Introduction
Los priones son enfermedades neurodegenerativas graves que afectan el SNC. Las enfermedades priónicas son el resultado de la mal plegamiento de la proteína priónica celular normal, PrP C, por un isómero infecciosa llamada PrP Res. Estas enfermedades afectan a una amplia variedad de especies, incluyendo la encefalopatía espongiforme bovina en vacas, scrapie en ovejas, la caquexia crónica en los cérvidos, y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos 1-3. Los priones causan neurodegeneración que se inicia con la pérdida sináptica, y progresa a vacuolización, gliosis, pérdida neuronal, y los depósitos de placa. Con el tiempo, dando como resultado la muerte del animal / persona 4. Durante décadas, los investigadores han investigado compuestos destinados a ralentizar o detener la progresión de la enfermedad priónica. Sin embargo, los investigadores no han encontrado ya sea una terapia exitosa o un vehículo de administración sistémica eficaz.
Se requiere la expresión endógena PrP C para el desarrollo de las enfermedades priónicas 5 C puede resultar en un retraso o mejora de la enfermedad. Varios grupos crearon ratones transgénicos con niveles reducidos de PrP C o lentivectores inyectados que expresan shRNA directamente en el tejido cerebral murino para investigar el papel de los niveles de expresión PrP C en la enfermedad priónica. Estos investigadores han encontrado que reduce la cantidad de PrP C neuronal resultó en la detención de la neuropatología progresivo de las enfermedades priónicas y extendieron la vida de los animales 6-9. Nos han informado de que los resultados del tratamiento PrP C siRNA en el aclaramiento de la PrP Res en células de neuroblastoma de ratón 10. Estos estudios sugieren que el uso de terapias para disminuir PrP C los niveles de expresión, como pequeños ARN de interferencia (siRNA), que escinde mRNA, puede suficientemente retrasar la progresión de las enfermedades priónicas. Sin embargo, la mayoría de las terapias para las enfermedades priónicas investigados fueron entregados en una forma que no sería prácticoen un entorno clínico. Por lo tanto, una terapia de ARNip necesita un sistema de administración sistémica, que se entrega por vía intravenosa y dirigido al SNC.
Los investigadores han estudiado el uso de liposomas como vehículos de administración para los productos de terapia génica. Los lípidos catiónicos y aniónicos se utilizan ambos en la formación de liposomas. Los lípidos catiónicos son los más utilizados que los lípidos aniónicos debido a que la diferencia de carga entre el lípido catiónico y el ADN / ARN permite para el embalaje eficiente. Otra ventaja de los lípidos catiónicos es que atraviesan la membrana celular más fácilmente que otros lípidos 11-14. Sin embargo, los lípidos catiónicos son más inmunogénicos que los lípidos aniónicos 13,14. Por lo tanto, los investigadores han comenzado a cambiar el uso catiónico a los tensioactivos aniónicos lípidos en liposomas. Productos de terapia génica se pueden empaquetar de manera eficiente en liposomas aniónicos utilizando el péptido cargado positivamente sulfato de protamina, que se condensa moléculas de ADN / ARN de 15-19. Desde lipi aniónicods son menos inmunogénicas que los lípidos catiónicos que pueden haber aumento de los tiempos de circulación, y pueden ser más toleradas en modelos animales 13,14. Los liposomas se dirigen a tejidos específicos utilizando péptidos dirigidos que se unen a los liposomas. El neuropéptido RVG-9R, que se une a los receptores nicotínicos de la acetilcolina, se ha utilizado para orientar siRNA y liposomas para el SNC 17-20.
Este informe describe un protocolo para producir tres vehículos de entrega de siRNA, y para empaquetar y entregar el siRNA para las células neuronales (Figura 1). complejos liposoma-siRNA-péptido (LSPCs) se componen de liposomas con siRNA y el RVG-9R péptido dirigido electrostáticamente unidos a la superficie exterior del liposoma. Péptido dirigida encapsulado en liposomas terapéuticos siRNA (PALETS) se componen de siRNA y protamina encapsulado dentro del liposoma, con RVG-9R covalentemente unido a grupos PEG de lípidos. El uso de los métodos siguientes para generar LSPCs y PALETS, PrP C siRNA disminuye la expresión PrP C hasta el 90% en las células neuronales, que posee una gran promesa para curar o retrasar la aparición de patología de la enfermedad de priones sustancialmente.
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Protocol
Todos los animales fueron criados y mantenidos en el laboratorio de Recursos Animales, acreditados por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International, de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad del Estado de Colorado.
1. Preparación de LSPCs
- Use un 1: 1 de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano): la proporción de colesterol para LSPCs. Para una preparación de liposomas nmol 4, mezclar 2 nmoles de DOTAP y 2 nmoles de colesterol en 10 ml de una solución 1: metanol en un matraz: cloroformo 1.
- Evaporar 9 ml de cloroformo: solución de metanol usando N 2 gas en una campana de humos. Evaporar los últimos 1 ml de disolvente en una campana de humos durante la noche sin gas. Observar una película delgada de lípidos en el fondo del matraz.
- Heat 10 ml de una solución de sacarosa al 10% a 55 ° C.
- Se vierte la solución de sacarosa al 10% se calienta a la película lipídica delgada lentamente, es decir, 1 ml / min, mientras que gently agitando el matraz. Mantener la sacarosa 10% y el matraz con lípidos a 55 ° C de modo que las moléculas de lípidos permanecen en la fase de gel-líquido. resultados de rehidratación en la formación de vesículas multilamelares (MLV).
- Permitir lípidos para rehidratar a 55 ° C durante al menos una hora antes de dimensionar los liposomas.
- Montar un extrusor según las instrucciones del fabricante con 1,0 micras filtros o usar filtros de jeringa de 1,0 micras para el dimensionamiento.
- Añadir 1 ml de la suspensión de liposomas se calentó a una de las jeringas en la extrusora, y pasar la suspensión entre las dos jeringas 11 veces. Asegúrese de que la suspensión está en la jeringa opuesta a la jeringa comienza después de los 11 pases.
- Tamaño de los liposomas de nuevo a través de 0,45 micras y luego 0,2 micras filtros para generar grandes vesículas unilamelares (LUV). Mantener la suspensión de liposomas se calienta para el dimensionamiento más fácil.
- Incubar 20 l de la suspensión de liposomas 4 nmol (200 M) con 200 l de un 20 micras (4total de nmol) solución madre de siRNA para 10 min a temperatura ambiente.
- Incubar 80 l de una 500 mM (40 nmol total de) solución RVG-9R de valores con la solución / liposoma siRNA durante 10 min a RT. LSPCs deben utilizarse tan pronto como sea posible, pero se pueden utilizar hasta varias horas después de la preparación. LSPCs se almacena a 4 ° C durante varias horas después de la preparación.
2. Preparación de palets
- Use un 55: 5 relación molar de cualquiera de DSPE (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina):: 40 colesterol: DSPE-PEG o DOTAP: colesterol: DSPE-PEG para PALETS. Para una preparación de liposomas nmol 4, mezclar 2,2 nmoles de o bien DSPE o DOTAP, 1,6 nmoles de colesterol, y 0,2 nmoles de DSPE-PEG en 10 ml de una mezcla 2: solución de metanol en un matraz: cloroformo 1.
- Preparar suspensión de liposomas exactamente como se describe en el paso 1.1 y 1.2 anterior. Rehidratar los liposomas DSPE en 10 ml de PBS 1x calentó a 75 ° C, la adición de 1 ml / min. Permitir lípidos para rehidratar a 75 ° C durante por lopor lo menos 1 hora antes de dimensionar.
- Tamaño de la suspensión de liposomas exactamente como se describe en el Paso 1.6 a 1.8.
- Pipetear 20 l de cada una de las suspensiones de liposomas 4 nmol (200 mM) en alícuotas de un solo uso después de DOTAP y DSPE liposomas han sido tamaño, y liofilizar durante 30 minutos utilizando un secador de congelación de sobremesa (Figura 2).
- Incubar 200 l de una solución madre 20 mM (4 en total nmol) siRNA con 1,4 l de una solución 26,6 M de sulfato de protamina durante 10 min a RT para siRNA que ha de ser encapsulado en liposomas DSPE PALETS.
- Rehidratar los liposomas DOTAP palets 200 l de una solución madre nmol 4 de siRNA o rehidratar los liposomas DSPE palets 201,4 l de la solución / protamina siRNA. Incubar solución / siRNA liposoma durante 10 min a RT.
- Añadir 10 l de una solución 60 mM de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) a la solución de liposomas / siRNA para ambos DOTAP y DSPE PALETS.
- Añadir 10 l de una solución 150 mM N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) a la solución de liposomas / siRNA para ambos DOTAP y DSPE PALETS.
- Incubar la EDC y sulfo-NHS con la suspensión / liposoma siRNA durante 2 horas a RT.
- Incubar 80 l de una 500 mM (40 nmol total de) solución RVG-9R de valores con el siRNA / liposoma solución durante 10 min a RT reticulación.
NOTA: La EDC / sulfo-NHS permite la RVG-9r para unir covalentemente a los lípidos PEG. PALETS utilizar dentro de varias horas después de la preparación. PALETS se almacena a 4 ° C durante varias horas después de la preparación. - Para determinar la eficiencia de encapsulación siRNA de palets:
- Medir la concentración de siRNA antes y después de la adición de protamina y liposomas usando un espectrofotómetro ajustado a 260 nm.
- Se filtra la no encapsulado siRNA desde el liposoma suspensión siRNA / encapsulado usando 50 kDa filtros centrífugos. Centrifugar a 1000 xg durante 20 min.
- Medir la concentración desiRNA no encapsulado en el filtrado y la concentración de siRNA encapsulado en el material retenido usando un espectrofotómetro a 260 nm.
3. La inyección de ratones con LSPCs o PALETS
- Exponer a los ratones durante 5-10 minutos a una lámpara de calor para dilatar la vasculatura.
- Anestesiar ratón con un 2-3% de isofluorano / oxígeno fluya 5-10 min antes de la inyección, y durante la inyección. Confirmar la anestesia cuando los animales ya no es ambulante y respiraciones han frenado haciendo una pizca dedo del pie. Coloca el ratón sobre su parte posterior o lateral para acceder a la vena de la cola. Utilice ungüento veterinario en los ojos del ratón para evitar que se seque mientras está bajo anestesia.
- Limpiar / rociar la cola con 70% de EtOH y se inyecta 300 l de LSPCs o PALETS en la vena de la cola del ratón utilizando una jeringa de 26 G de insulina. Iniciar la inyección distalmente en la vena de la cola y mover proximalmente Si la vena se derrumba o se rompe.
- Coloque el ratón en una jaula limpia hasta que se mantiene decúbito esternal. No coloque moutilizar con otros compañeros de jaula hasta que se haya recuperado por completo. Los ratones deben recuperarse en 5 a 15 minutos. Se pueden colocar en una almohadilla eléctrica o bajo una lámpara de calor para mantener la temperatura corporal si la recuperación tarda más tiempo. Los ratones deben ser vigilados estrechamente para proteger contra el sobrecalentamiento.
- Monitorear los animales varias horas después de la inyección para asegurar efecto de la anestesia, y no hay efectos nocivos del tratamiento. Permitir a los LSPCs o palets a circular por lo menos durante 24 horas.
4. Análisis de la expresión de proteínas a través de Citometría de Flujo
- La eutanasia a los ratones con un CO 2 velocidad de flujo 20% durante 15 min.
- Diseccionar la mitad de un hemisferio del cerebro mediante el corte de la piel y el cráneo del ratón usando tijeras. Peel distancia media de un hemisferio cerebral lejos de la cráneo con unas pinzas o el extremo de un par de tijeras.
- Press medio de un hemisferio cerebral de cada ratón a través de un filtro de células de malla de 40 micras utilizando 2,5 ml de tampón FACS (1x; PBS, 1% de suero bovino fetal, 10 mM EDTA) en una placa de Petri con el émbolo de una jeringa.
- Enjuague el filtro de células y la placa de Petri con un adicional de 2,5 ml de tampón FACS. Poner la suspensión de células individuales en un tubo cónico de 15 ml en hielo.
- Pipetear 100 l de la 5 ml de suspensión de células individuales en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugar durante 5 min a 350 x g. Desechar el sedimento celular sobrenadante y resuspender en 1 ml de tampón de FACS. Girar a 350 xg durante 5 min. Repita con el otro 1 ml de tampón FACS. Mantener la suspensión de células en hielo.
- Se incuban las células en 100 l de dilución 1: 100 de un / ml rata bloque anti-ratón Fc 0,5 mg en tampón FACS durante 30-60 min en hielo. Pellets y lavar las células como en el paso 4.5. Mantener la suspensión de células en hielo.
- Se incuban las células en 100 l de un anticuerpo de 20 mg / ml fluorescente contra ratón PrP C en suero de ratón 7% en tampón FACS en hielo durante 30-60 min. Pellets y lavar las células como en el paso 4.5. Mantener la suspensión de célulassobre hielo.
- Pellets y resuspender las células en 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (1x PBS, 155 mM NH 4 Cl, 12 mM de NaHCO3, EDTA 0,1 mM) durante 1 min. Pellet como en el paso 4.5 y resuspender las células en 1 ml de tampón de FACS. Mantener la suspensión de células en hielo.
- Analizar la expresión de PrP C usando un citómetro de flujo como se ha descrito previamente 10. Puerta de las células de la población total de células en vivo. Puerta de PrP C + células de la población de células vivas para determinar MFI (intensidad de fluorescencia media).
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Representative Results
Para aumentar la eficiencia de la encapsulación dentro de siRNA PALETS aniónicos, el ARNsi se mezcló con protamina. Para determinar la mejor concentración de protamina para el siRNA, el ARNsi se mezcló con diferentes concentraciones de protamina, a partir de 1: 1 a 2: 1 (Figura 3A). Había una eficiencia de encapsulación siRNA 60-65% en liposomas aniónicos sin el uso de protamina. Las muestras con protamina: relaciones molares siRNA de 1: 1 a 1,5: 1 (133 a 266 nM) tenían 80 a 90% de encapsulación siRNA. Las relaciones molares por encima de 1,5: 1 como resultado la precipitación de complejos / protamina siRNA. Estos complejos precipitados no fueron encapsulados en liposomas aniónicos. Después de la adición de protamina a la siRNA hubo un ligero descenso en la concentración del siRNA, debido a la dilución; sin embargo, la concentración se mantuvo estable después de la adición de protamina (Figura 3B). Después de filtrar los liposomas con 50 filtros kDa, 90-95% de la siRNAse asoció con el retenido de liposomas, mientras que 5 a 10% de la siRNA era "libre" en el filtrado. No siRNA se detectó en protamina o liposomas sólo las muestras (Figura 3C).
Para determinar el efecto de LSPCs in vivo, los ratones de tipo salvaje se trataron con LSPCs de 24 hr. PrP C niveles de expresión de ratones de tipo salvaje tratados con LSPCs se compararon con los ratones tratados con PBS 1x y knockout PrP (PrP KO) ratones (Figura 4). Análisis citométrico de flujo PrP C en los cerebros de los ratones tratados con LSPCs mostraron una disminución en los niveles de PrP C (Figura 4A y 4B). En un experimento, todos los ratones tuvieron una reducción del 80-90% de los niveles de PrP C, cerca de los niveles de PrP C que se observaron en los ratones KO PrP (Figura 4A). Los ratones tratados con LSPCs en dos experimentos independientes más mostró una reducción de 40-80% de PrP C </ sup> niveles (Figura 4B). Fuera de los LSPCs total de ratones tratados (n = 14), sólo había un ratón tenía ninguna respuesta a las LSPCs.
Figura 1:. Descripción general del Protocolo para generar PALETS / LSPCs y entregar siRNA por vía intravenosa para el SNC de ratones Los liposomas se han generado a través del método de hidratación película lipídica delgada. A continuación, la PrP C siRNA estaba unido a los liposomas sea a través de una interacción electrostática o por encapsulación. Los PALETS o LSPCs se terminaron mediante la adición del SNC péptido dirigido RVG-9r. Después del montaje, los PALETS / LSPCs fueron inyectadas en las venas de la cola de los ratones, y 24 horas después del tratamiento expresión de PrP C se evaluó mediante citometría de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Protocolo de la película fina de lípido Hidratación método para generar DSPE liposomas para la PALETS Vehículo de salida Los lípidos se disolvieron y se mezclaron en una mezcla de cloroformo:. Solución de metanol, que se evaporó para generar una película lipídica seca. La película de lípido seco se resuspendió en PBS 1x para crear vesículas multilamelares (MLV). MLVs fueron entonces dimensionada de manera uniforme utilizando una extrusora para generar LUVs. Las LUV se pueden utilizar en suspensión, o liofilizadas en alícuotas de un solo uso. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Eficiencia de encapsulación de ARNsi en DSPE PALETS u Sing sulfato de protamina. (a) aproximadamente 60 a 65% de la siRNA se encapsuló sin la adición de protamina. Con la adición de protamina, había una eficiencia de encapsulación 90% entre 1: 1 y 1,5: 1 protamina: relación de siRNA. (B) Después de filtrar los liposomas de cualquier siRNA libre, 90% de la siRNA se encontró en la fracción liposómica, mientras que 5 a 10% de siRNA no encapsulado se encontró en el filtrado. (C) La protamina y liposomas solamente soluciones están libres de siRNA encapsulado. Acerca de 60-65% de siRNA se encapsuló dentro de liposomas DSPE sin el uso de protamina. Con el uso de protamina a una concentración de 186,2 nM, aproximadamente 90% de la siRNA se encapsuló dentro de los liposomas DSPE. Las barras de error indican SEM. **** Indica P <0,0001. * Indica P <0,01. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Representante análisis citométrico de flujo de células del cerebro Suspensiones 24 hr después del tratamiento con LSPCs LSPCs se inyectaron en las venas de la cola de los ratones de tipo salvaje y los cerebros se recogieron 24 horas más tarde. PBS se utilizó como un control de tratamiento, y un ratón PrP KO se utilizó como control para los niveles de PrP C. Los ratones (A) tratados con LSPCs mostraron una disminución significativa de los niveles de PrP C en comparación con el control de PBS, que muestra de tipo salvaje niveles de PrP C. Los LSPCs ratones tratados mostraron niveles de PrP C cercanas a la de un ratón PrP KO. (B) Los datos acumulados de tres experimentos independientes utilizando el mismo protocolo de 24 h de tratamiento mostraron que la cantidad relativa de PrP C en PBS tipo salvaje y LSPCs los ratones tratados. En los tres experimentos, los ratones tratados con LSPCs shocasarse con disminuciones significativas en los niveles de PrP C en comparación con los controles de tipo salvaje de PBS. Las barras de error indican SEM. *** Indica p <0,0003. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este informe describe un protocolo para crear dos sistemas de administración dirigida que transporta de manera eficiente ARNsi al SNC. Los métodos anteriores de la entrega de siRNA en el SNC incluyen la inyección de vectores de siRNA / shRNA directamente en el cerebro, la inyección intravenosa de siRNA dirigidos, o inyección intravenosa de complejos de liposomas-siRNA no dirigidas. La inyección de los vectores de siRNA / shRNA en el SNC no causa una disminución en los niveles de expresión de proteína objetivo. Sin embargo, el siRNA / shRNA no se difunde libremente a través del SNC. Por otra parte, estas inyecciones dan lugar a daños en el tejido nervioso adyacente 6-9. La inyección intravenosa de siRNA dirigidos también se traduce en la reducción de la proteína diana. Sin embargo, la mayor parte del siRNA se degrada por las proteínas séricas 20. Por último, la inyección intravenosa de liposomas no dirigidos-siRNA complejos de resultados en el atrapamiento del siRNA en el hígado y la degradación por el sistema fagocito mononuclear 21. La entrega de siRNAvehículos descritos anteriormente, y LSPCs PALETS, proporcionan un sistema de suministro más seguro, más eficaz y eficiente que los métodos anteriores mediante la entrega de siRNA directamente al sistema nervioso central. Los LSPCs y de los PALETS también son capaces de transportar otros fármacos de molécula pequeña para el SNC.
PALETS o LSPCs deben utilizarse dentro de unas pocas horas después del montaje. De lo contrario existe un riesgo de que el siRNA convertirse en no funcional / degradado. El otro paso fundamental que no se puede detener / interrumpido es la preparación y desarrollo de la suspensión de células para citometría de flujo. Es importante realizar citometría de flujo en el mismo día que se prepara la suspensión de células, ya que la suspensión contiene células vivas que tienen que estar vivo para su análisis.
Hay unos pocos pasos dentro del protocolo que puede ser alterado en función de si los LSPCs o PALETS serán utilizados in vitro o in vivo, en lo fármaco de molécula pequeña se carga en el LSPCs o PALETS, y sobre el trabajoAtory preferencia. En primer lugar, las relaciones molares de lípidos de la LSPCs y PALETS se pueden optimizar para otras aplicaciones. Sin embargo, la fosfatidiletanolamina (PE en DSPE) hidrata mal cuando se usa a un 60% en peso / peso o superior. Cuando se utiliza en estas concentraciones más altas, las moléculas de DSPE se agregarán entre sí y formar una masa insoluble de los lípidos. Esta masa de lípidos no es capaz de encapsular siRNA. Si gas N2 no está disponible, la mezcla de lípidos se puede secar mediante evaporación. La evaporación tiene alrededor de 3 días, y se debe realizar en una campana de humos debido a la utilización de metanol y cloroformo. En este protocolo, la película delgada de lípidos se volvió a suspender en PBS 1x, pero también se puede resuspender con otros tampones de hidratación. Otros tampones incluyen agua, 10% de sacarosa, o cualquier otro tampón acuoso. La elección de la rehidratación de amortiguación depende de la utilización prevista de los liposomas y el agente que se encapsula dentro del liposoma 22,23. El tampón de hidratación debe mantenerse por encima de la gel-liqtemperatura de transición de cristal uid (Tc o Tm) de los lípidos o los liposomas no rehidratar correctamente. En el protocolo descrito, los liposomas suspendidos eran de tamaño uniforme utilizando una extrusora. Sin embargo, los liposomas también pueden ser de un tamaño usando filtros de jeringa o sonicación. Los mismos tamaños de poro de filtro usados para la máquina de extrusión se pueden utilizar como filtros de jeringa. Además, la suspensión de liposomas puede cambiar de tamaño después de la hidratación con la solución de ARNip. Sin embargo, se observó una pérdida de siRNA a partir de liposomas de tamaño cuando por la extrusora después de la etapa de hidratación (datos no publicados).
Dado que el papel biológico de PrP C todavía no se entiende 5, es posible que podría haber algunos efectos nocivos producidos por la reducción de los niveles de PrP C. Sin embargo, porque los ratones deficientes en la proteína prión se desarrollan, se comportan, y la edad normalmente 24, es probable que estos efectos deletéreos sería o menor o no visiblemente aparente. Además, siRNA desmontables de PrP <sup> expresión C no sería eliminar por completo la expresión de proteínas y es completamente reversible sin posibilidad de oncogénesis viral, a diferencia de lentivector RNAi 23.
Limitaciones con los sistemas de administración incluyen la captación de palets aniónicos en las membranas biológicas, y la inmunogenicidad de LSPCs reducen debido a los lípidos catiónicos. Si se observa la inmunogenicidad de los LSPCs, PALETS se pueden utilizar como una alternativa. la absorción reducida de PALETS aniónicos en las membranas biológicas aniónicos se puede superar mediante el uso de PALETS catiónicos, o reformulando PALETS aniónicos con una mezcla de lípidos catiónicos y aniónicos.
En este informe, la reducción de la PrPc varía ampliamente de ratón a ratón. Esta variación puede ser debido a una variedad de factores: la variación entre los ratones, el pequeño diámetro de las venas en ratones, o la degradación de siRNA. El uso de ratones endogámicos debería eliminar gran parte de la variabilidad entre los ratones, pero la variación es siempre posible, inclusocon ratones endogámicos. Además, los ratones tienen muy pequeñas venas en comparación con otros modelos animales. Por lo tanto, la inyección de un gran volumen en las venas de ratones puede ser problemático. Recomendamos la práctica de inyecciones antes de tratar de inyectar PALETS o LSPCs. Sin embargo, incluso con la práctica, a veces todavía tarda un par de inyecciones para obtener todo el volumen de palets / LSPCs en el ratón, y la vena puede colapsar en cualquiera de estas inyecciones. Así, un ratón puede recibir todo el volumen de palets / LSPCs, mientras que otro ratón solamente podría recibir 75 a 90% del volumen PALETS / LSPCs.
Otras posibles fuentes de variación incluyen el tiempo de circulación y la degradación de la siRNA por las proteínas de suero. Los PALETS / LSPCS podrían distribuir más largo antes de llegar al cerebro de un ratón en comparación con otro, lo que podría explicar la variación. Nosotros sólo permitió LSPCs para circular durante 24 horas antes de la eutanasia a los ratones en el experimento anterior. Si el tiempo de circulación está causando la variación, a continuación, el aumento de la circultiempo de ación más allá de las 24 horas debería reducir alguna variación. A pesar de que los paquetes Las siRNA con los PALETS / LSPCs, siempre hay una posibilidad de degradación del medio de entrega de siRNA y / o. Como se mencionó anteriormente, los lípidos catiónicos son un poco inmunogénica. Por lo tanto, si las células inmunitarias en el torrente sanguíneo están atacando a los vehículos, a continuación, se necesitaría más tiempo para que los vehículos que se entregarán en el cerebro o los vehículos podría degradarse. El cambio de los lípidos catiónicos a los tensioactivos aniónicos PALETS podría ayudar a reducir el tiempo de circulación lenta o degradación utilizando lípidos catiónicos.
El péptido RVG-9r transporta los LSPCs y palets a cualquier celda dentro del sistema nervioso central que contiene receptores nicotínicos de la acetilcolina. Esto incluye tanto las células neuronales células de la microglía y astrocitos 26. Para PALETS o LSPCs ser un tratamiento eficaz para las enfermedades priónicas es importante apuntar a todas las células que contribuyen a la patogénesis del prión. Las células neuronales que contienen la mayor PrP C 27,28. Dirigirse a las células neuronales y la reducción de la PrP C expresión de las células podría dar lugar a una disminución de la patogénesis del prión. Sin embargo, las células neuronales no son el único tipo de célula que contribuye a la enfermedad priónica. Los astrocitos se han implicado en la replicación de los priones 29,30. Por lo tanto, no sólo es importante dirigirse a las células neuronales, sino también se dirigen a los astrocitos para reducir la patogénesis del prión.
Los sistemas de administración descritos aquí son susceptibles de diversas estrategias de optimización que los harían adecuados para una amplia gama de aplicaciones de la enfermedad. LSPCs y PALETS son capaces de transportar cualquier fármaco de molécula pequeña para el SNC, no sólo siRNA, que da a los vehículos el potencial de tratar más de las enfermedades neurodegenerativas justo. PALETS y LSPCs se podrían utilizar para tratar cualquier enfermedad que afectael cerebro en función del fármaco de molécula pequeña carga en los vehículos. Además, cambiar el péptido de direccionamiento podría permitir que los vehículos de entrega para entregar fármacos de moléculas pequeñas a un subconjunto específico de células dentro del sistema nervioso central, en lugar de cualquier célula que tiene receptores de acetilcolina. PALETS y LSPCs representan un novedoso sistema de entrega más eficiente y flexible para fármacos de molécula pequeña para el tratamiento de enfermedades que afectan el sistema nervioso central.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
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