Introduction
פריונים הן מחלות ניווניות קשות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית. מחלות פריון לנבוע misfolding של חלבון הפריון הסלולרי הרגיל, PRP C, על ידי האיזומר זיהומיות בשם PRP מיל. מחלות אלו משפיעים מגוון רחב של מינים, כולל ספגת המוח בפרות, scrapie בכבשים, חולה במחלה ממארת כרונית cervids, ואת מחלת קרויצפלד-יעקב בבני אדם 1-3. פריונים לגרום ניוון מוחיה שמתחיל עם אובדן הסינפטי, ומתקדם כדי vacuolization, דבק, איבוד עצבי, ופיקדונות פלאק. בסופו של דבר, מה שגרם למותם של בעלי החיים / 4 פרט. במשך עשרות שנים, חוקרים חקרו תרכובות אמורות להאט או לעצור את התקדמות מחלת פריון. עם זאת, חוקרים לא מצאו או טיפול מוצלח או רכב משלוח מערכתי אפקטיבי.
ביטוי PRP C אנדוגני נדרש לפיתוח מחלות הפריון 5 C עלול לגרום עיכוב או שיפור של מחלה. מספר קבוצות יצרו עכברים טרנסגניים עם רמות נמוכות של PRP C או lentivectors מוזרק המבטא shRNA ישירות לתוך רקמת המוח בעכברים לחקור את התפקיד של רמות הביטוי PRP C במחלת הפריון. חוקרים אלה מצאו הפחתת כמות העצבית PRP C הביא לעצירת בנוירופתולוגיה מתקדמת של מחלות הפריון והאריך את החיים של בעלי החיים 6-9. אנחנו דיווחנו על תוצאות טיפול PRP C siRNA בסילוק של PRP מיל בתאי נוירובלסטומה עכבר 10. מחקרים אלה מראים כי השימוש של טיפולים כדי להפחית את רמות ביטוי PRP C, כמו RNA התערבות הקטן (siRNA), אשר מסלק mRNA, אולי מספיק לעכב את התקדמות מחלות פריון. עם זאת, רוב הטיפולים נחקר למחלות הפריון נמסרו בדרכים לא יהיה מעשיבמסגרת רפואית. לכן, טיפול siRNA צריך מערכת משלוח מערכתית, אשר מועברת דרך וריד וממוקד אל מערכת העצבים המרכזי.
החוקרים חקרו את השימוש ליפוזומים כרכב משלוח למוצרי ריפוי גנטי. שומני קטיוני anionic הוא משמשים ההיווצרות של ליפוזומים. שומני קטיוני משמשים באופן נרחב יותר מאשר שומני anionic כי הבדל התשלום בין שומני קטיוני ה- DNA / RNA מאפשר אריזה יעילה. יתרון נוסף של שומני קטיוני הוא שהם לחצות את קרום התא בקלות רבה יותר מאשר שומנים אחרים 11-14. עם זאת, שומנים קטיוני יותר immunogenic מאשר שומנים anionic 13,14. לכן, החוקרים החלו המעבר משימוש קטיוני כדי anionic שומנים ליפוזומים. ג'ין מוצרי טיפול ניתן לארוז ביעילות לתוך ליפוזומים anionic באמצעות סולפט protamine פפטיד בעלי מטען חשמלי חיובי, אשר מתעבה מולקולות DNA / RNA 15-19. מאז lipi anionicds פחות immunogenic מאשר שומנים קטיוני הם עשויים גדלו פעמים במחזור, ועלול להיות נסבל יותר במודלים של בעלי חיים 13,14. ליפוזומים ממוקדים רקמות ספציפיות באמצעות מיקוד פפטידים מחוברים אל ליפוזומים. ונוירופפטידים RVG-9R, אשר נקשר לקולטנים אצטילכולין ניקוטינית, נעשה שימוש כדי למקד siRNA ו ליפוזומים אל CNS 17-20.
דו"ח זה מתאר פרוטוקול לייצר שלושה כלי רכב משלוח siRNA, וכדי לארוז ולספק את siRNA לתאי נוירונים (איור 1). Liposome-siRNA-פפטיד מתחמי (LSPCs) מורכבים ליפוזומים עם siRNA ואת RVG-9R מיקוד פפטיד אלקטרוסטטי מחובר אל פני השטח החיצוני של liposome. פפטיד התייחס ליפוזום כמוס siRNA (PALETS) טיפוליות מורכבות siRNA ו protamine כמוס בתוך liposome, עם ערובה RVG-9R קוולנטית לקבוצות PEG השומנים. באמצעות השיטות הבאות כדי ליצור LSPCs ו PaletS, PRP C siRNA פוחתת ביטוי PRP C עד 90% ב תאים עצביים, אשר טומן בחובו הבטחה עצומה לרפא או מהותית לעכב את התחלתה של פתולוגיה מחלת הפריון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העכברים גידלו ומתוחזק על משאבי חיית מעבדה, מוכר על ידי האגודה הערכה וההסמכה של הבינלאומי טיפול בבעלי חיים מעבדה, בהתאם הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת קולורדו.
1. הכנת LSPCs
- השתמש 1: DOTAP 1 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-פרופאן): יחס כולסטרול עבור LSPCs. לקבלת הכנה liposome 4 nmole, לערבב 2 nmoles של DOTAP ו -2 nmoles של כולסטרול לתוך 10 מ"ל של 1: פתרון מתנול בבקבוק: כלורופורם 1.
- להתאדות 9 מ"ל של כלורופורם: פתרון מתנול באמצעות גז N 2 במנדף. לאדות את 1 מ"ל האחרון של ממס במנדף לילה בלי גז. שים סרט שומנים דק על החלק התחתון של הבקבוק.
- מקצה 10 מ"ל של תמיסת סוכרוז 10% ל -55 מעלות צלזיוס.
- יוצקים את הפתרון סוכרוז 10% מחומם על הסרט השומנים דק לאט, כלומר 1 מ"ל / דקה, תוך gently מתערבל את הבקבוק. לשמור על 10% סוכרוז בקבוק עם שומנים ב 55 מעלות צלזיוס, כך שמולקולות השומנים להישאר בשלב ג'ל נוזלי. תוצאות Rehydration ב שלפוחית multilamellar היווצרות (MLV).
- אפשר שומני רעננותם על 55 מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת לפני אומד את ליפוזומים.
- להרכיב מכבש לפי הוראות יצרן עם 1.0 מיקרומטר מסננים או להשתמש במסנני מזרק 1.0 מיקרומטר עבור אומדת.
- הוסף 1 מ"ל של ההשעיה liposome מחוממת לאחד מזרקים על מכבש, ולהעביר את ההשעיה בין שני מזרקים 11 פעמים. ודא כי ההשעיה היא בתוך המזרק מול מ המזרק המתחילות לאחר 11 המעברים.
- את הגודל ליפוזומים שוב דרך 0.45 מיקרומטר אז 0.2 מיקרומטר מסנן כדי ליצור שלפוחית unilamellar גדולה (חביבה). שמור את השעית liposome המחוממת עבור אומדת קלה.
- דגירה 20 μl של השעיה liposome 4 nmole (200 מיקרומטר) עם 200 μl של 20 מיקרומטר (4סך nmole) פתרון siRNA מניה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- דגירה 80 μl של 500 מיקרומטר (40 nmole סה"כ) פתרון המניות RVG-9R עם הפתרון siRNA / ליפוזום במשך 10 דקות ב RT. LSPCs אמור לשמש בהקדם האפשרי, אך ניתן להשתמש עד כמה שעות לאחר ההכנה. LSPCs חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות לאחר ההכנה.
2. הכנת PALETS
- השתמש 55: 40: יחס טוחנת -5 או DSPE (1,2-distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine): כולסטרול: DSPE-PEG או DOTAP: כולסטרול: DSPE-PEG עבור PALETS. לקבלת הכנה liposome 4 nmole, לערבב 2.2 nmoles מאחד DSPE או DOTAP, 1.6 nmoles של כולסטרול, ו -0.2 nmoles של DSPE-PEG לתוך 10 מ"ל של 2: פתרון מתנול בבקבוק: כלורופורם 1.
- כן השעית liposome בדיוק כמתואר שלב 1.1 ו -1.2 לעיל. רעננותם ליפוזומים DSPE ב 10 מ"ל של 1x PBS מחומם ל 75 מעלות צלזיוס, הוספת 1 מ"ל / דקה. אפשר שומני רעננותם על 75 מעלות צלזיוס למשך1 לפחות שעה לפני אומדת.
- גודל ההשעיה liposome בדיוק כמתואר שלב 1.6-1.8.
- Pipet 20 μl של כל אחד 4 nmole (200 מיקרומטר) השעיות liposome לתוך aliquots ליחד לאחר ליפוזומים DOTAP ו DSPE כבר בגודל, ו Lyophilize למשך 30 דקות באמצעות מייבש הקפאה benchtop (איור 2).
- דגירה 200 μl של 20 מיקרומטר פתרון siRNA המניה (4 nmole הכל) עם 1.4 μl של סולפט 26.6 מיקרומטר פתרון של protamine במשך 10 דקות ב RT עבור siRNA כי היא להיות במארז לתוך ליפוזומים DSPE PALETS.
- רעננותם ליפוזומים DOTAP PALETS עם 200 μl של פתרון המניות 4 nmole של siRNA או רעננותם ליפוזומים DSPE PALETS עם 201.4 μl של פתרון siRNA / protamine. דגירה פתרון liposome / siRNA למשך 10 דקות ב RT.
- הוסף 10 μl של hydrochloride carbodiimide 60 מ"מ 1-אתיל-3- (3-dimethylaminopropyl) (EDC) פתרון פתרון liposome / siRNA לשני DOTAP ו DSPE PALETS.
- הוסף 10 μl של פתרון 150 מ"מ N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) לפתרון ליפוזום / siRNA לשני DOTAP ו DSPE PALETS.
- דגירה EDC ו sulfo-NHS עם ההשעיה siRNA / liposome עבור שעה 2 ב RT.
- דגירה 80 μl של 500 מיקרומטר (40 nmole סה"כ) פתרון המניות RVG-9R עם ליפוזום siRNA / crosslinking פתרון במשך 10 דקות ב RT.
הערה: EDC / sulfo-NHS מאפשר RVG-9R לאיגרת קוולנטית את השומנים PEG. השתמש PALETS בתוך כמה שעות לאחר הכנה. PALETS חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות לאחר ההכנה. - כדי לקבוע את יעילות אנקפסולציה siRNA של PALETS:
- למדוד את הריכוז של siRNA לפני ואחרי התוספת של protamine ו ליפוזומים באמצעות ספקטרופוטומטר להגדיר ב 260 ננומטר.
- סנן את siRNA unencapsulated מן ההשעיה siRNA ליפוזום / כמוס באמצעות 50 מסננים צנטריפוגלי kDa. צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 20 דקות.
- למדוד את הריכוז שלsiRNA unencapsulated ב תסנין ואת הריכוז של siRNA הגלום retentate באמצעות ספקטרופוטומטר ב 260 ננומטר.
3. הזרקת עכברים עם LSPCs או PALETS
- לחשוף עכברים למשך 5-10 דקות כדי מנורת חום כדי להרחיב כלי דם.
- להרדים עכבר עם חמצן 2-3% isofluorane / לזרום 5-10 דקות לפני ההזרקה, ובמהלך הזריקה. אשר הרדמה כאשר חיים אינם מתנועעים ואת הנשימות האטו על ידי ביצוע קמצוץ בוהן. מניחים את העכבר על גבו או על צידו כדי לגשת וריד הזנב. השתמש במשחת וטרינר על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות לאחר הרדמה.
- נגב / לרסס את הזנב עם 70% EtOH ולהזריק 300 μl של LSPCs או PALETS על וריד הזנב של העכבר באמצעות מזרק אינסולין 26 G. התחל הזרקת distally לווריד הזנב ולעבור proximally אם הווריד מתמוטט או קרעים.
- מניחים עכבר בכלוב נקי עד שהוא מקיים שכיבה sternal. אל תניח מולהשתמש עם חבריהם לכלוב אחרים, עד שהיא התאוששה לחלוטין. עכברים צריכים להתאושש 5 עד 15 דקות. הם יכולים להיות ממוקמים על כרית חימום או תחת מנורת חום כדי לשמור על טמפרטורת גוף אם ההתאוששות אורכת זמן רב יותר. צריך להיות במעקב עכברים מקרוב כדי להגן מפני התחממות יתר.
- לפקח על מספר שעות חיה לאחר הזרקה על מנת להבטיח הרדמה פגה, ואין השפעות שליליות של הטיפול. אפשר LSPCs או PALETS להפיץ לפחות 24 שעות.
ניתוח 4. ביטוי חלבון באמצעות cytometry הזרימה
- להרדים עכברים עם קצב זרימה 20% CO 2 במשך 15 דקות.
- לנתח את חצי חצי כדור של המוח על ידי חיתוך משם את עור הגולגולת של העכבר באמצעות מספריים. לקלף חצי חצי כדור של המוח מן הגולגולת באמצעות מלקחיים או סוף זוג מספריים.
- חצי לחצו חצי כדור של המוח מפני כל עכבר דרך מסננת תא רשת 40 מיקרומטר באמצעות 2.5 מ"ל של חיץ FACS (1x; PBS, 1% בסרום שור עוברי, 10 EDTA מ"מ) בצלחת פטרי עם הבוכנה של מזרק.
- יש לשטוף את מסננת תא צלחת פטרי עם מאגר 2.5 מיליליטר נוסף של FACS. שים את ההשעיה תא בודד בתוך שפופרת חרוטי 15 מ"ל על הקרח.
- Pipet 100 μl של ההשעיה תא 5 מ"ל יחיד לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 350 x ז. מחק את התא גלולה supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של חיץ FACS. ספין ב 350 XG במשך 5 דקות. חזור עם עוד 1 מ"ל של חיץ FACS. שמור על השעיית התא על קרח.
- דגירה התאים ב 100 μl של 1: 100 דילול של חיץ 0.5 מ"ג / מ"ל עכברוש אנטי עכבר Fc לחסום FACS 30-60 דקות על הקרח. גלולה לשטוף את התאים כמו בשלב 4.5. שמור על השעיית התא על קרח.
- דגירה התאים ב 100 μl של נוגדן פלורסנט 20 מיקרוגרם / מ"ל נגד העכבר PRP C בסרום העכבר 7% חיץ FACS על קרח למשך 30-60 דקות. גלולה לשטוף את התאים כמו בשלב 4.5. שמור את ההשעיה תאעל קרח.
- גלולה מחדש להשעות את התאים 1 מ"ל של חיץ תמוגה RBC (PBS 1x, 155 מ"מ NH 4 Cl, 12 מ"מ NaHCO 3, 0.1 EDTA מ"מ) 1 דקות. גלולה כמו בשלב 4.5 ו resuspend התאים 1 מ"ל של חיץ FACS. שמור על השעיית התא על קרח.
- לנתח ביטוי PRP C באמצעות cytometer זרימה כפי שתואר לעיל 10. שער לחיות על תאים מפני אוכלוסיית תא כוללת. שער PRP C + תאי אוכלוסיית תא חי לקבוע MFI (עוצמת פלורסנט החציוני).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להגביר את היעילות של אנקפסולציה siRNA בתוך PALETS anionic, את siRNA נמהלה protamine. כדי לקבוע את הריכוז protamine הטוב ביותר עבור siRNA, את siRNA עורבב עם ריכוזים שונים של protamine, מ -1: 1 עד 2: 1 (איור 3 א). היתה יעילות אנקפסולציה 60-65% siRNA ב ליפוזומים anionic ללא שימוש protamine. דוגמאות עם protamine: יחסי טוחנת siRNA מ 1: 1 עד 1.5: 1 (133-266 ננומטר) היה אנקפסולציה siRNA 80-90%. יחסי טוחנת מעל 1.5: 1 הביא ממטרים של מתחמי siRNA / protamine. מתחמים זרזו אלה לא היו ארוזים לתוך ליפוזומים anionic. לאחר התוספת של protamine אל siRNA חלה ירידה קלה בריכוז של siRNA, בשל הדילול; עם זאת, הריכוז נשאר יציב לאחר התוספת של protamine (איור 3 ב). לאחר סינון ליפוזומים עם 50 מסננים kDa, 90-95% של siRNAהיה קשור ליפוזום retentate, בעוד 5-10% של siRNA היה 'חינם' ב תסנין. אין siRNA זוהה בדגימות protamine או ליפוזום בלבד (איור 3 ג).
כדי לקבוע את ההשפעה של LSPCs in vivo, עכברים wildtype טופלו LSPCs למשך 24 שעות. רמות הביטוי PRP C של עכברים wildtype שטופלו LSPCs הושוו העכברים שטופלו 1x PBS וכדי בנוקאאוט PRP (PRP KO) עכברים (איור 4). ניתוח תזרים cytometric של PRP C במוחם של עכברים שטופלו LSPCs הראה ירידה ברמות PRP C (איור 4 א ו -4). בניסוי אחד, כל העכברים היו הפחתה 80-90% של רמות PRP C, קרוב לרמות PRP C כי נצפו עכברים PRP KO (איור 4 א). עכברים שטופלו LSPCs בשני ניסויים בלתי תלויים יותר הראו ירידה 40-80% של PRP C </ sup> רמות (איור 4B). מתוך LSPCs הכולל מטופלים עכברים (n = 14), היה רק עכבר אחד לא היה מענה אל LSPCs.
איור 1:. סקירה כללית של הפרוטוקול צור PALETS / LSPCs ולספק siRNA לוריד אל מערכת העצבים המרכזי של עכברים ליפוזומים נוצרו באמצעות שיטת הידרציה סרט שומנים הדקה. PRP C siRNA צורפה אז אל ליפוזומים או באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית או אנקפסולציה. PALETS או LSPCs הושלמו על ידי תוספת של RVG-9R פפטיד מיקוד CNS. לאחר ההרכבה, PALETS / LSPCs הוזרק ורידי הזנב של עכברים, ו -24 שעות לאחר טיפול PRP C הביטוי הוערך באמצעות זרימת cytometry. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: פרוטוקול של שומני Thin שיטת סרטים הידרציה כדי ליצור DSPE ליפוזומים עבור רכב משלוח PALETS השומנים התמוססו מעורבים בתוך כלורופורם:. פתרון מתנול, אשר היה התאדה לייצר סרט שומנים יבש. סרט השומנים היבש היה resuspended ב 1x PBS ליצור שלפוחית multilamellar (ספקים רבים-לשונית). ספקים רבים-לשוני אז היו בגודל האחיד באמצעות מכבש כדי ליצור חביבים. החביבים לאחר מכן ניתן להשתמש השעיה, או lyophilized ב aliquots לשימוש חד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: יעילות Encapsulation של siRNA לתוך DSPE PALETS u protamine סינג סולפט. (א) אודות 60-65% של siRNA היה כמוס ללא תוספת protamine. עם התוספת של protamine חל יעיל אנקפסולציה 90% בין 1: 1 ו 1.5: 1 protamine: יחס siRNA. (ב) לאחר הסינון את ליפוזומים מכל siRNA חינם, 90% של siRNA נמצאו בשבריר liposomal, בעוד 5-10% של siRNA unencapsulated נמצאו התסנין. (C) protamine ו ליפוזום רק פתרונות חופשיים של siRNA כמוס. 60-65% של siRNA היה כמוס בתוך ליפוזומים DSPE ללא שימוש protamine. עם השימוש protamine בריכוז של 186.2 ננומטר, כ -90% של siRNA היה כמוס בתוך ליפוזומים DSPE. ברי שגיאה מצביעים SEM. **** מצביע P <0.0001. * מציין P <0.01. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. נציג תזרים Cytometric הניתוח של המוח Cell השעיות 24 שעות לאחר הטיפול עם LSPCs LSPCs הוזרקו ורידי הזנב של עכברי wildtype ומוח נבצר 24 שעות מאוחר יותר. PBS שימש כביקורת טיפול, עכבר KO PRP שימש כביקורת על רמות PRP C. (א) עכברים שטופלו LSPCs הראו ירידה משמעותית של רמות PRP C לעומת שליטת PBS, אשר מראה רמות wildtype PRP C. LSPCs שטופלו עכברים הראו רמות PRP C קרוב לזה של עכבר KO PRP. (ב) נתונים מצטברים שלושה ניסויים בלתי תלויים באמצעות פרוטוקול הטיפול אותו 24 שעות הראו את הכמות היחסית של PRP C ב wildtype PBS ו LSPCs שטופל עכברים. מעבר שלושה ניסויים, העכברים שטופלו sho LSPCsד ירידות משמעותיות ברמות PRP C בהשוואה לקבוצת ביקורת wildtype PBS. ברי שגיאה מצביעים SEM. *** מצביע P <0.0003. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דו"ח זה מתאר פרוטוקול ליצור שתי מערכות אספקת ממוקדות שמעבירה siRNA ביעילות אל מערכת העצבים המרכזית. שיטות קודמות של אספקת siRNA אל מערכת העצבים המרכזיים כללו הזרקת וקטורי siRNA / shRNA ישירות לתוך המוח, הזרקה תוך ורידית של siRNA הממוקד, או הזרקה תוך ורידית של מתחמים ליפוזום-siRNA הלא ממוקדים. הזרקה של וקטורים siRNA / shRNA לתוך מערכת העצבים המרכזית אין לגרום לירידה ברמות ביטוי חלבון המטרה. עם זאת, siRNA / shRNA אינו מפוזר באופן חופשי דרך מערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, זריקות אלה לגרום נזק 6-9 רקמת העצבים הסמוכים. ההזרקה של siRNA הממוקד גם לירידה של חלבון המטרה. עם זאת, רוב siRNA הוא מושפל על ידי חלבונים בסרום 20. לבסוף, הזרקה תוך ורידית של תוצאות מתחמי ליפוזום-siRNA ממוקדות ב ולכידתו של siRNA בתוך הכבד והשפלה על ידי המערכת תָא בַּלעָן mononuclear 21. משלוח siRNAכלי רכב שתוארו לעיל, LSPCs ו PALETS, לספק מערכת משלוח בטוחה, יעילה יותר, ויעילה יותר משיטות קודמות ידי אספקת siRNA ישירות למערכת העצבים המרכזי. LSPCs ואת PALETS הוא גם מסוגל להעביר תרופות מולקולה קטנה אחרות של מערכת העצבים המרכזי.
PALETS או LSPCs יש להשתמש תוך כמה שעות לאחר ההרכבה. אחרת קיים סיכון של siRNA הופך שאינם פונקציונלי / מושפל. השלב הקריטי האחר כי לא ניתן להפסיק / קטע הוא ההכנה וההפעלה של השעית התא עבור cytometry זרימה. חשוב לבצע cytometry הזרים באותו היום כי השעית התא מוכנה, מאז ההשעיה מכילה תאי חיים שצריך להיות בחיים לניתוח.
ישנם כמה צעדים בתוך פרוטוקול ניתן לשנות תלוי אם LSPCs או PALETS ישמש במבחנה או in vivo, על מה מולקולה כימית קטנה הוא נטען לתוך LSPCs או PALETS, ועל העבודההעדפת atory. ראשית, יחסי טוחנת השומנים של LSPCs ו PALETS יכול להיות מותאם ליישומים אחרים. עם זאת, phosphatidylethanolamine (PE ב DSPE) נוזלים גרוע כאשר נעשה שימוש על משקל 60% משקל / ומעלה. כאשר נעשה שימוש בריכוזים גבוהים אלה, מולקולות DSPE המצרפי יהיה אחד עם השני ויוצרים מסה מסיס של שומנים. המסה של שומנים זה לא מסוגל לתמצת siRNA. אם גז N 2 אינו זמין, תמהיל השומנים ניתן מיובש באמצעות אידוי. אידוי לוקח בערך 3 ימים, וצריך להתבצע במנדף עקב השימוש של מתנול כלורופורם. בפרוטוקול זה, סרט השומנים הדק היה resuspended עם 1x PBS אבל זה יכול גם להיות resuspended עם מאגרים הידרציה אחרים. מאגרים נוספים כוללים מים, 10% סוכרוז, או כל חיץ מימי אחר. הבחירה של חיץ להחזרת נוזלים תלויה השימוש המיועד של ליפוזומים הסוכן להיות כמוס בתוך ליפוזום 22,23. מאגר הידרציה צריך להישמר מעל-liq ג'לטמפרטורת המעבר קריסטל uid (Tc או Tm) של שומנים או ליפוזומים לא רעננותם כראוי. בפרוטוקול המתואר, ליפוזומים המושעה היו בגודל אחיד באמצעות מכבש. עם זאת, ליפוזומים יכול גם להיות בגודל באמצעות מסנני מזרק או sonication. הגודל הנקבובי אותו המסנן משמש המכבש יכול לשמש מסנני מזרק. כמו כן, השעית liposome ניתן לשנות את הגודל לאחר הידרציה עם פתרון siRNA. עם זאת, צפינו הפסד של siRNA מ ליפוזומים כאשר בגודל ידי מכבש לאחר השלב הידרציה (נתונים שלא פורסמו).
מאז התפקיד הביולוגי של PRP C עדיין לא הבינו 5, יתכן כי יכול להיות שיש כמה השפעות מזיקות המיוצר על ידי הפחתת רמות PRP C. עם זאת, בגלל עכברים לקוי חלבון פריון לפתח, להתנהג, וגיל בדרך כלל 24, סביר להניח כי ההשפעות המזיקות האלה היו גם להיות קטין או באופן גלוי לעין. יתר על כן, מציאת siRNA של PRP <sup> ביטוי C לא יבטל ביטוי חלבון לחלוטין הפיך לחלוטין ללא אפשרות oncogenesis ויראלי, בניגוד lentivector RNAi 23.
מגבלות עם מערכות משלוח כוללים מופחת ספיגת של PALETS anionic לתוך ממברנות ביולוגיות, ואת החיסונית של LSPCs בשל שומנים קטיוני. אם החיסונית של LSPCs הוא ציין, ניתן להשתמש PALETS כחלופה. ספיגת מופחתת של PALETS anionic לתוך ממברנות ביולוגיות anionic ניתן להתגבר באמצעות PALETS קטיוני, או על ידי ניסוח מחדש PALETS anionic בתערובת של קטיוני שומנים anionic.
בדו"ח זה, צמצום PrPC משתנה מעסק בעכבר כדי העכבר. וריאציה זו יכולה לנבוע ממגוון גורמים: וריאציה בין עכברים, הקוטר הקטן של ורידים בעכברים, או השפלה של siRNA. שימוש עכברים טהורים צריך לחסל הרבה של ההשתנות בין עכברים, אבל הווריאציה תמיד אפשר אפילועם עכברים טהורים. כמו כן, עכברים יש ורידים קטנים מאוד בהשוואה במודלים של בעלי חיים אחרים. אז, הזרקת כמויות גדולות לתוך הוורידים של עכברים יכולות להיות בעייתית. אנו ממליצים להתאמן זריקות לפני שאתה מנסה להזריק PALETS או LSPCs. עם זאת, אפילו עם תרגול, לפעמים זה עדיין לוקח כמה זריקות כדי לקבל את כל הנפח של PALETS / LSPCs לעכבר, ואת הווריד יכול להתמוטט בכל אחד הזריקות האלה. אז, עכבר אפשר לקבל את כל הנפח של PALETS / LSPCs, ואילו עכבר אחר אולי רק לקבל 75-90% מנפח PALETS / LSPCs.
מקורות אפשריים אחרים של וריאציה כוללים זמן שבמחזור שפל של siRNA ידי חלבונים בסרום. PALETS / LSPCS עשוי לזרום עוד לפני שהגיע מוח עכבר אחד לעומת אחר, מה שיכול להסביר את השונות. אנחנו רק מותר LSPCs להסתובב למשך 24 שעות לפני והרדמת חסד העכברים בניסוי לעיל. אם הזמן במחזור גורם וריאציה, הגדלת circulזמן ation מעבר 24 שעות צריך להפחית חלק וריאציה. למרות שאנחנו ואורזים את siRNA עם PALETS / LSPCs, תמיד יש סיכוי השפל של siRNA ו / או אמצעי השיגור. כפי שצוין קודם לכן, שומנים קטיוני הם immunogenic מעט. לכן, אם תאים חיסוניים בתוך הדם תוקפים את כלי הרכב, אז זה ייקח זמן רב יותר עבור כלי הרכב כדי להיות מועברים למוח או כלי הרכב עלולים להיות מושפלים. החלפה מ שומנים קטיוני כדי anionic PALETS עשויה לעזור לצמצם את הזמן או שפלה במחזור האיטי בעת שימוש שומנים קטיוני.
הפפטיד RVG-9R המשלוחים LSPCs ו PALETS לכל תא בתוך מערכת העצבים המרכזית המכיל קולטני אצטילכולין ניקוטינית. זה כולל הן תאים עצביים תאים microglial האסטרוציטים 26. לקבלת PALETS או LSPCs להיות טיפול יעיל למחלות הפריון חשוב למקד את כל התאים שתורמים בפתוגנזה הפריון. תאים עצביים להכיל את רוב PRP C 27,28. מיקוד תאים עצביים והפחתת ביטוי PRP C 'והתאים עלולים לגרום לירידה של בפתוגנזה הפריון. עם זאת, תאים עצביים אינם בסוג התא היחיד תורם למחלות הפריון. האסטרוציטים היו מעורבים שכפול של פריונים 29,30. לכן, לא זו בלבד שזה חשוב למקד תאים עצביים, אלא גם כדי למקד האסטרוציטים להפחית בפתוגנזה הפריון.
מערכות המשלוח המתוארות כאן ניתנות אסטרטגיות אופטימיזציה שונות שתגרומנה להם מתאימים למגוון רחב של יישומי מחלה. LSPCs ו PALETS מסוגלים הובלת מולקולה כימית קטנה כל אל מערכת העצבים המרכזית, ולא רק siRNA, אשר נותן את כלי הרכב פוטנציאל לטפל יותר במחלות ניווניות פשוט. PALETS ו LSPCs יכולים לשמש לטיפול במחלה כלשהי המשפיעההמוח תלוי מולקולה כימית קטנה נטען לתוך רכב. כמו כן, שינוי הפפטיד מיקוד עלולה לאפשר אמצעי שיגור כדי לספק תרופות מולקולה קטנה לתתי-קבוצות ספציפיות של תאים בתוך מערכת העצבים המרכזית, במקום כל תא בעל קולטני אצטילכולין. PALETS ו LSPCs מייצגים רומן, מערכת מסירה יעילה וגמישה יותר עבור תרופות מולקולה קטנות לטיפול במחלות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M.
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
