Introduction
プリオンは、CNSに影響を与える深刻な神経変性疾患です。プリオン病は、PrP RESと呼ばれる感染性異性体によって、正常な細胞プリオンタンパク質、のPrP Cのミスフォールディングに起因します。これらの疾患は、人間1-3でシカで羊、慢性消耗病におけるスクレイピー、牛における牛海綿状脳症を含む種の多種多様な影響を及ぼし、およびクロイツフェルト・ヤコブ病。プリオンは、シナプスの損失で始まる神経変性を引き起こし、空胞化、グリオーシス、ニューロン損失、およびプラーク沈着に進行します。結局、4個々の動物/の死に至ります。数十年にわたって、研究者は、プリオン病の進行を遅らせるまたは停止することを意味する化合物を調査しました。しかし、研究者は、成功した治療や効果的な全身送達ビヒクルのいずれかを見つけていません。
内因性のPrP Cの発現は、プリオン病の発症のために必要とされる5 Cの発現が遅延または疾患の改善をもたらすことができます。いくつかのグループは、プリオン病でのPrP C発現レベルの役割を調べるために、マウス脳組織に直接shRNAを発現のPrP Cの減少したレベルまたは注入レンチベクターを用いてトランスジェニックマウスを作成しました。これらの研究者は、プリオン病の進行性の神経病理の停止をもたらし、動物6-9の寿命を延長し、ニューロンのPrP Cの量を低減することがわかりました。我々は、マウス神経芽腫細胞10内のPrP RESのクリアランスのことのPrP C siRNA処理の結果を報告しています。これらの研究は療法の使用は、低分子干渉RNA（siRNA）、切断するmRNAのように、のPrP Cの発現レベルを減少させるために十分なプリオン病の進行を遅らせることができることを示唆しています。しかし、プリオン病について調査し、最も治療法は実用的ではない方法で配信されていました臨床設定インチこのために、siRNA療法は、CNSに静脈内に送達し、標的とする全身性送達システムを必要とします。
研究者らは、遺伝子治療製品の送達ビヒクルとしてのリポソームの使用を研究しました。カチオン性およびアニオン性脂質は、両方の、リポソームの形成に使用されます。カチオン性脂質とDNA / RNA間の電荷の差が効率的なパッケージングを可能にするためのカチオン性脂質は、より広くアニオン性脂質よりも使用されています。カチオン性脂質の他の利点は、他の脂質11-14より容易に細胞膜を通過することです。しかし、カチオン性脂質はアニオン性脂質13,14よりも免疫原性です。そのため、研究者らは、リポソーム中のアニオン性脂質にカチオンを使用してからシフトし始めています。遺伝子治療製品を効率的にDNA / RNA分子15-19を凝縮正に荷電したペプチドの硫酸プロタミンを用いてアニオン性リポソーム中にパッケージングすることができます。アニオン性LIPIので、DSは、彼らが循環時間を増加していることがあり、より多くの動物モデル13,14に許容され得るカチオン性脂質よりも免疫原性が低いです。リポソームは、リポソームに結合しているペプチドを標的に使用して特定の組織を標的とします。ニコチン性アセチルコリン受容体に結合するRVG-9R神経ペプチドは、CNS 17-20にsiRNAおよびリポソームを標的化するために使用されてきました。
このレポートは、3 siRNA送達車を生産するための、および神経細胞（ 図1）に対するsiRNAをパッケージ化して提供するためのプロトコルの概要を説明します。リポソームのsiRNAペプチド複合体（LSPCs）は、siRNAおよび静電リポソームの外表面に付着したRVG-9Rターゲティングペプチドを有するリポソームから構成されています。ペプチドは、RVG-9Rが共有脂質、PEG基に結合して、siRNAおよびリポソーム内に封入されたプロタミンで構成されている治療のsiRNA（PALETS）をカプセル化されたリポソームを取り上げました。 LSPCsとPALETを生成するには、以下の方法を使用してSは、のPrP C siRNAは、治癒または、実質的にプリオン病の病態の発症を遅延させるための途方もない約束を保持している神経細胞で90％、最大のPrP Cの発現を低下させます。
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Protocol
すべてのマウスは、コロラド州立大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って、ラボ動物ケア・インターナショナルの評価と認定協会の認定を受け、研究室動物資源で飼育し、維持しました。
LSPCsの調製
- 1 DOTAP（1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム - プロパン）：LSPCsのためのコレステロール比1を使用してください。 1クロロホルム：フラスコ内のメタノール溶液4ナノモルのリポソーム製剤については、DOTAPの2ナノモルと1の10ミリリットルへのコレステロールの2ナノモルを混ぜます。
- ドラフト内でN 2ガ スを用いたメタノール溶液：クロロホルムの9ミリリットルを蒸発させます。ガスなしで一晩換気フード内の溶媒の最後の1ミリリットルを蒸発させます。フラスコの底に薄い脂質フィルムを観察します。
- 熱、55℃に10％ショ糖溶液10mlを。
- GEながら、 すなわち、1ml /分、徐々に薄い脂質フィルム上に加熱された10％スクロース溶液を注ぎntlyフラスコを旋回。脂質分子はゲル - 液相に残るように55℃での脂質と10％のショ糖、フラスコを維持します。多重膜小胞（MLV）の形成での再水和をもたらします。
- 脂質がリポソームをサイジングする前に、少なくとも1時間、55℃で再水和することができます。
- 1.0μmのフィルターを製造者の指示に従って、押出機を組み立てたり、サイジングのために1.0μmのシリンジフィルターを使用しています。
- 押出機での注射器のいずれかに加熱されたリポソーム懸濁液の1ミリリットルを追加し、2つのシリンジ11時間の間のサスペンションを渡します。懸濁液を11回通過した後に開始し、注射器よりも反対注射器であることを確認します。
- サイズその後、0.45μmの0.2μmのフィルターを通して再びリポソームは、大型単層小胞（LUVを）を生成します。簡単にサイズ調整のために加熱し、リポソーム懸濁液を保管してください。
- 20μM（4200μlで4ナノモルリポソーム懸濁液（200μM）の20μLをインキュベート室温で10分間ナノモル合計）株式のsiRNA溶液。
- RTで10分間のsiRNA /リポソーム溶液と500μM（40ナノモル合計）株式RVG-9R液80μLをインキュベートします。 LSPCsはできるだけ早く使用されるべきであるが、調製後数時間まで使用することができます。調製後、数時間のために4℃で保存しLSPCs。
PALETSの調製
- 40：：DSPE（1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン）のいずれかの5のモル比：コレステロール：DSPE-PEGまたはDOTAP：コレステロール：DSPE-PEG PALETSのための55を使用してください。 1クロロホルム：フラスコ内のメタノール溶液4ナノモルのリポソーム製剤については、2の10ミリリットルにDSPEまたはDOTAPのいずれかの2.2ナノモル、コレステロールの1.6ナノモル、及びDSPE-PEGの0.2ナノモルを混ぜます。
- ステップ1.1以上1.2で説明したように正確にリポソーム懸濁液を準備します。 1×PBS 10ml中DSPEリポソームを再水和を1ml /分を追加して、75℃に加熱しました。脂質は時のために75℃で再水和することを許可しますサイジングの前に少なくとも1時間。
- サイズステップ1.6から1.8に記載とおりにリポソーム懸濁液。
- 4ナノモルのそれぞれのピペットを20μl（200μM）リポソーム懸濁液の単一使用のアリコートへのDOTAPおよびDSPEリポソームはサイズされた後、およびベンチトップ凍結乾燥機（ 図2）を使用して、30分間凍結乾燥。
- DSPE PALETSリポソーム中に封入されるsiRNAをRTで10分間、硫酸プロタミンの26.6μM溶液を1.4μlの20μM（4ナノモル合計）株式のsiRNA溶液200μlをインキュベートします。
- siRNAの4ナノモルストック溶液の200μlでDOTAP PALETSリポソームを再水和またはsiRNA /プロタミン溶液を201.4μlのDSPE PALETSリポソームを再水和。 RTで10分間リポソーム/ siRNA溶液をインキュベートします。
- 60mMの1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）の10μLをDOTAPとDSPE PALETS両方用リポソーム/ siRNA溶液の溶液を加えます。
- 両方のDOTAPおよびDSPE PALETS用リポソーム/ siRNA溶液に150mMのN-ヒドロキシ（スルホNHS）溶液10μlを加えます。
- RTで2時間のsiRNA /リポソーム懸濁液とEDCおよびスルホNHSをインキュベートします。
- RTで10分間この溶液を架橋するsiRNA /リポソームと500μM（40ナノモル合計）株式RVG-9R液80μLをインキュベートします。
注：EDC /スルホNHSはPEG脂質に共有結合にRVG-9Rを可能にします。調製後、数時間以内にPALETSを使用してください。調製後、数時間のために4℃で保存しPALETS。 - PALETSのsiRNA封入効率を決定するには：
- 260nmで設定し、分光光度計を使用してプロタミン及びリポソームの添加前および後のsiRNAの濃度を測定します。
- 50kDaの遠心フィルターを使用してリポソーム/カプセル化されたsiRNAの懸濁液から封入されていないのsiRNAをフィルタリングします。 20分1,000×gで遠心分離します。
- の濃度を測定260nmで分光光度計を使用して、ろ液および保持液中のカプセル化されたsiRNAの濃度でカプセル化されていないのsiRNA。
3. LSPCsまたはPALETSをマウスに注射
- 血管系を拡張するために熱ランプに5〜10分間、マウスを公開します。
- 5〜10分間注入前、および注入中に2から3パーセントイソフルオラン/酸素流量でマウスを麻酔。動物がもはや通院で、呼吸がつま先のピンチを実行して、減速しているときに麻酔を確認していません。尾静脈にアクセスするには、その背面または側面にマウスを置きます。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を使用してください。
- ワイプ/ 70％エタノールで尾をスプレーし、26 Gインスリン注射器を用いて、マウスの尾静脈にLSPCsまたはPALETSの300μLを注入します。尾静脈に遠位に注入開始し、静脈が崩壊または破裂場合近位に移動します。
- それは胸骨横臥位を維持するまで、クリーンなケージにマウスを置きます。 MOを置かないでくださいそれは完全に回復するまで、他のケージの仲間と一緒に使用。マウスは、5〜15分で回復する必要があります。彼らは、回復に時間がかかる場合には、体温を維持するために加温パッド上又は加熱ランプの下に配置することができます。マウスは、過熱から保護するために注意深く監視する必要があります。
- 麻酔が切れる確実にするために数時間注入後に動物を監視し、治療の全く悪影響はありません。 LSPCsまたはPALETSは、少なくとも24時間循環させます。
フローサイトメトリーを介して、タンパク質発現の4解析
- 15分間、20％CO 2の流量でマウスを安楽死させます。
- ハサミを用いてマウスの皮膚と頭蓋骨を切り取ることにより、脳の半分の半球を解剖。ピール離れて半分離れトングやハサミの先端を使って頭蓋骨から脳の半球。
- プレス半分のFACS緩衝液2.5ミリリットルを使用して、40μmのメッシュセルストレーナーを介して、各マウスからの脳の半球（1倍、シリンジのプランジャーを有するペトリ皿にPBS、1％ウシ胎児血清、10mMのEDTA）。
- FACS緩衝液のさらに2.5 mlの細胞ストレーナーとペトリ皿をすすぎます。氷上で15ミリリットルコニカルチューブに単一細胞懸濁液を入れてください。
- ピペットで350×gで5分間1.5 mlのマイクロ遠心チューブと遠心分離機に5ミリリットル単一細胞懸濁液100μl。上清を捨て、FACS緩衝液1ml中に細胞ペレットを再懸濁します。 5分間、350×gでスピン。 FACS緩衝液の別の1ミリリットルで繰り返します。氷上で細胞懸濁液を保管してください。
- 1100μlの細胞をインキュベート：FACS緩衝液中の0.5mg / mlのラット抗マウスFcブロックの100倍希釈を氷上で30〜60分間。ペレット化し、ステップ4.5のように細胞を洗浄します。氷上で細胞懸濁液を保管してください。
- 30〜60分間氷上でFACS緩衝液中で7％マウス血清中のマウスのPrP Cに対する20 / mlの蛍光抗体を100μlで細胞をインキュベートします。ペレット化し、ステップ4.5のように細胞を洗浄します。細胞懸濁液を保ちます冷やして。
- ペレットおよび1分RBC溶解緩衝液（1×PBS、155 mMのNH 4 Cl を 、12 mMの炭酸水素ナトリウム、0.1mMのEDTA）1ml中に再懸濁細胞。ステップ4.5のようにペレットとは、FACS緩衝液1mlに細胞を懸濁します。氷上で細胞懸濁液を保管してください。
- 以前10記載されているように、フローサイトメーターを使用してのPrP Cの発現を解析。ゲートは、全細胞集団から細胞を生きています。ゲートのPrP C + MFI（蛍光強度中央値）を決定するために、生細胞集団由来の細胞。
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Representative Results
アニオンPALETS内のsiRNAのカプセル化の効率を高めるために、siRNAは、プロタミンと混合しました。 1（ 図3A）：1〜2：siRNAのための最高のプロタミン濃度を決定するために、siRNAは、1から、プロタミンの異なる濃度で混合しました。プロタミンを使用せずに、アニオン性リポソームで60〜65%のsiRNA封入効率がありました。プロタミンとサンプル：siRNAのモル比は1：1〜1.5：1（133から266 nM）を80〜90％のsiRNAを封入していました。 1.5上記のモル比：1は、siRNA /プロタミン複合体の沈殿を生じました。これらの沈殿した複合体は、アニオン性リポソームにカプセル化されませんでした。 siRNAのにプロタミンを添加した後、希釈によるsiRNAの濃度のわずかな低下がありました。しかし、濃度は、プロタミンを添加した （ 図3B）の後に安定していました。 50 kDaのフィルタは、siRNAの90％〜95％で、リポソームをろ過した後siRNAの5から10パーセントは、濾液中の「無料」であった、リポソーム保持物と関連していました。いいえsiRNAは、プロタミンまたはリポソームのみのサンプル（ 図3C）で検出されませんでした。
in vivoでのLSPCsの効果を決定するために、野生型マウスは、24時間LSPCsで処理しました。 LSPCsで処置した野生型マウスののPrP Cの発現レベルは、1×PBSで処置したマウスおよびノックアウトのPrP（PrPのKO）マウス（ 図4）と比較しました。 LSPCsで処置したマウスの脳内のPrP Cのフローサイトメトリー分析は、PrP Cのレベルの減少を示した（図4Aおよび4B）。 1つの実験において、全てのマウスは、PrP KOマウス（ 図4A）で観察されたのPrP Cのレベルに近いのPrP Cレベルの80〜90％の削減を、持っていました。 2つの独立した実験でLSPCsで処置されたマウスは、<のPrP C 40〜80％の減少を示しました。/ SUP>のレベル（ 図4B）。マウス（n = 14）で処理した総LSPCsのうち、1匹のマウスだけがあったLSPCsに対する応答がありませんでした。
図1：プロトコルの概要PALETS / LSPCsを生成し、マウスのCNS へのsiRNAの静脈内投与を配信するためのリポソームは、脂質薄膜水和法によって生成しました。 PrP C siRNAは、その後、静電相互作用を介して、またはカプセル化のいずれかによってリポソームに結合させました。 PALETSまたはLSPCsは、CNS標的化ペプチドのRVG-9Rの添加により完了しました。治療のPrP C発現をフローサイトメトリーによって評価された後に組み立てた後、PALETS / LSPCsは、マウスの尾静脈に注射し、24時間行った。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：薄い脂質フィルム水和法のプロトコルPALETS配達車両のDSPEリポソームを生成するために、脂質をクロロホルムに溶解し、混合した。乾燥した脂質膜を生成するために蒸発させてメタノール溶液。乾燥脂質フィルムは、多層小胞（MLVを）を作成する1×PBSに再懸濁しました。 MLVが、その後、均一たLUVを生成するために、押出機を用いて寸法分類しました。 LUVをその後、懸濁液中で使用される、または単回使用のアリコートで凍結乾燥することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：DSPE PALETS UへのsiRNAの封入効率 siRNAの約60から65パーセントは、プロタミンを添加せずにカプセル化された硫酸プロタミン。（Aを ）歌います。 1と1.5：1プロタミン：siRNAの比率プロタミンを添加すると、1〜90％の封入効率がありました。カプセル化されていないsiRNAの5〜10％が濾液中に見出されたのに対し、（B）任意の遊離のsiRNAのリポソームを濾過した後、siRNAの90％が、リポソーム画分に見出されました。 （C）プロタミンおよびリポソームは、唯一の解決策は、カプセル化されたsiRNAの自由です。 siRNAの約60から65パーセントは、プロタミンを使用せずにDSPEリポソーム内に封入しました。 186.2 nMの濃度のプロタミンを用いて、siRNAの約90％は、DSPEリポソーム内に封入しました。エラーバーはSEMを示します。 **** P <0.0001を示します。 * P <0.01を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 脳細胞懸濁液の代表的なフローサイトメトリー分析LSPCsでの処理後24時間 LSPCsは野生型マウスと脳の尾静脈に注射した24時間後に回収しました。 PBSを処置コントロールとして使用し、そしてPrPのKOマウスは、のPrP Cレベルの対照として使用しました。 LSPCsで処理した（A）マウスは、野生型のPrP Cのレベルを示すPBS対照と比較したPrP Cのレベルの有意な減少を示しました。処置マウスLSPCsは、PrP KOマウスのそれに近いのPrP Cのレベルを示しました。同じ24時間の治療プロトコルを使用して3つの独立した実験から、（B）累積データはPBS野生型中のPrP Cの相対量を示し、LSPCsマウスを治療しました。 LSPCs笙で処理された3つの実験、マウスアクロスPBS野生型対照と比較したPrP Cのレベルの有意な減少を結婚。エラーバーはSEMを示します。 *** P <0.0003を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このレポートでは、効率的にCNSに対するsiRNAをトランスポート2の標的送達システムを作成するためのプロトコルについて説明します。 CNSに対するsiRNAを送達する従来の方法は、脳、標的としたsiRNAの静脈内注射、または非標的リポソームのsiRNA複合体の静脈内注射に直接のsiRNA / shRNAのベクトルを注入含まれています。 CNSへのsiRNA / shRNAのベクターの注入は、標的タンパク質の発現レベルの減少を引き起こすことはありません。しかし、siRNAを/ shRNAがCNSを通して自由に拡散しません。さらに、これらの注射は、隣接する神経組織6-9に損傷をもたらします。標的としたsiRNAの静脈内注射は、標的タンパク質の減少をもたらします。しかし、siRNAのほとんどは血清タンパク質20によって分解されます。最後に、単核食細胞系21による肝臓や劣化内のsiRNAの取り込みにおける非標的リポソームのsiRNA複合体の結果の静脈注射。 siRNA送達上記の車両、LSPCsとPALETSは、CNSへの直接のsiRNAを送達することにより、以前の方法よりも、より安全でより効果的、かつ効率的な配信システムを提供します。 LSPCsとPALETSもCNSに他の小分子薬物を輸送することが可能です。
PALETSまたはLSPCsは、組み立て後数時間以内に使用する必要があります。そうでなければ、siRNAが分解/非機能的になる危険性があります。 /中断し停止することはできません他の重要なステップは、フローサイトメトリー用の細胞懸濁液を調製し、動作しています。懸濁液は、分析のために生きている必要があり、生細胞を含んでいるので、細胞懸濁液が調製され、同じ日にフローサイトメトリーを行うことが重要です。
小分子薬物がLSPCsまたはPALETSにロードされるかについて、労働上、LSPCsまたはPALETSがin vitroまたはin vivoで使用されるかどうかに応じて変更することができ、プロトコル内のいくつかのステップがあります。atoryの好み。まず、LSPCsとPALETSの脂質のモル比は、他の用途のために最適化することができます。 60％（重量/重量）以上で使用した場合しかし、ホスファチジルエタノールアミン（DSPEにおけるPE）が不十分な水和します。これらの高濃度で使用される場合、DSPE分子が互いに凝集し、脂質の不溶性の塊を形成します。脂質のこの質量は、siRNAを封入することができません。 N 2ガ スが使用できない場合は、脂質混合物は、蒸発を使用して乾燥させることができます。蒸発は、約3日かかり、メタノールおよびクロロホルムの使用のためにドラフト中で実施すべきです。このプロトコルでは、薄い脂質膜を1×PBSで再懸濁したが、それはまた他の水和緩衝液で再懸濁することができます。他の緩衝液、水、10％のスクロース、または任意の他の水性緩衝液を含みます。再水和緩衝液の選択は、リポソームの使用目的に依存しており、エージェントは、リポソーム22,23内にカプセル化されています。水和バッファは、ゲルLIQ以上に維持する必要があります脂質またはリポソームのuidの結晶転移温度（TcまたはTm）が適切に再水和されません。記載されたプロトコルでは、懸濁したリポソームは、一様に押出機を用いて寸法分類しました。しかし、リポソームはまた、シリンジフィルターまたは超音波処理を使用して大きさにすることができます。押出機に使用される同じフィルタ孔径は、シリンジフィルターとして使用することができます。また、リポソーム懸濁液は、siRNA溶液で水和した後にサイズを変更することができます。水和工程（未発表データ）した後、押出機によりサイズしかし、我々は、リポソームからのsiRNAの損失を観察しました。
PrP Cの生物学的役割は、まだ5に理解されていないので、PrP Cのレベルを低下させることにより製造いくつかの有害な効果がある可能性があります。しかし、プリオンタンパク質欠損マウスは発症するので、振る舞い、および年齢通常は24、これらの有害な影響は目に見えて明らかマイナーかないだろうどちらかと思われます。さらに、のPrPのsiRNAノックダウン<SUP> C式は完全にレンチベクターのRNAi 23とは異なり、タンパク質の発現を廃止し、ウイルス発癌の可能性なしで完全に可逆的ではないでしょう。
送達システムとの制限が減少し、生体膜へのアニオン性PALETSの取り込み、およびカチオン性脂質によるLSPCsの免疫原性が含まれます。 LSPCsの免疫原性が観察された場合、PALETS代替として使用することができます。アニオン性の生物学的膜へのアニオンPALETSの取り込みの減少は、カチオンPALETSを使用することによって、またはカチオン性およびアニオン性脂質の混合物を用いてアニオンPALETS改質することによって克服することができます。
この報告書では、のPrPCの減少は、マウスからマウスに大きく異なります。この変化は、種々の要因に起因し得る：siRNAのマウスとの間の変動、マウスにおける静脈の小径、または分解。近交系マウスの使用は、マウス間の変動の多くを排除する必要がありますが、ばらつきがあっても常に可能です近交系マウスを用いました。また、マウスは、他の動物モデルと比較して非常に小さい血管を有します。そこで、マウスの静脈に大量に注入すると、問題となる可能性があります。我々はPALETSまたはLSPCsを注入しようとする前に注射の練習をお勧めします。しかし、実際に、時にはそれはまだマウスにPALETS / LSPCsのすべてのボリュームを取得するために注射のカップルを取り、静脈は、これらの注入のいずれかで折りたたむことができます。別のマウスのみPALETS / LSPCs量の百分の75から90までを受け取る可能性があり、一方だから、1マウスは、PALETS / LSPCsのすべてのボリュームを受け取ることがあります。
変動の他の可能な供給源は、血清タンパク質によるsiRNAの循環時間および分解を含みます。 PALETS / LSPCSは変化を説明する可能性があり、別のと比較して、1つのマウスに脳に到達する前に長い循環する可能性があります。私たちは、LSPCsは、上記の実験では、マウスを安楽死前に24時間循環させ。循環時間が変化を引き起こしている場合、CIRCULを増加させます24時間を超えエーション時間は多少のばらつきを減らす必要があります。我々はPALETS / LSPCsを有するsiRNAをパッケージにもかかわらず、siRNAおよび/または送達媒体の劣化の可能性は常にあります。前述のように、カチオン性脂質は、わずかに免疫原性です。血流内の免疫細胞が車を攻撃しているのであれば、その後の車両が脳に配信されることは時間がかかるだろうか、車が劣化になるかもしれません。アニオン性PALETSにカチオン性脂質からの切り替えは、カチオン性脂質を使用した場合、低速循環時間や劣化を減らすのに役立つ可能性があります。
RVG-9Rペプチドは、ニコチン性アセチルコリン受容体が含まれているCNS内の任意のセルにLSPCsとPALETSを転送します。これは、神経細胞、ミクログリア細胞とアストロサイト26の両方を含んでいます。 PALETSまたはLSPCsは、プリオン病の有効な治療法であるために、プリオン病因に寄与するすべての細胞を標的とすることが重要です。神経細胞は、ほとんどのPrP Cが含まれています27,28を通じてプリオンの普及に貢献するのに役立ちます。神経細胞を標的とする細胞」のPrP Cの発現を減少させることは、プリオン病因の減少につながる可能性があります。しかし、神経細胞は、プリオン病に寄与するだけの細胞タイプではありません。アストロサイトは、プリオン29,30の複製に関与しています。したがって、だけでなく、それは、神経細胞を標的とするだけでなく、プリオンの病原性を減少させるために星状細胞を標的とすることが重要です。
ここに記載の送達系は、疾患の幅広いアプリケーションに適するするであろう様々な最適化戦略に適しています。 LSPCsとPALETSは、車両にだけ神経変性疾患以上を治療する可能性を与えたsiRNAだけでなく、CNSに任意の小分子薬物を輸送することができます。 PALETSとLSPCsが影響する疾患を治療するために使用することができます車にロードされた小分子薬物に依存して脳。また、ターゲティングペプチドを変更すると、送達媒体ではなく、アセチルコリン受容体を持っている任意のセルの、CNS内の細胞の特定のサブセットに小分子薬物を送達する可能性があります。 PALETSとLSPCsはCNSに影響する疾患を治療するために、小分子薬物のための新規な、より効率的かつ柔軟な送達系を表します。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
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