Introduction
Prioner är svåra neurodegenerativa sjukdomar som påverkar CNS. Prionsjukdomar resulterar från felveckning av den normala cellulära prionproteinet, PrP C genom en smittsam isomeren som kallas PrP Res. Dessa sjukdomar påverkar en mängd olika arter, inklusive bovin spongiform encefalopati hos kor, scrapie hos får, chronic wasting disease hos hjortdjur, och Creutzfeldt-Jakobs sjukdom hos människor 1-3. Prioner orsakar neurodegeneration som börjar med synaptiska förlust, och utvecklas till vakuolisering, glios, neuronal förlust, och plakett insättningar. Till slut, vilket resulterar i djurets död / individ 4. I decennier har forskare undersökt föreningar avsedda att bromsa eller stoppa utvecklingen av prionsjukdom. Däremot har forskarna inte hittat antingen en framgångsrik terapi eller en effektiv systemisk leverans fordon.
Endogena PrP C uttryck krävs för utvecklingen av prionsjukdomar 5 C uttryck resulterar i en fördröjning eller lindring av sjukdom. Flera grupper skapade transgena möss med reducerade nivåer av PrP C eller injicerade lentivectors uttrycker shRNA direkt i murina hjärnvävnad att undersöka vilken roll PrP C uttrycksnivåer i prionsjukdom. Dessa forskare har hittats att minska mängden av neuronal PrP C resulterade i att hejda den progressiva neuropatologi av prionsjukdomar och förlängde livslängden hos djuren 6-9. Vi har rapporterat att PrP C siRNA behandlingsresultat i clearance av PrP Res i mus neuroblastomceller 10. Dessa studier tyder på att användning av behandlingar för att minska PrP C uttrycksnivåer, som små störande RNA (siRNA), som klyver mRNA, kan tillräckligt fördröja utvecklingen av prionsjukdomar. Emellertid var de flesta behandlingar undersöktes för prionsjukdomar som levereras på ett sätt som inte skulle vara praktiskti en klinisk miljö. Därför måste en siRNA terapi en systemisk tillförselsystem, som levereras intravenöst och riktad till CNS.
Forskare har studerat användningen av liposomer som avgivningsvehiklar för genterapiprodukter. Katjoniska och anjoniska lipider används båda i bildandet av liposomer. Katjoniska lipider större utsträckning än anjoniska lipider eftersom laddningsskillnad mellan katjonisk lipid och DNA / RNA möjliggör effektiv förpackning. En annan fördel med katjoniska lipider är att de korsar cellmembranet lättare än andra lipider 11-14. Men katjoniska lipider är mer immunogena än anjoniska lipider 13,14. Därför har forskare börjat skifta från att använda katjoniska till anjoniska lipider i liposomer. Genterapiprodukter effektivt kan förpackas i anjoniska liposomer med hjälp av positivt laddade peptiden protaminsulfat, som kondenserar DNA / RNA-molekyler 15-19. Eftersom anjoniska lipids är mindre immunogena än katjoniska lipider de kan ha ökad cirkulationstider, och kan mer tolereras i djurmodeller 13,14. Liposomer riktade mot specifika vävnader med hjälp av inriktning peptider som är kopplade till liposomerna. Den RVG-9r neuropeptid, som binder till nikotinacetylkolinreceptorer, har använts för att rikta in siRNA och liposomer till CNS 17-20.
Denna rapport beskriver ett protokoll för att producera tre siRNA leveransfordon, och att paketera och leverera siRNA till neuronala celler (Figur 1). Liposom-siRNA-peptidkomplex (LSPCs) är sammansatta av liposomer med siRNA och RVG-9r targeting peptiden elektrostatiskt fäst vid den yttre ytan av liposomen. Peptid adresserade liposominkapslat terapeutiska siRNA (PALETS) består av siRNA och protamin inkapslat i liposomen, med RVG-9r kovalent bunden till lipid PEG-grupper. Med hjälp av nedanstående metoder för att generera LSPCs och PALETS, PrP C siRNA minskar PrP C uttryck upp till 90% i nervceller, som är en stark kandidat för att bota eller väsentligen fördröja uppkomsten av prionsjukdom patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss avlades och hölls vid Lab Animal Resources, som godkänts av Föreningen för bedömning och ackreditering av Lab Animal Care International, i enlighet med protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid Colorado State University.
1. Framställning av LSPCs
- Använda en 1: 1 DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimetylammonium-propan): kolesterol-förhållande för LSPCs. För en 4 nmol liposom beredning, blanda 2 nmol DOTAP och 2 nmol av kolesterol till 10 ml av en 1: 1 kloroform: metanol-lösning på en kolv.
- Indunsta 9 ml av kloroform: metanol-lösning med användning av N 2-gas i ett dragskåp. Indunsta de sista 1 ml lösningsmedel i ett dragskåp över natten utan gas. Observera en tunn lipidfilm på botten av kolven.
- Heat 10 ml av en 10% sackaroslösning till 55 ° C.
- Häll den uppvärmda 10% sackaroslösning på den tunna lipidfilmen långsamt, dvs 1 ml / min, medan gently virvling av kolven. Upprätthålla den 10% sackaros och kolv med lipider vid 55 ° C, så att de lipidmolekyler kvar i gel-vätskefasen. Rehydrering resulterar i multilamellär vesikel (MLV) bildas.
- Tillåt lipider för att rehydrera vid 55 ° C under minst en timme före sorteringen liposomerna.
- Montera en extruder enligt tillverkarens anvisningar med 1,0 um filter eller använda 1,0 um sprutfilter för dimensionering.
- Tillsätt 1 ml av den uppvärmda liposomsuspensionen till en av sprutorna på extrudern, och passera suspensionen mellan de två sprutorna 11 gånger. Se till att suspensionen är i motsatt sprutan än utgångs sprutan efter 11 passerar.
- Storlek liposomerna på nytt genom 0,45 um sedan 0,2 pm filter för att generera stora unilamellära vesiklar (LUV). Hålla liposomsuspensionen upphettades för enklare dimensionering.
- Inkubera 20 pl av 4 nmol liposomsuspensionen (200 iM) med 200 | il av en 20 ^ M (4nmol totalt) lager siRNA lösning under 10 min vid rumstemperatur.
- Inkubera 80 | il av en 500 ^ M (40 nmol totalt) lager RVG-9r lösningen med siRNA / liposomlösningen i 10 min vid RT. LSPCs bör användas så snart som möjligt, men kan användas upp till flera timmar efter framställning. Butiks LSPCs vid 4 ° C under flera h efter beredning.
2. Beredning av PALETS
- Använd en 55: molförhållande 5 av antingen DSPE (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin): 40 kolesterol: DSPE-PEG eller DOTAP: kolesterol: DSPE-PEG för PALETS. För en 4 nmol liposom beredning, blanda 2,2 nmol antingen DSPE eller DOTAP, 1,6 nmol av kolesterol, och 0,2 nmol av DSPE-PEG i 10 ml av en 2: 1 kloroform: metanol-lösning på en kolv.
- Förbered liposomsuspension precis som beskrivs i steg 1,1 och 1,2 ovan. Rehydrera DSPE-liposomer i 10 ml 1 x PBS upphettades till 75 ° C, tillsats av 1 ml / min. Låt lipider att rehydrera vid 75 ° C underminst en timme före sorteringen.
- Storlek liposomsuspensionen exakt som beskrivs i steg 1,6-1,8.
- Pipettera 20 | il av var och en av de 4 nmol (200 | iM) liposomsuspensioner i engångsbruk alikvoter efter DOTAP och DSPE-liposomer har varit storlek, och lyofilisera under 30 min med användning av en bords frystorkare (Figur 2).
- Inkubera 200 | il av en 20 ^ M (4 nmol totalt) lager siRNA-lösning med 1,4 | il av en 26,6 ^ M lösning av protaminsulfat i 10 min vid RT i siRNA som skall inkapslas i DSPE palets liposomer.
- Rehydrera DOTAP palets liposomerna med 200 pl av en 4 nmol stamlösning av siRNA eller rehydrera DSPE palets liposomer med 201,4 pl av siRNA / protaminlösning. Inkubera liposom / siRNA lösning under 10 min vid RT.
- Tillsätt 10 | il av en 60 mM 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimidhydroklorid (EDC) lösning på liposom / siRNA lösning för både DOTAP och DSPE PALETS.
- Tillsätt 10 pl av en 150 mM N-hydroxisulfosuccinimid (sulfo-NHS) lösning på liposom / siRNA lösning för både DOTAP och DSPE PALETS.
- Inkubera EDC och sulfo-NHS med siRNA / liposomsuspensionen under 2 h vid RT.
- Inkubera 80 | il av en 500 ^ M (40 nmol totalt) lager RVG-9r lösningen med siRNA / liposom tvärbindningslösning under 10 min vid RT.
OBS! EDC / sulfo-NHS tillåter RVG-9r att kovalent bindning till PEG lipider. Använd PALETS inom flera timmar efter beredning. Butiks PALETS vid 4 ° C under flera h efter beredning. - Att bestämma siRNA inkapslingseffektivitet av PALETS:
- Mäta koncentrationen av siRNA före och efter tillsatsen av protamin och liposomer med användning av en spektrofotometer inställd på 260 nm.
- Filtrera okapslad siRNA från liposomen / inkapslade siRNA suspensionen med hjälp av 50 kDa centrifugal filter. Centrifugera vid 1000 xg under 20 min.
- Mäta koncentrationen avoinkapslat siRNA i filtratet och koncentrationen av inkapslat siRNA i retentatet med hjälp av en spektrofotometer vid 260 nm.
3. Injicera möss med LSPCs eller PALETS
- Utsätta möss för 5-10 min till en värmelampa att vidga blodkärlen.
- Söva musen med en 2-3% isofluoran / syre flöde 5-10 minuter före injektion, och under injektion. Bekräfta anesthetization när djuret inte längre ambulant och andetag har saktat genom att göra en tå nypa. Placera musen på rygg eller på sidan för att komma till svansvenen. Använd veterinär salva på mus ögon för att förhindra uttorkning under anestesi.
- Torka / spraya svansen med 70% EtOH och injicera 300 pl LSPCs eller PALETS på svansvenen av musen med en insulinspruta 26 G. Börja injicera distalt i svansvenen och flytta proximalt om venen kollapsar eller brister.
- Placera musen i en ren bur tills den håller sternala VILA. Placera inte moanvändning med andra burkamrater tills den har återhämtat sig helt. Möss bör återhämta sig under 5 till 15 minuter. De kan placeras på en värmedyna eller under en värmelampa för att hålla kroppstemperaturen om återhämtningen tar längre tid. Möss bör kontrolleras noggrant för att skydda mot överhettning.
- Övervaka djuret flera timmar efter injektion för att säkerställa anestesi avtar, och det finns inga skadliga effekter av behandlingen. Tillåta LSPCs eller PALETS att cirkulera i minst 24 timmar.
4. Analys av proteinuttryck via flödescytometri
- Euthanize möss med en CO 2 flödeshastighet 20% under 15 min.
- Dissekera ut en halv hemisfär av hjärnan genom att skära bort huden och skallen av mus med sax. Skala bort en halv hemisfär av hjärnan från skallen med tång eller slutet av en sax.
- Tryck en halv hemisfär av hjärnan från varje mus genom ett 40 pm mesh cell sil med användning av 2,5 ml FACS-buffert (1x; PBS, 1% fetalt bovint serum, 10 mM EDTA) i en petriskål med kolven hos en spruta.
- Skölj cellfilter och petriskål med ytterligare 2,5 ml FACS-buffert. Sätta enda cellsuspension i en 15 ml koniskt rör på is.
- Pipettera 100 | il av 5 ml enda cellsuspension i en 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugera i 5 min vid 350 x g. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml FACS-buffert. Snurra vid 350 xg under 5 min. Upprepa med ytterligare 1 ml FACS buffert. Håll cellsuspensionen på is.
- Inkubera cellerna i 100 pl 1: 100-spädning av en 0,5 mg / ml rått-anti-mus-Fc-block i FACS-buffert under 30-60 min på is. Pellet och tvätta cellerna som i steg 4,5. Håll cellsuspensionen på is.
- Inkubera cellerna i 100 pl av en 20 | ig / ml fluorescerande antikropp mot mus-PrP C i 7% musserum i FACS-buffert på is under 30-60 min. Pellet och tvätta cellerna som i steg 4,5. Håll cellsuspensionenpå is.
- Pelleten och återsuspendera cellerna i 1 ml RBC lyseringsbuffert (1x PBS, 155 mM NH4CI, 12 mM NaHCOa 3, 0,1 mM EDTA) under 1 minut. Pellet som i steg 4,5 och återsuspendera cellerna i 1 ml FACS-buffert. Håll cellsuspensionen på is.
- Analysera PrP C uttryck med hjälp av en flödescytometer som beskrivits tidigare 10. Gate levande celler från den totala cellpopulationen. Gate PrP C + celler från levande cellpopulation för att bestämma MFI (median fluorescensintensitet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att öka effektiviteten hos siRNA inkapsling inom anjoniska PALETS var siRNA blandades med protamin. För att bestämma den bästa protaminkoncentrationen för siRNA, var siRNA blandades med olika koncentrationer av protamin, från 1: 1 till 2: 1 (figur 3A). Det fanns en 60-65% siRNA inkapslingseffektivitet i anjoniska liposomer utan användning av protamin. Prover med protamin: siRNA molförhållanden från 1: 1 till 1,5: 1 (133-266 nM) hade 80-90% siRNA inkapsling. Molförhållanden över 1,5: 1 resulterade i utfällning av siRNA / protaminkomplex. Dessa utfällda komplex inte kapslas in anjoniska liposomer. Efter tillsatsen av protamin till siRNA det fanns en liten droppe i koncentrationen av siRNA, på grund av utspädning; förblev dock koncentrationen stabil efter tillsatsen av protamin (Figur 3B). Efter filtrering liposomerna med 50 kDa-filter, 90-95% av siRNAvar associerad med liposomen retentatet, medan 5-10% av siRNA var "fria" i filtratet. Ingen siRNA upptäcktes i protamin eller liposom bara prover (Figur 3C).
För att bestämma effekten av LSPCs in vivo, var vild typ möss behandlade med LSPCs för 24 h. PrP C uttrycksnivåer av vildtyp möss behandlade med LSPCs jämfördes med möss behandlade med 1 x PBS och PrP knockout (PrP KO) möss (Figur 4). Flödescytometrisk analys av PrP C i hjärnan hos möss som behandlats med LSPCs visade en minskning i PrP C-nivåerna (figur 4A och 4B). I ett experiment, alla möss hade 80-90% reduktion av PrP C-nivåer, nära PrP C-nivåer som observerades i de PrP KO-möss (Figur 4A). Möss behandlades med LSPCs i ytterligare två oberoende experiment visade en minskning från 40 till 80% av PrP C </ sup> nivåer (Figur 4B). Av de totala LSPCs behandlade möss (n = 14), fanns det bara en mus hade inget svar på de LSPCs.
Figur 1:. Översikt av protokollet att generera palets / LSPCs och leverera siRNA intravenöst till CNS hos möss Liposomer genererades via den tunna lipidfilmen hydrering metod. PrP C siRNA fästes sedan till liposomerna antingen genom en elektrostatisk interaktion eller genom inkapsling. De PALETS eller LSPCs fördes genom tillsats av CNS inriktning peptid RVG-9r. Efter montering, de PALETS / LSPCs injicerades i svansvenerna hos möss, och 24 timmar efter behandling PrP C uttryck bedömdes via flödescytometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Protokoll av de tunna lipidfilmen Hydration metod för att generera DSPE Liposomer för PALETS leveransmedlet Lipiderna löstes och blandades i en kloroform:. Metanol-lösning, som indunstades för att alstra en torr lipidfilm. Den torra lipidfilmen återsuspenderades i 1 x PBS för att skapa multilamellära vesiklar (MLV). MLV sedan enhetligt storlek med hjälp av en extruder för att generera LUV. De LUV kan sedan användas i suspension, eller frystorkas i engångsbruk alikvoter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: inkapslingseffektivitet av siRNA till DSPE PALETS u Sing protaminsulfat. (A) Om 60-65% av siRNA inkapslades utan tillsats av protamin. Med tillsats av protamin, fanns det en 90% inkapslingseffektivitet mellan 1: 1 och 1,5: 1 protamin: siRNA-förhållande. (B) Efter bortfiltrering av liposomerna från någon fri siRNA, var 90% av den siRNA som finns i den liposomala fraktionen, medan 5-10% av oinkapslat siRNA hittades i filtratet. (C) Protamin och liposomer endast lösningar är fria från inkapslat siRNA. Ca 60-65% av siRNA var inkapslad i DSPE liposomer utan användning av protamin. Med användningen av protamin vid en koncentration av 186,2 nM, var ca 90% av siRNA inkapslas i DSPE-liposomer. Felstaplar indikerar SEM. **** Indikerar P <0,0001. * Indikerar P <0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Representativa flödescytometrisk analys av Brain cellsuspensioner 24 h efter behandling med LSPCs LSPCs injicerades i svansvenerna hos vildtyp möss och hjärnor skördades 24 h senare. PBS användes som en behandlingskontroll och en PrP KO-mus användes som en kontroll för PrP C-nivåerna. (A) Möss som behandlats med LSPCs visade en signifikant minskning av PrP C-nivåer jämfört med PBS-kontroll, som visar vildtyp PrP C-nivåerna. De LSPCs behandlade möss visade PrP C-nivåer nära det av en PrP KO musen. (B) De samlade uppgifter från tre oberoende experiment med användning av samma 24 hr behandlingsprotokoll visade den relativa mängden PrP C i PBS vildtyp och LSPCs behandlade möss. Över de tre experimenten, möss behandlade med LSPCs showed betydande minskningar i PrP C-nivåer jämfört med PBS vildtyp kontroller. Felstaplar indikerar SEM. *** Indikerar p <0,0003. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna rapport beskriver ett protokoll för att skapa två system för målstyrning som effektivt transporterar siRNA till CNS. Tidigare metoder för att leverera siRNA mot CNS inkluderade injicera siRNA / shRNA vektorer direkt i hjärnan, intravenös injektion av riktade siRNA, eller intravenös injektion av icke-riktade liposom-siRNA-komplex. Injektion av siRNA / shRNA vektorer i CNS orsakar en minskning av målprotein expressionsnivåer. Emellertid inte siRNA / shRNA inte diffundera fritt genom CNS. Dessutom är dessa injektioner resulterar i skada på intilliggande nervvävnaden 6-9. Intravenös injektion av riktade siRNA resulterar också i en minskning av målproteinet. Men de flesta av siRNA bryts ned av serumproteiner 20. Slutligen, intravenös injektion av oriktade liposom-siRNA komplex resulterar i infångning av siRNA i levern och nedbrytning av det mononukleära fagocytsystemet 21. Den siRNA deliveryfordon som beskrivs ovan, LSPCs och PALETS ger en säkrare, effektivare och effektivt leveranssystem än tidigare metoder genom att leverera siRNA direkt till CNS. De LSPCs och de PALETS har också förmåga att transportera andra småmolekylära läkemedel till CNS.
PALETS eller LSPCs bör användas inom några timmar efter montering. Annars finns det en risk för att siRNA blir icke-funktionella / försämras. Den andra kritiska steget som inte kan stoppas / avbrytas är framställningen och driften av cellsuspensionen för flödescytometri. Det är viktigt att utföra flödescytometri på samma dag som cell suspension framställs, eftersom suspensionen innehåller levande celler som måste vara vid liv för analys.
Det finns några steg i det protokoll som kan ändras beroende på om LSPCs eller PALETS kommer att användas in vitro eller in vivo, på vilken liten molekyl läkemedlet laddas i LSPCs eller PALETS, och på arbeteAtory preferens. För det första kan de lipid molförhållanden av de LSPCs och PALETS optimeras för andra tillämpningar. Men hydrater fosfatidyletanolamin (PE i DSPE) dåligt när de används i en 60% vikt / vikt eller högre. När de används vid dessa högre koncentrationer, kommer DSPE molekyler aggregera med varandra och bildar en olöslig massa av lipider. Denna massa av lipider kan inte inkapsla siRNA. Om N2-gas är tillgänglig, kan lipid blandning torkas med hjälp av avdunstning. Avdunstning tar cirka 3 dagar, och bör utföras i ett dragskåp på grund av användningen av metanol och kloroform. I detta protokoll, var den tunna lipidfilmen återsuspenderades med 1 x PBS, men det kan också vara utspätt med andra vätske buffertar. Andra buffertar innefattar vatten, 10% sackaros, eller någon annan vattenhaltig buffert. Valet av rehydrering buffert är beroende av den avsedda användningen av liposomerna och det medel som inkapslat i liposomen 22,23. Den vätske bufferten bör hållas över gel-liquid crystal övergångstemperatur (Te eller Tm) av lipider eller liposomerna kommer inte att rehydrera korrekt. I det beskrivna protokollet, har de suspenderade liposomerna enhetligt dimensionerad med användning av en strängsprutmaskin. Däremot kan liposomerna också dimensioneras med hjälp av sprutfilter eller ultraljudsbehandling. Samma filter porstorlekar som används för extrudern kan användas som sprutfilter. Dessutom kan liposomsuspensionen storleksändras efter hydratisering med siRNA lösning. Men observerade vi en förlust av siRNA från liposomer när storlek av extrudern efter hydrering steget (opublicerade data).
Eftersom den biologiska rollen av PrP C ännu inte förstås 5, är det möjligt att det kan finnas vissa skadliga effekter, framställda genom reducering PrP C-nivåerna. Eftersom prionprotein brist möss utvecklar, beter sig, och ålder normalt 24, är det troligt att dessa skadliga effekter antingen skulle vara mindre eller inte synligt uppenbar. Dessutom siRNA knockdown av PrP <sup> C uttryck skulle inte helt avskaffa proteinuttryck och är helt reversibel utan möjlighet till viral onkogenes, till skillnad från lentivector RNAi 23.
Begränsningar med leveranssystem innefattar minskad upptagning av anjoniska PALETS i biologiska membran, och immunogenicitet LSPCs på grund av de katjoniska lipider. Om immunogenicitet av de LSPCs observeras, kan PALETS användas som ett alternativ. Reducerat upptag av anjoniska PALETS till anjoniska biologic membran kan övervinnas genom användning katjoniska PALETS, eller genom att omformulera anjoniska PALETS med en blandning av katjoniska och anjoniska lipider.
I denna rapport, en minskning av PrP varierar kraftigt från mus till mus. Denna variation kan bero på en mängd olika faktorer: variation mellan möss, med liten diameter av vener i möss, eller nedbrytning av siRNA. Användningen av inavlade möss bör eliminera en stor del av variationen mellan möss, men variationen är alltid möjligt ävenmed inavlade möss. Också, möss har mycket små vener i förhållande till andra djurmodeller. Så kan injicera en stor volym i venerna hos möss vara problematisk. Vi rekommenderar att öva injektioner innan du försöker att injicera PALETS eller LSPCs. Men även med praktiken, ibland fortfarande tar ett par injektioner för att få all den volym palets / LSPCs i musen, och venen kan kollapsa på någon av dessa injektioner. Så kan en mus får hela volymen av palets / LSPCs, medan en annan mus kan bara ta emot 75-90% av den palets / LSPCs volym.
Andra möjliga källor till variation inkluderar cirkulationstiden och nedbrytning av siRNA av serumproteiner. De PALETS / LSPCS kan cirkulera längre innan den når hjärnan i en mus jämfört med en annan, vilket skulle kunna förklara variationen. Vi tillät endast LSPCs cirkulera under 24 h före euthanizing möss i experimentet ovan. Om cirkulationstiden orsakar variation, då ökar Circulation tiden bortom 24 h bör minska viss variation. Även om vi paketera siRNA med palets / LSPCs, det finns alltid en risk för nedbrytning av siRNA och / eller leveransfordon. Som nämnts tidigare, de katjoniska lipiderna är något immunogena. Så, om immunceller i blodet attackerar de fordon, då det skulle ta längre tid för de fordon som skall levereras till hjärnan eller fordonen kan bli förstörd. Byte från katjoniska lipider på anjoniska PALETS kan bidra till att minska den långsamma cirkulationstiden eller nedbrytning vid användning av katjoniska lipider.
Den RVG-9r peptid transporterar LSPCs och PALETS till en cell i CNS som innehåller nikotinacetylkolinreceptorer. Detta inkluderar både nervceller mikrogliaceller och astrocyter 26. För PALETS eller LSPCs att vara en effektiv behandling för prionsjukdomar är det viktigt att rikta alla celler som bidrar till prion patogenes. Neuronala celler innehåller den mest PrP C 27,28. Inriktning neuronala celler och minska cellernas PrP C uttryck kan resultera i en minskning av prion patogenes. Emellertid neuronala celler är inte den enda celltypen som bidrar till prionsjukdom. Astrocyter har varit inblandade i replikationen av prioner 29,30. Därför är det inte bara viktigt att rikta neuronala celler, utan att också rikta astrocyter att minska prion patogenes.
Tillförselsystemen som beskrivs här är mottaglig för olika optimering strategier som skulle göra dem lämpliga för ett brett spektrum av applikationer sjukdoms. LSPCs och PALETS är i stånd att transportera en liten molekyl läkemedel till CNS, inte bara siRNA, vilket ger fordonen potential att behandla mer än bara neurodegenerativa sjukdomar. PALETS och LSPCs skulle kunna användas för att behandla någon sjukdom som påverkarhjärnan beroende på den lilla molekylen läkemedlet laddas i fordonen. Dessutom kan ändra inriktning peptiden tillåta leveransfordon att leverera småmolekylära läkemedel till en särskild undergrupp av celler i CNS, i stället för en cell som har acetylkolinreceptorer. PALETS och LSPCs representerar en ny, mer effektiv och flexibel leveranssystem för småmolekylära läkemedel för behandling av sjukdomar som drabbar det centrala nervsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M.
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
