæt 10 gl af en 150 mM N-hydroxysulfosuccinimid (sulfo-NHS) opløsning til liposomet / siRNA løsning for både DOTAP og DSPE PALETS.
- Inkubér EDC og sulfo-NHS med siRNA / liposomsuspensionen i 2 timer ved stuetemperatur.
- Inkuber 80 pi af en 500 um (40 nmol i alt) stock RVG-9r opløsning med siRNA / liposom tværbinding opløsningen i 10 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: EDC / sulfo-NHS tillader RVG-9r til covalent binding til PEG lipider. Brug PALETS inden for flere timer efter tilberedning. Opbevar PALETS ved 4 ° C i flere timer efter tilberedning. - For at bestemme siRNA indkapslingseffektivitet PALETS:
- Måle koncentrationen af siRNA før og efter tilsætning af protamin og liposomer under anvendelse af et spektrofotometer indstillet ved 260 nm.
- Foretage uindkapslede siRNA fra liposomet / indkapslet siRNA suspension under anvendelse af 50 kDa centrifugalfiltre. Centrifuger ved 1.000 xg i 20 min.
- Måle koncentrationen afuindkapslet siRNA i filtratet og koncentrationen af indkapslet siRNA i retentatet anvendelse af et spektrofotometer ved 260 nm.
3. Injektion mus med LSPCs eller PALETS
- Expose mus for 5-10 min til en varmelampe at spile kar.
- Bedøver musen med en 2-3% isofluoran / ilt flow 5-10 min før injektion, og under injektion. Bekræft bedøvelse når dyr ikke længere ambulant og åndedræt har bremset ved at gøre en tå knivspids. Placer musen på ryggen eller siden at få adgang halevenen. Brug dyrlæge salve på musens øjne til at forhindre udtørring mens under anæstesi.
- Tør / spray halen med 70% EtOH og injicere 300 pi LSPCs eller PALETS onto halevenen på musen under anvendelse af en 26 G insulinsprøjte. Start indsprøjtning distalt i halevenen og flytte proximalt hvis venen kollapser eller brud.
- Placer musen i en ren bur indtil det opretholder brystleje. Placer ikke mobrug med andre bur kammerater, indtil den er fuldt tilbagebetalt. Mus bør komme i 5 til 15 min. De kan placeres på en varmepude eller under en varmelampe for at opretholde kropstemperaturen hvis inddrivelse tager længere tid. Mus bør overvåges nøje for at sikre mod overophedning.
- Overvåg dyret flere timer efter injektion for at sikre bedøvelsen aftager, og der er ingen skadelige virkninger af behandlingen. Lad LSPCs eller PALETS til at cirkulere i mindst 24 timer.
4. Analyse af proteinekspression via flowcytometri
- Aflive mus med en CO 2 strømningshastighed 20% i 15 min.
- Dissekere ud halv halvkugle af hjernen ved bortskæring huden og kraniet af musen med en saks. Peel væk halv halvkugle af hjernen væk fra kraniet ved tænger eller slutningen af en saks.
- Tryk halv halvkugle af hjernen fra hver mus gennem en 40 um mesh cellefilter anvendelse af 2,5 ml FACS puffer (1x, PBS, 1% føtalt bovint serum, 10 mM EDTA) i en petriskål med stemplet af en sprøjte.
- Skyl cellesigte og petriskål med yderligere 2,5 ml FACS buffer. Sæt enkelt cellesuspension i en 15 ml konisk rør på is.
- Pipetter 100 pi af 5 ml enkelt cellesuspension i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og centrifugeres i 5 minutter ved 350 x g. Supernatanten fjernes, og resuspender cellepelleten i 1 ml FACS buffer. Spin ved 350 xg i 5 min. Gentag med yderligere 1 ml FACS buffer. Hold cellesuspensionen på is.
- Inkubér cellerne i 100 pi 1: 100 fortynding af en 0,5 mg / ml rotte-anti-muse-Fc blokeret FACS buffer i 30-60 min på is. Pellet og vaske cellerne som i trin 4.5. Hold cellesuspensionen på is.
- Inkubér cellerne i 100 pi af en 20 ug / ml fluorescerende antistof mod muse PrP C i 7% museserum i FACS-buffer på is i 30-60 min. Pellet og vaske cellerne som i trin 4.5. Hold cellesuspensionenpå is.
- Pellet og resuspender cellerne i 1 ml RBC lysis buffer (1x PBS, 155 mM NH4CI, 12 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA) i 1 min. Pellet som i trin 4.5 og cellerne resuspenderes i 1 ml FACS buffer. Hold cellesuspensionen på is.
- Analyser PrP C-ekspression under anvendelse af et flowcytometer som tidligere 10 beskrevet. Gate levende celler fra totale cellepopulation. Gate PrP C + celler fra levende cellepopulation til bestemmelse MFI (median fluorescensintensitet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at øge effektiviteten af siRNA indkapsling inden anioniske PALETS blev siRNA blandet med protamin. At bestemme den bedste protaminkoncentration for siRNA blev siRNA blandet med forskellige koncentrationer af protamin, fra 1: 1 til 2: 1 (figur 3A). Der var en 60-65% siRNA indkapslingseffektivitet i anioniske liposomer uden anvendelse af protamin. Prøver med protamin: siRNA molære forhold fra 1: 1 til 1,5: 1 (133-266 nM) havde 80-90% siRNA indkapsling. Molære forhold over 1,5: 1 resulterede i udfældning af siRNA / protaminreaktive komplekser. Disse udfældede komplekser blev ikke indkapslet i anioniske liposomer. Efter tilsætning af protamin til siRNA der var et lille fald i koncentrationen af siRNA, grundet fortynding; Koncentrationen forblev stabil efter tilsætning af protamin (figur 3B). Efter filtrering liposomerne med 50 kDa filtre, 90-95% af siRNAvar forbundet med liposomet retentatet, mens 5-10% af siRNA var "frie" i filtratet. Nr siRNA blev påvist i protamin eller liposom kun prøver (figur 3C).
For at bestemme virkningen af LSPCs in vivo, blev vildtypemus behandlet med LSPCs i 24 timer. PrP C ekspressionsniveauer af vild-type mus behandlet med LSPCs blev sammenlignet med mus behandlet med 1 x PBS og til PrP knockout (PrP KO) mus (Figur 4). Flowcytometrisk analyse af PrP ° i hjernerne hos mus behandlet med LSPCs viste et fald i PrP C-niveauer (figur 4A og 4B). I et eksperiment alle mus havde 80-90% reduktion af PrP C niveauer tæt på PrP C-niveauer, der blev observeret i de PrP KO-mus (figur 4A). Mus behandlet med LSPCs i to mere uafhængige forsøg viste en reduktion 40-80% af PrP C </ sup> niveauer (figur 4B). Ud af de samlede LSPCs behandlede mus (n = 14), var der kun én mus havde ingen reaktion på LSPCs.
Figur 1:. Oversigt over protokollen til at generere palets / LSPCs og Deliver siRNA intravenøst til CNS af mus Liposomer blev genereret via den tynde lipid film hydrering metode. PrP C siRNA blev derefter fastgjort til liposomerne enten gennem en elektrostatisk interaktion eller ved indkapsling. De PALETS eller LSPCs blev afsluttet ved tilsætning af CNS målrette peptid RVG-9r. Efter samling, de PALETS / LSPCs blev injiceret i halen vener i mus, og 24 timer efter behandling PrP C-ekspression blev vurderet via flowcytometri. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Protokol af den tynde lipidfilm Hydration metode til at generere DSPE Liposomer for PALETS Delivery Vehicle Lipiderne blev opløst og blandet i en chloroform:. Methanolopløsning, som blev inddampet til frembringelse af en tør lipidfilm. Den tørre lipidfilm blev resuspenderet i 1 x PBS at skabe multilamellare vesikler (MLV'er). MLV'er blev herefter ensartet størrelse ved anvendelse af en ekstruder til frembringelse af LUV. LUV'erne kan derefter bruges i suspension eller frysetørret i engangsbrug portioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Indkapsling Effektivitet af siRNA i DSPE PALETS u Sing protaminsulfat. (a) ca. 60-65% af siRNA blev indkapslet uden tilsætning af protamin. Med tilføjelsen af protamin, der var en 90% indkapslingseffektivitet mellem 1: 1 og 1,5: 1 protamin: siRNA-forhold. (B) Efter frafiltrering af liposomerne fra enhver fri siRNA, blev 90% af siRNA findes i den liposomale fraktion, hvorimod blev fundet 5-10% af ikke-indkapslet siRNA i filtratet. (C) Protamin og liposom kun løsninger er fri for indkapslet siRNA. Ca. 60-65% af siRNA var indkapslet i DSPE-liposomer uden anvendelse af protamin. Med brugen af protamin i en koncentration på 186,2 nM, blev ca. 90% af siRNA indkapslet i DSPE-liposomer. Fejlsøjler indikerer SEM. **** Angiver P <0,0001. * Angiver P <0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Repræsentant flowcytometrisk analyse af Brain-suspensioner 24 timer efter behandling med LSPCs LSPCs blev injiceret i halevenerne af vild-type mus og hjernerne blev høstet 24 timer senere. PBS blev anvendt som en behandling kontrol, og en PrP KO mus blev anvendt som en kontrol for PrP C niveauer. (A) mus behandlet med LSPCs viste et signifikant fald i PrP C niveauer sammenlignet med PBS-kontrol, der viser vildtype PrP C niveauer. De LSPCs behandlede mus viste PrP C niveauer tæt på den for et PrP KO mus. (B) Kumulative data fra tre uafhængige forsøg, der anvender samme 24 timers behandlingsprotokol viste den relative mængde af PrP C i PBS-vildtype og LSPCs behandlede mus. På tværs af de tre eksperimenter, mus behandlet med LSPCs Shoons signifikante fald i PrP C niveauer i forhold til PBS vildtype kontrol. Fejlsøjler indikerer SEM. *** Angiver p <0,0003. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapport beskriver en protokol til at oprette to målrettede doseringssystemer, der effektivt transporterer siRNA til CNS. Tidligere metoder til at levere siRNA til CNS inkluderet injicere siRNA / shRNA vektorer direkte ind i hjernen, intravenøs injektion af målrettet siRNA eller intravenøs injektion af ikke-målrettede liposom-siRNA komplekser. Injektion af siRNA / shRNA vektorer i CNS forårsager et fald i målprotein ekspressionsniveauer. Men den siRNA / shRNA ikke diffundere frit gennem CNS. Desuden er disse injektioner medføre skade på det tilstødende nervevæv 6-9. Den intravenøse injektion af målrettet siRNA resulterer også i reduktion af målproteinet. Men de fleste af siRNA nedbrydes af serumproteiner 20. Endelig intravenøs injektion af ikke-målrettede liposomdannende siRNA komplekser resulterer i indfangning af siRNA i leveren og nedbrydning af det mononukleære fagocytsystem 21. Leveringen siRNAkøretøjer er beskrevet ovenfor, LSPCs og PALETS, giver en sikrere, mere effektivt, og effektiv levering system end tidligere metoder ved at levere siRNA direkte til CNS. De LSPCs og PALETS er også i stand til at transportere andre små molekyler lægemidler til CNS.
PALETS eller LSPCs skal bruges inden for et par timer efter montering. Ellers er der risiko for, at siRNA bliver ikke-funktionel / nedbrudt. Den anden kritiske trin, der ikke kan stoppes / afbrudt er forberedelse og afvikling af cellesuspensionen til flowcytometri. Det er vigtigt at udføre flowcytometri på samme dag, at cellen suspension fremstilles, idet suspensionen indeholder levende celler, der skal være i live til analyse.
Der er et par skridt i den protokol, som kan ændres alt efter om de LSPCs eller PALETS vil blive anvendt in vitro eller in vivo, på hvilke små molekyler lægemiddel indføres i LSPCs eller PALETS, og på arbejdeDELSE præference. For det første kan de lipid molforhold for de LSPCs og PALETS optimeres til andre anvendelser. Men fugter phosphatidylethanolamin (PE i DSPE) dårligt, når det anvendes på en 60% vægt / vægt eller højere. Når de anvendes ved disse højere koncentrationer, vil DSPE molekyler aggregere med hinanden og danner et uopløseligt masse af lipider. Denne masse af lipider er ikke i stand til at indkapsle siRNA. Hvis N2 gas ikke er tilgængelig, kan lipid mix tørres ved hjælp fordampning. Fordampning tager omkring 3 dage og bør udføres i et stinkskab på grund af anvendelsen af methanol og chloroform. I denne protokol, blev den tynde lipid film resuspenderes med 1x PBS, men det kan også resuspenderes med andre hydrering buffere. Andre puffere indbefatter vand, 10% sucrose, eller enhver anden vandig buffer. Valget af rehydrering buffer er afhængig af den tilsigtede anvendelse af liposomerne og midlet er indkapslet i liposomet 22,23. Hydrering puffer skal holdes over gelen-liquid krystal overgangstemperatur (Tc eller Tm) af lipider eller liposomerne vil ikke rehydrere korrekt. I den beskrevne protokol blev de suspenderede liposomer med ensartet størrelse ved anvendelse af en ekstruder. Imidlertid kan liposomerne også dimensioneres ved anvendelse sprøjtefiltre eller lydbehandling. Det samme filter porestørrelser anvendes til ekstruderen kan anvendes som sprøjtefiltre. Desuden kan liposomsuspensionen blive ændret efter hydrering med siRNA løsning. Imidlertid observerede vi et tab af siRNA fra liposomer, når dimensioneret af ekstruderen efter hydrering trin (upublicerede data).
Da biologiske rolle PrP C endnu ikke er forstået 5, er det muligt, at der kunne være nogle skadelige virkninger frembragt ved at reducere PrP C niveauer. Men fordi prionproteingener deficiente mus udvikler, opfører, og alder normalt 24, er det sandsynligt, at disse skadelige virkninger enten ville være mindre eller ikke synligt synlige. Endvidere siRNA knockdown af PrP <sup> C udtryk ville ikke helt afskaffe proteinekspression og er helt reversible uden mulighed for viral onkogenese modsætning lentivector RNAi 23.
Begrænsninger med levering systemer omfatter reduceret optagelse af anioniske PALETS i biologiske membraner, og immunogenicitet LSPCs på grund af de kationiske lipider. Hvis der observeres immunogenicitet LSPCs, kan PALETS anvendes som et alternativ. Reduceret optagelse af anioniske PALETS til anioniske biologiske membraner kan overvindes ved anvendelse af kationiske PALETS, eller ved at omformulere anioniske PALETS med en blanding af kationiske og anioniske lipider.
I denne rapport, reduktion af PrPc varierer meget fra mus til mus. Denne variation kan skyldes en række faktorer: variation mellem mus, den lille diameter af vener i mus, eller nedbrydning af siRNA. Anvendelsen af indavlede mus bør fjerne meget af variabiliteten mellem mus, men variation er altid muligt selvmed indavlede mus. Også mus har meget små vener sammenlignet med andre dyremodeller. Så indsprøjte et stort volumen i venerne i mus kan være problematisk. Vi anbefaler praktiserende injektioner, før du prøver at injicere PALETS eller LSPCs. Men selv med praksis, nogle gange er det stadig tager et par indsprøjtninger for at få hele det volumen af palets / LSPCs i musen, og venen kan kollapse på én af disse injektioner. Så kunne man mus modtage hele det volumen af palets / LSPCs, mens en anden mus kun måtte modtage 75-90% af palets / LSPCs volumen.
Andre mulige kilder til variation omfatter cirkulation tid og nedbrydning af siRNA af serum proteiner. De palets / LSPCS kunne cirkulere længere, før de når hjernen i en mus i forhold til et andet, som kunne forklare variationen. Vi kun tilladt LSPCs at cirkulere i 24 timer før euthanizing mus i ovenstående eksperiment. Hvis cirkulationen tiden er årsag til variation, derefter øge circulation tid end 24 timer bør reducere nogle variation. Selvom vi pakke siRNA med palets / LSPCs, er der altid en chance for nedbrydning af siRNA og / eller levering køretøjer. Som tidligere nævnt, de kationiske lipider er lidt immunogene. Så hvis immunceller i blodbanen angriber køretøjerne, så det ville tage længere tid for de køretøjer, der skal leveres til hjernen eller køretøjer kan blive forringet. Skift fra kationiske lipider til anioniske PALETS kan medvirke til at reducere den langsomme cirkulation tid eller nedbrydning ved brug af kationiske lipider.
Den RVG-9r peptid transporterer LSPCs og PALETS til en celle i CNS, der indeholder nikotin acetylcholin receptorer. Dette omfatter både neuronale celler microgliale celler og astrocytter 26. For PALETS eller LSPCs at være en effektiv behandling for prionsygdomme er det vigtigt at målrette alle celler, der bidrager til prion patogenese. Neuronale celler indeholder mest PrP C 27,28. Målretning neuronale celler og reducere cellernes PrP C udtryk kan resultere i et fald i prion patogenese. Men neuronale celler er ikke den eneste celletype, der bidrager til prionsygdom. Astrocytter er blevet impliceret i replikationen af prioner 29,30. Derfor er det ikke kun vigtigt at målrette neuronale celler, men også at målrette astrocytter at reducere prion patogenese.
De administrationssystemer, der er beskrevet her, er egnede til forskellige optimering strategier, der ville gøre dem egnede til en lang række sygdomstilstande applikationer. LSPCs og PALETS er i stand til at transportere enhver lille molekyle lægemidlet til CNS, ikke bare siRNA, som giver de biler potentiale til at behandle mere end bare neurodegenerative sygdomme. PALETS og LSPCs kunne bruges til at behandle enhver sygdom, der påvirkerhjernen afhængig af den lille molekyle lægemiddel fyldt i køretøjerne. Også ændring af målrettende peptid kan tillade tilførselsvehiklerne at levere lægemidler med små molekyler til en specifik undergruppe af celler i CNS, i stedet for hvilken som helst celle, der har acetylcholinreceptorer. PALETS og LSPCs repræsenterer en hidtil ukendt, mere effektivt og fleksibelt system til småmolekylelægemidler levering til behandling af sygdomme, der påvirker CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M.
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
