Introduction
Прионы тяжелые нейродегенеративные заболевания, которые влияют на центральную нервную систему. Прионные заболевания являются результатом неправильного сворачивания нормального клеточного белка приона, PrP C, инфекционным изомера под названием PrP Res. Эти заболевания влияют на большое разнообразие видов , включая коровьей губчатой энцефалопатии у коров, скрепи у овец, хроническая изнуряющая болезнь в оленевых и болезнь Крейтцфельда-Якоба у человека 1-3. Прионы вызывают нейродегенера-, который начинается с синаптической потери, и переходит к вакуолизации, глиоза, потерю нейронов, а также отложения зубного налета. В конце концов, приводит к смерти животного / индивидуального 4. В течение многих десятилетий, ученые исследовали соединения, предназначенные, чтобы замедлить или остановить прогрессирование заболевания прион. Тем не менее, исследователи не обнаружили ни успешной терапии или эффективное системное средство доставки.
Эндогенной экспрессии PrP С необходим для развития прионовых заболеваний 5 C может привести к задержке или облегчения заболевания. Несколько групп создали трансгенных мышей с пониженным уровнем PrP C или закачивается lentivectors , выражающих shRNA непосредственно в мышиной ткани головного мозга , чтобы исследовать роль уровней экспрессии PrP C в прионовых болезней. Эти исследователи обнаружили уменьшение количества нейронов PrP C привело к остановке прогрессивного невропатологии прионных заболеваний и продлил жизнь животных 6-9. Мы сообщили , что результаты лечения PrP C миРНК в оформлении PrP Res в клетках нейробластомы мыши 10. Эти исследования показали, что использование методов лечения для снижения уровней экспрессии PrP C, как и малых интерферирующих РНК (киРНК), которая расщепляет мРНК, может достаточно задержать прогрессирование прионовых заболеваний. Тем не менее, большинство методов лечения исследованные для прионных заболеваний были поставлены таким образом, что не будет практичнымв клинических условиях. Поэтому миРНК терапия нуждается в системной систему доставки, которая доставляется внутривенно и ориентированные на ЦНС.
Исследователи изучали применение липосом в качестве средств доставки продуктов генной терапии. Катионные и анионные липиды оба используются в формировании липосом. Катионные липиды более широко, чем анионные липиды, так как разность заряда между катионного липида и ДНК / РНК обеспечивает эффективную упаковку. Еще одним преимуществом катионных липидов является то , что они пересекают клеточную мембрану легче , чем другие липиды 11-14 лет. Тем не менее, катионные липиды являются более иммуногенными , чем анионных липидов 13,14. Таким образом, исследователи начали переходить от использования катионные к анионным липидов в липосомах. Продукты генной терапии может быть эффективно упакованы в анионные липосомы с использованием положительно заряженный пептид протамина сульфата, который конденсирует молекулы ДНК / РНК 15-19 лет. Так как анионного липиDS являются менее иммуногенными , чем катионные липиды , они , возможно, к увеличению времени циркуляции, и может быть более терпимы в моделях на животных 13,14. Липосомы предназначены для конкретных тканей с использованием ориентации пептидов, которые присоединены к липосом. РВГ-9R нейропептид, который связывается с никотиновых рецепторов ацетилхолина, использовался для целевой Серна и липосом в ЦНС 17-20.
В настоящем докладе приводится протокол для получения трех средств доставки миРНК, а также для упаковки и доставки миРНК в нервных клеток (рисунок 1). Липосомы-миРНК-пептидных комплексов (LSPCs) состоят из липосом с миРНК и РВГ-9R нацеливание пептид электростатически прикреплен к внешней поверхности липосом. Пептид на имя липосом инкапсулированный терапевтические миРНК (PALETS) состоят из миРНК и протамина, инкапсулированного в липосомы, с РВГ-9R ковалентно связаны с липидного PEG групп. Используя описанные ниже методы для генерации LSPCs и палетS, PrP C миРНК уменьшает экспрессию PrP C до 90% в нервных клетках, который держит огромное обещание вылечить или существенно задержать начало патологии болезни прион.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши были выведены и поддерживаются в Лаборатории животных ресурсов, аккредитованных Ассоциацией по оценке и аккредитации лаборатории Animal Care International, в соответствии с процедурами, утвержденными по уходу и использованию комитета Institutional животных путем в Университете штата Колорадо.
1. Получение LSPCs
- Используйте 1: 1 DOTAP (1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан): соотношение холестерина для LSPCs. Для 4 нмоль приготовления липосом, смешать 2 нмоль ДОТАП и 2 нмоль холестерина в 10 мл 1: 1 хлороформ: метанол раствор в колбе.
- Выпаривают 9 мл хлороформ: метанол раствора с использованием N 2 газа в вытяжном шкафу. Упаривают Последние 1 мл растворителя в вытяжном шкафу в течение ночи без газа. Обратите внимание тонкой липидной пленки на дне колбы.
- Тепло 10 мл 10% раствора сахарозы до 55 ° С.
- Налейте нагретого 10% раствора сахарозы на тонкой липидной пленки медленно, т.е. 1 мл / мин, в то время как Геntly взбалтывая колбу. Поддерживают 10% сахарозы и колбу с липидами при 55 ° С, так что липидные молекулы остаются в гелевой фазе-жидкость. Результаты Регидратационные в везикул формирования многопластинчатой (MLV).
- Разрешить липиды регидрировать при 55 ° С в течение по меньшей мере одного часа до того размера липосом.
- Собрать экструдер в соответствии с инструкциями изготовителя с фильтрами 1,0 мкм или использовать шприцевые фильтры 1,0 мкм для проклейки.
- Добавить 1 мл суспензии липосом, нагретой до одной из шприцев на экструдере, и передать приостановку между двумя шприцами 11 раз. Убедитесь, что подвеска в противоположном шприц, чем исходный шприца после 11 проходов.
- Размер липосом снова через 0,45 мкм затем 0,2 мкм фильтры для генерации больших однослойных везикул (БУВ). Хранить суспензию липосом с подогревом для облегчения калибровки.
- Выдержите 20 мкл 4 нмоль суспензии липосом (200 мкм) с 200 мкл 20 мкМ (4нмоль всего) запас миРНК раствор в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Инкубируют 80 мкл 500 мкМ (40 нмоль всего) маточного раствора РВГ-9R с раствором / липосом миРНК в течение 10 мин при комнатной температуре. LSPCs следует использовать как можно скорее, но может использоваться до нескольких часов после приготовления. Храните LSPCs при 4 ° С в течение нескольких часов после приготовления.
2. Получение PALETS
- Используйте 55: молярное соотношение 5 либо DspE (1,2-дистеароил-зп-глицеро-3-фосфоэтаноламин):: 40 холестерина: DspE-ПЭГ или DOTAP: холестерин: DspE-PEG для PALETS. Для 4 нмоль приготовления липосом, смешайте 2,2 нмоль либо DspE или ДОТАП, 1,6 нмоль холестерина и 0,2 нмоль ДСФЭ-ПЭГ в 10 мл 2: 1 хлороформ: метанол раствор в колбе.
- Приготовьте суспензию липосом в точности, как описано в шаге 1.1 и 1.2 выше. Увлажняет DspE липосом в 10 мл 1x PBS нагревали до 75 ° С, при добавлении 1 мл / мин. Разрешить липиды регидрировать при 75 ° С в течение поне менее 1 ч перед определением.
- Размер суспензию липосом точно так, как описано в шаге 1,6-1,8.
- Пипеткой 20 мкл каждого из 4 нмоль (200 мкМ) липосомных суспензий в отдельных аликвот после использования DOTAP и DspE Липосомы размера, и лиофилизации в течение 30 мин с помощью сублимационной сушки настольном (Рисунок 2).
- Инкубируют 200 мкл 20 мкМ (4 нмоль) общего исходного раствора киРНК с 1,4 мкл 26,6 мкМ раствора сульфата протамина в течение 10 мин при комнатной температуре миРНК, который должен быть воплощен в DSPE PALETS липосом.
- Увлажняет липосом ДОТАП PALETS с 200 мкл 4 нмоль исходного раствора киРНК или регидратации DSPE PALETS липосом с 201,4 мкл раствора / протамин-миРНК. Выдержите раствора липосом / миРНК в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 10 мкл (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) раствор 3--1-этил-60 мМ к раствору липосом / миРНК для обоих ДОТАП и ДСФЭ PALETS.
- Добавляют 10 мкл раствора 150 мМ N-hydroxysulfosuccinimide (сульфо-NHS) к раствору липосом / миРНК для обоих ДОТАП и ДСФЭ PALETS.
- Выдержите EDC и сульфо-NHS с / суспензии липосом миРНК в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Инкубируют 80 мкл 500 мкМ (40 нмоль всего) маточного раствора РВГ-9R с миРНК / липосом раствор в течение 10 мин при комнатной температуре сшивание.
ПРИМЕЧАНИЕ: EDC / сульфо-NHS позволяет RVG-9R ковалентно связываться с липидами ПЭГ. Используйте PALETS в течение нескольких часов после приготовления. Храните PALETS при 4 ° С в течение нескольких часов после приготовления. - Для определения эффективности миРНК инкапсуляции PALETS:
- Измерить концентрацию миРНК до и после добавления протамина и липосом с использованием спектрофотометра установки при длине волны 260 нм.
- Фильтр неинкапсулированной миРНК из липосом / инкапсулированного миРНК суспензии с использованием 50 кДа центробежных фильтров. Центрифуга при 1000 х г в течение 20 мин.
- Измерьте концентрациюнекапсулированного миРНК в фильтрате и концентрация инкапсулированного миРНК в концентрате с использованием спектрофотометра при длине волны 260 нм.
3. Инъекционное Мыши с LSPCs или PALETS
- Expose мышей в течение 5-10 мин до тепла лампы, чтобы расширить сосудистую сеть.
- Обезболить мышь с 2-3% изофлуораном / кислород потока 5-10 мин до инъекции, а также во время инъекции. Подтверждение не обезболивание, когда животное уже не передвигающихся и дыханий замедлилось, делая ног крайнем случае. Поместите мышь на спине или на боку, чтобы получить доступ к хвостовой вены. Используйте ветеринара мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание в то время как под наркозом.
- Wipe / спрей хвост с 70% этанола и вводят 300 мкл LSPCs или PALETS на хвостовую вену мыши с помощью 26 G инсулиновый шприц. Начало инъекции дистально в хвостовую вену и двигаться в проксимальном направлении, если вены разрушается или разрывается.
- Поместите мышь в чистой клетке, пока она не поддерживает грудины лежачее. Не оставляйте моиспользовать с другими клетке товарищей, пока не будет полностью восстановлена. Мыши должны восстанавливаться в 5 до 15 мин. Они могут быть размещены на грелку или под лампой тепло для поддержания температуры тела, если восстановление занимает больше времени. Мыши следует пристально следить для защиты от перегрева.
- Наблюдение за несколько часов после инъекции животных, чтобы обеспечить обезболивание смягчается, и нет никаких болезненных эффектов лечения. Разрешить LSPCs или PALETS циркулировать в течение по крайней мере 24 часов.
4. Анализ экспрессии белка с помощью проточной цитометрии
- Эвтаназии мышей с 20% скорости потока СО 2 в течение 15 мин.
- Рассеките из половину полушарие мозга путем срезания кожи и череп мыши с помощью ножниц. Отслаиваться половину полушарие мозга от черепа с помощью щипчиков или конец пары ножниц.
- Нажмите половину полушарие мозга от каждой мыши через сито меш ячейки 40 мкм с использованием 2,5 мл буфера FACS (1x; PBS, 1% фетальной бычьей сыворотки, 10 мМ ЭДТА) в чашке Петри с поршнем шприца.
- Промыть фильтр грубой очистки клеток и чашки Петри с дополнительными 2,5 мл буфера FACS. Помещенный одноклеточной суспензии в конической трубе 15 мл на льду.
- Пипеткой 100 мкл 5 мл суспензии отдельных клеток в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и центрифуге в течение 5 мин при 350 х г. Выбросите осадок клеток супернатант и ресуспендируют в 1 мл буфера FACS. Спин при 350 мкг в течение 5 мин. Повторите с другой 1 мл буфера FACS. Держите клеточной суспензии на льду.
- Инкубируйте клетки в 100 мкл 1: 100 разбавление 0,5 мг / мл анти-мышиных Fc блока в буфере FACS в течение 30-60 мин на льду. Гранул и промыть клетки, как в шаге 4.5. Держите клеточной суспензии на льду.
- Инкубацию клеток в 100 мкл 20 мкг / мл флюоресцирующих антител против мышиного PrP С в 7% мышиной сыворотки в буфере FACS на льду в течение 30-60 мин. Гранул и промыть клетки, как в шаге 4.5. Держите клеточной суспензиина льду.
- Пелле и вновь приостановить клеток в 1 мл буфера для лизиса эритроцитов (1x PBS, 155 мМ NH 4 Cl, 12 мМ NaHCO 3, 0,1 мМ ЭДТА) в течение 1 мин. Гранула, как на стадии 4.5, и клетки вновь суспендируют в 1 мл буфера FACS. Держите клеточной суспензии на льду.
- Анализ экспрессии PrP C с использованием проточного цитометра как описано выше 10. Ворота живые клетки от общей популяции клеток. Ворота PrP C + клеток из популяции живых клеток для определения MFI (медиана интенсивности флуоресценции).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для повышения эффективности киРНК герметизацию в анионных PALETS, киРНК смешивали с протамина. Для определения наилучшей концентрации протамина для миРНК, киРНК смешивали с различными концентрациями протамина, от 1: 1 до 2: 1 (фиг.3А). Был 60-65% миРНК Эффективность инкапсулирования в анионных липосом без использования протамина. Образцы с протамина: миРНК молярные соотношения от 1: 1 до 1,5: 1 (133-266 нМ) была 80-90% миРНК инкапсуляцию. Молярные отношения выше 1,5: 1 приводит к осаждению / протамина комплексов киРНК. Эти осажденные комплексы не воплощен в анионных липосом. После добавления протамина к миРНК наблюдалось небольшое снижение концентрации киРНК, из-за разбавления; Тем не менее, концентрация оставалась стабильной после добавления протамина (фиг.3В). После фильтрации липосом с 50 кДа фильтров, 90-95% киРНКбыл связан с липосомной концентратом, при этом 5-10% от миРНК был "свободный" в фильтрате. Ни один миРНК не был обнаружен в протамина или липосом только образцы (рис 3в).
Для того, чтобы определить влияние LSPCs в естественных условиях, мышей дикого типа обрабатывали LSPCs в течение 24 ч. Уровни экспрессии PrP C дикого типа мышей , обработанных LSPCs сравнивали с мышами , обработанными с 1x PBS и PrP нокаута (PrP KO) мышей (рисунок 4). Цитометрический анализ PrP C в мозге мышей , получавших LSPCs показали снижение уровня PrP C (рис 4A и 4B). В одном эксперименте, у всех мышей было отмечено уменьшение на 80-90% от уровня PrP C, близкий к уровням PrP C , которые наблюдались у мышей PrP KO (рис 4A). Мышей обрабатывали LSPCs в двух более независимых экспериментов показали снижение на 40-80% PrP C </ SUP> уровни (рис 4б). Из общего числа LSPCs мышей, обработанных (п = 14), была только одна мышь не имела ответа на LSPCs.
Рисунок 1:. Обзор протокола для генерации PALETS / LSPCs и доставить миРНК Внутривенно в ЦНС мышей Липосомы были получены с помощью тонкой липидной пленки методом гидратации. ПОТ С миРНК был затем прикреплен к липосом либо через электростатическое взаимодействие или герметизацией. В PALETS или LSPCs были завершены добавлением ЦНС ориентации пептида RVG-9R. После сборки PALETS / LSPCs вводили в хвостовую вену мышей, и 24 ч после обработки экспрессии PrP C оценивали с помощью проточной цитометрии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Протокол тонкой липидной пленки Гидратация метод для формирования DspE липосом для PALETS носителя для доставки Липиды растворяют и смешивают в хлороформ:. Раствор метанола, который испаренной генерировать сухой липидной пленки. Сухой липидную пленку ресуспендировали в 1x PBS для создания многослойных везикул (ГРЩ). ГРЩ были затем одинакового размера с использованием экструдера для создания БУВ. В БУВ может быть использован в виде суспензии, или лиофилизируют в отдельных аликвот использования. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Инкапсуляция Эффективность миРНК в DSPE PALETS U Sing сульфата протамина. (А) 60-65% от миРНК был инкапсулирован без добавления протамина. С добавлением протамина, была на 90% эффективность инкапсулирования между 1: 1 и 1,5: 1 протамина: миРНК отношение. (B) После фильтрации липосом из любого свободного миРНК, 90% от миРНК была обнаружена в липосомальной фракции, в то время как 5-10% от неинкапсулированного миРНК был найден в фильтрате. (C) Протамина и липосомами только растворы свободны от инкапсулированного миРНК. Около 60-65% миРНК был заключен внутри DspE липосом без использования протамина. При использовании протамина в концентрации 186,2 нМ, около 90% от миРНК был заключен внутри DspE липосом. Столбики ошибок указывают SEM. **** Указывает P <0,0001. * Обозначает Р <0,01. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Представитель проточной цитометрии Анализ Мозг Суспензии клеток 24 ч после обработки LSPCs LSPCs вводили в хвостовую вену мышей дикого типа и мозги собирали 24 часа позже. PBS , использовали в качестве контроля лечения, а также мышь PrP KO использовали в качестве контроля для уровней PrP C. (A) мышей , которым вводили LSPCs показали значительное снижение уровня PrP С по сравнению с контрольной среде ФБР, который показывает уровни дикого типа PrP C. В LSPCs обработанных мышей показали уровни PrP C , близкие к мыши PrP KO. (B) , накопленную с трех независимых экспериментов с использованием тех же 24 ч протокол лечения показал относительное количество PrP C в PBS и дикого типа мышей , обработанных LSPCs. Через трех экспериментов, мыши, получавшие LSPCs Shoср значительное снижение уровня PrP C по сравнению с PBS контролем дикого типа. Столбики ошибок указывают SEM. *** Указывает P <0,0003. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот отчет описывает протокол для создания двух целевых систем доставки, которые эффективно транспортирует миРНК в ЦНС. Предыдущие способы доставки миРНК в ЦНС включены инъекционные векторы миРНК / shRNA непосредственно в мозг, внутривенные инъекции целевого миРНК или внутривенной инъекцией нецелевых липосом-миРНК комплексов. Инъекция миРНК / shRNA векторов в ЦНС действительно вызывает снижение уровня экспрессии белка-мишени. Тем не менее, миРНК / shRNA не свободно диффундировать через ЦНС. Кроме того, эти инъекции приводят к повреждению примыкающей 6-9 нервной ткани. Внутривенная инъекция целевой миРНК также приводит к уменьшению белка-мишени. Тем не менее, большая часть миРНК разрушается под действием сывороточных белков 20. И, наконец, внутривенное введение нецелевых липосом-миРНК комплексов приводит к улавливанию киРНК в печени и деградации с помощью системы 21 фагоцитарной мононуклеаров. Доставки миРНКтранспортные средства, описанные выше, LSPCs и PALETS, обеспечить более безопасную, более эффективную и эффективную систему доставки по сравнению с предыдущими методами путем доставки миРНК непосредственно в ЦНС. В LSPCs и PALETS также способны транспортировать другие препараты небольшую молекулу в ЦНС.
PALETS или LSPCs следует использовать в течение нескольких часов после сборки. В противном случае существует риск того, что миРНК становится нефункциональным / деградирует. Другой важный шаг, который не может быть остановлен / прервана является подготовка и проведение клеточной суспензии для проточной цитометрии. Важно, чтобы выполнить поточной цитометрии в тот же день, что получают суспензию клеток, так как суспензия содержит живые клетки, которые должны быть живыми для анализа.
Есть несколько шагов в рамках протокола , которые могут быть изменены в зависимости от того, будет ли использоваться LSPCs или PALETS в пробирке или в естественных условиях, на то , что маленькая молекула лекарственного средства загружается в LSPCs или PALETS, а также на оплату трудаAtory предпочтение. Во-первых, липидные Молярные соотношения LSPCs и PALETS могут быть оптимизированы для других применений. Тем не менее, фосфатидилэтаноламин (PE в DspE) гидраты плохо при использовании при 60% вес / вес или выше. При использовании в этих более высоких концентрациях, молекулы DspE будут агрегировать друг с другом и образуют нерастворимые массу липидов. Эта масса липидов не способен инкапсулировать миРНК. Если N 2 газ недоступен, липидная смесь можно высушить с помощью испарения. Испарение занимает около 3 дней, и должны быть выполнены в вытяжном шкафу в связи с использованием метанола и хлороформа. В этом протоколе, тонкий липидную пленку ресуспендировали с 1х PBS, но он также может быть взвесь с другими буферами гидратных. Другие буферы включают воду, 10% сахарозы, или любой другой водный буфер. Выбор регидратационной буфера зависит от предполагаемого применения липосом и агент инкапсулируется в липосомы 22,23. Буфер гидратация должна быть выше гель-жидкТемпература перехода кристалл UID (Тс или Tm), липидов или липосом не регидрировать должным образом. В описанном протоколе, подвешенные липосом однородного размера с использованием экструдера. Тем не менее, липосомы также могут быть рассчитаны с помощью шприца фильтров или ультразвуковую обработку. Одни и те же размеры пор фильтра, используемого для экструдера может быть использован в качестве шприцевые фильтры. Кроме того, суспензия липосом может быть изменен после гидратации с раствором миРНК. Тем не менее, мы наблюдали потерю миРНК из липосом, когда размер с помощью экструдера после стадии гидратации (неопубликованные данные).
Так как биологическая роль PrP C еще не понял , 5, вполне возможно , что там могут быть некоторые вредные эффекты , производимые за счет снижения уровня белка PrP C. Тем не менее, из - за прионного белка дефицитных мышей развиваются, ведут себя, как правило , и возраст 24, вполне вероятно , что эти пагубное воздействие будет либо незначительным или не явно очевидны. Кроме того, миРНК нокдаун PrP <SUP> выражение C не будет полностью упразднить экспрессию белка и является полностью обратимым без возможности вирусного канцерогенеза, в отличие от lentivector RNAi 23.
Ограничения с системами доставки включают снижение поглощения анионных PALETS в биологические мембраны и иммуногенности LSPCs вследствие катионных липидов. Если наблюдается иммуногенность LSPCs, PALETS могут быть использованы в качестве альтернативы. Снижение поглощения анионных PALETS в анионные биологические мембраны могут быть преодолены с помощью катионных PALETS или переформулировкой анионные PALETS смесью катионной и анионной липидов.
В этом докладе, снижение PrPC колеблется в широких пределах от мыши к мыши. Это изменение может быть вызвано различными факторами: различия между мышами, малый диаметр вены у мышей, или деградация миРНК. Использование инбредных мышей должно устранить большую часть изменчивости между мышами, но изменение всегда возможно дажес инбредных мышей. Кроме того, мыши, имеют очень маленькие вены по сравнению с другими моделями на животных. Таким образом, путем инъекций большого объема в вены мышей может быть проблематичным. Мы рекомендуем практиковать инъекции, прежде чем пытаться внедрить PALETS или LSPCs. Тем не менее, даже с практикой, иногда он по-прежнему занимает несколько инъекций, чтобы получить весь объем PALETS / LSPCs в мышь, и вены может рухнуть в любой из этих инъекций. Таким образом, одна мышь может получить весь объем PALETS / LSPCs, в то время как другая мышь может получить только 75-90% от объема PALETS / LSPCs.
Другие возможные источники изменения включают в себя время циркуляции и деградации миРНК на сывороточные белки. В PALETS / LSPCS может циркулировать дольше, прежде чем достичь мозга в одной мыши по сравнению с другой, которая могла бы объяснить различия. Мы только позволили LSPCs циркулировать в течение 24 ч перед эвтаназии мышей в описанном выше эксперименте. Если время циркуляции вызывает изменение, а затем увеличивая CirculВремя вания за 24 часа должно уменьшить некоторые вариации. Даже если мы упаковать миРНК с PALETS / LSPCs, всегда есть вероятность деградации миРНК и / или средств его доставки. Как упоминалось ранее, катионные липиды слегка иммуногенной. Таким образом, если иммунные клетки в крови нападают на транспортные средства, то это заняло бы больше времени для транспортных средств, которые будут доставлены в мозг или транспортные средства могли бы деградировать. Переход от катионных липидов к анионным PALETS может помочь уменьшить медленное время циркуляции или деградации при использовании катионных липидов.
РВГ-9R пептид транспортирует LSPCs и PALETS к любой клетке в ЦНС, который содержит никотиновых рецепторов ацетилхолина. Это включает в себя как нервных клеток клетки микроглии и астроцитов 26. Для PALETS или LSPCs быть эффективным средством для лечения прионных заболеваний, важно настроить таргетинг на все клетки, которые способствуют прионного патогенеза. Нервные клетки содержат наиболее PrP C 27,28. Ориентация нервных клеток и уменьшение экспрессии клеток 'PrP C может привести к снижению прионного патогенеза. Тем не менее, нервные клетки не являются единственным типом клеток, что способствует болезни прион. Астроциты были вовлечены в репликацию прионов 29,30. Поэтому не только важно, чтобы цель нервных клеток, а также нацелены на астроциты, чтобы уменьшить прионов патогенез.
Системы доставки, описанные здесь, могут быть подвергнуты различные стратегии оптимизации, которые сделали бы их пригодными для широкого круга применений болезни. LSPCs и PALETS способны транспортировать любой небольшой молекулы лекарственного средства в ЦНС, а не только миРНК, что дает транспортным средствам потенциал для лечения больше, чем просто нейродегенеративных заболеваний. PALETS и LSPCs могут быть использованы для лечения любого заболевания, которое влияетмозг в зависимости от маленькой молекулы лекарственного средства, загруженного в транспортные средства. Кроме того, изменение ориентации пептид может позволить средства доставки, чтобы доставлять небольшие лекарства молекулы к определенному множеству клеток в ЦНС, а не какой-либо клетки, которая имеет рецепторы ацетилхолина. PALETS и LSPCs представляют собой новую, более эффективную и гибкую систему доставки для малых молекул лекарственных средств для лечения заболеваний, которые влияют на центральную нервную систему.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M.
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
