Abstract
Fire til seks uker gamle, ble Wistar-hannrotter anvendt for å produsere dyremodeller av leverfibrose. Prosessen krever fire ukers behandling med 10 mg / kg dimethylnitrosamine (DMN), gitt intraperitonealt i tre dager per uke. Intraperitoneale injeksjoner ble utført i avtrekksskap som DMN er en kjent hepatoxin og kreftfremkallende. Modellen har flere fordeler. For det første, kan endringer i lever studeres sekvensielt eller på bestemte stadier av interesse. For det andre kan det stadium av leversykdom bli overvåket ved måling av serum alaninaminotransferase (ALT) og aspartat-aminotransferase (AST) enzymer. For det tredje kan graden av leverskade på forskjellige stadier bli bekreftet ved ofring av dyrene ved angitte tidspunkter, etterfulgt av histologisk undersøkelse av Massons Trichome farget levervev. Etter fire uker med DMN dosering, er den typiske fibrose poengsum 5-6 på Ishak skala. Modellen kan reproduseres konsekvent og har værtmye brukt til å vurdere effekten av potensielle anti-fibrotiske midler.
Introduction
DMN er en potent leverspesifikt toksin. Dens metabolisme, fordeling vev, og evnen til å forårsake skade på leveren hos rotter ble rapportert av Magee 1, og mekanismen for hepatocytter skade og celledød ved apoptose ble beskrevet av Pritchard og Butler 2. Intermitterende administrasjon av denne forbindelsen ble rapportert å indusere leverfibrose hos hunder og rotter 3,4.
Mekanismene og morfologiske forandringer av leverfibrose har blitt grundig undersøkt ved hjelp av denne modellen. I tidlige studier med rotter, 3-ukers behandling med DMN produsert sentrilobulær hemoragisk nekrose etterfulgt av mikronodulær skrumplever uten steatose 5. Det ble vist at i begynnelsen av fibrose, kollagen dannede var mer kryssbundet med type III blir mer fremtredende enn type I-6. I likhet med andre årsaker, ble DMN-indusert fibrotiske forandringer assosiert med en økning i Kupffer celler; levermakrofager som bor in sinusoids. Disse cellene morph inn myofibroblasts og produsere store mengder ekstracellulære matrise som er det primære problemet i fibrose 7.
Når det gjelder cellesignalering, Nakamura et al. Viste at TGF-β spiller en avgjørende rolle i utviklingen av leverfibrose 8. De brukte en adenovirus som uttrykker en avkortet type II TGF-β-reseptoren, spesielt for å inhibere TGF-β signalering. Leverfibrose hos disse rotter ble spectacularly stanset under dmn behandling sammenlignet med kontrollgruppene. Andre studier har bekreftet at undertrykkelse av TGF-β fører til lindring av leverfibrose utvikling 9,10. Modellen ble også brukt i en global gen profilering studie for å identifisere andre fibrose markører og proteiner som kan anvendes som narkotika mål for anti-fibrotiske terapi 11.
Andre kjemiske midler som brukes for å fremkalle leverfibrose omfatte tioacetamid (TAA) og cArbon tetraklorid (CCI4). TAA ble brukt først i rotter og senere i mus 12. Fordelene med denne modellen inkluderer: enkel kjemisk administrering i drikkevann, reproduserbarheten av modellen med karakteristiske mikronodulær cirrhose og biokjemiske forandringer. Ulempene er: den lange periode på 3 måneder for leverfibrose for å utvikle og mangel på forståelse av den molekylære mekanisme for induksjon av leverfibrose. Som for CCI4, har bruken falt av følgende grunner: det ikke etterligne menneskelig leversykdom, har skadelige effekter på ozonlaget, forårsaker smerte og nød til dyr, er svært giftig for mennesker og krever ekstra forholdsregler i sin håndtering og avhending 13,14.
Langvarig gallegang obstruksjon (ved kirurgiske inngrep) som en eksperimentell modell for levercirrhose ble først rapportert av Kountouras et al. 15. Denne metoden er ikke-toksiske for mennesker og dyr. Hsom fører til, varierer den tid som kreves for leverfibrose å utvikle seg. En gjennomgang av 30 rapporter fra Marques et al. 16, fant ut at det tok fra syv dager til fire uker etter operasjonen for leverfibrose å utvikle. De patologiske forandringer beskrevet ligne de av menneskelig kronisk galle fibrose og modellen ville være mer egnet for forskere som er interessert i dette området.
I sammendraget, intermitterende administrasjon av en konstant dose av DMN i rotte over 4 uker produserer leverfibrose som etterligner menneskelig sykdom. Dosert rotter viser progressiv utvikling av leverskade og parenkymatøs fibrose 4,17. Sykdomsprogresjon og alvorlighetsgraden kan overvåkes via blodprøver eller ofring av dyrene på bestemte tidspunkter, og effekten er meget reproduserbar 18. Således modellen har blitt mye brukt for å studere mekanismene for leverfibrose og cirrhose, så vel som for screening av potensielle anti-fibrotiske midler 10,19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av dyr omsorg og bruk komité ved School of Applied Science, Temasek Polytechnic.
1. Utarbeidelse av DMN
- Pipetter 200 ul dmn (1 g / ml stamløsning) og tilsett 19,8 ml PBS for å fremstille 10 mg / ml dmn oppløsning for injeksjon.
Merk: DMN er kreftfremkallende. Bruk et avtrekk å forberede DMN og utføre de dyre injeksjoner.
2. intraperitoneal injeksjon av DMN
- Bruk Wistar hannrotter med en gjennomsnittsvekt på 150-200 g. Akklimatisere rotter i 4 - 7 dager før starten av forsøket.
- Oppretthold rotter ved værelsestemperatur på 22 ± 1 ° C, med 12 timers lys og 12 timers mørke sykluser. Tilveie rottefor og vann ad libitum.
- Mål mat- og vanninntak daglig. Mål kroppsvekt per uke.
- Beregne mengden av dmn for hver rotte basert på en dose på 10 mg / kg kroppsvekt. Bruk en 1 ml sprøyte med en 25 gauge nål to trekke det beregnede volum av dmn oppløsningen inn i sprøyten.
- Beherske rotte for intraperitoneal injeksjon 21.
- Med rotte riktig tilbakeholdne, innføre nålen inn i den nedre høyre kvadrant av abdomen, trekke tilbake på stempelet på sprøyten (ingenting skal aspireres) for å sjekke for riktig plassering av nålen i mage plass og sakte injisere DMN løsning.
- Når dosen av DMN har blitt administrert langsomt trekke nålen og kast inn i skarpe gjenstander.
- Utfør intraperitoneale injeksjoner av DMN for 3 dager i uken i 4 uker. Administrere injeksjoner på samme tid hver dag. Re beregne en dosering basert på kroppsvekt ved begynnelsen av hver uke av injeksjoner.
- Samle blod fra halevenen ukentlig for å måle biokjemiske parametre: alaninaminotransferase (ALAT) og aspartataminotransferase (AST) 22.
- Mål serum ALAT og ASAT bruke en kommersiell VetTest Chemistry Analyzer.
3. Brutto Undersøkelse og Harvest of Liver
- Avlive rotter ved intraperitoneal injeksjon av pentobarbital i en dose på 100 mg / kg kroppsvekt. Sikre død ved å sjekke for manglende hjerteslag.
- Forbered deg på obduksjonen og vurdere tilstanden til dyret som beskrevet av Parkinson et al. 23 Place døde rotter på dissekere bord i ryggleie med magen vendt oppover.
- Desinfisere og fukte huden med 70% etanol.
- Ved hjelp av saks, langsgående snitt i huden hele lengden av den ventrum fra anus til haken, og reflektere huden. Med saksen, langsgående snitt i bukveggen fra anus til xiphoid brusk, for å avdekke abdominal viscera.
- Undersøke abdominal organer in situ for å se etter noe unormalt. Merk eventuelle endringer i farge, størrelse, plassering av organer og tilstedeværelse av væske i bukhulen. Undersøkekonsistensen av organer og merke tilstedeværelse av noen lukt.
- Ved hjelp av saks og pinsett, dissekere hele leveren fri for sine leddbånd og vedlegg.
- Begynn på hilus der det er festet til membranen og arbeide for å frigjøre alle de lever lobes av vedlegg. Klipp forsiktig alle leddbånd og blodkar.
- Overfør leveren på en petriskål og veie leveren.
- Ved hjelp av en skalpell, kutt 2 - 5 mm tykke deler av leveren fliker. For å være konsekvent alltid ta prøver fra samme leverlapp. Ta en kile omtrent 5 mm i diameter i tykkelse, fra den høyre sidefliken 24 ca 1 cm fra kanten av den lobe.Immediately sted i 10% bufret formalin for fiksering. Sørg for at vevet til formalin volum er 1:10 eller mer.
- Harvest og umiddelbart fryse porsjoner (ved hjelp av flytende nitrogen) av leverlappene på dette punktet ved behov for andre studier. Som for (3.8), prøve fra samme leverlapp for konsistens.
- Fest leverprøver i 10% bufret formalin i minst 24 timer.
- Etter fiksering, trimme leveren, legg inn kassetter og laste dem inn i kurven av automatiserte vev prosessor.
- Plasser kurven med kassetter inn i den første stasjonen som inneholder 10% bufret formalin. Sørg kassettene er helt under vann. De kan forbli i dette kammer for opp til 12 timer inntil syklusen begynner.
- Programmere vev prosessor for å rotere kassetter for en time hver, gjennom suksessive stasjoner som inneholder følgende løsninger: etanol ved konsentrasjoner på 50%, 70%, 90%, 100% (2 stasjoner), xylen (2 stasjoner) og flytende parafin ( 2 stasjoner).
- Overfør prøvene lever inn i voks av embedding stasjonen. Pass på at innebygging maskinen er slått på minst én time tidligere.
- Bruke forhånds varmet tang (65 ° C), fjerne hver kassett fra wøks bad og plass på varm plate (65 ° C) av embedding maskinen. Dispensere tilstrekkelig mengde av flytende parafin i den rustfrie stål-basisform (forvarmet til 65 ° C) til halvfull. Overfør den delen av leveren fra kassetten inn i formen. Kontroller at prøven er plassert med snittflaten (for å bli undersøkt mikroskopisk) flatt på bunnen av formen.
- Fyll formen helt med flytende parafin, montere den tomme kassetten på toppen og sett formen på 4 ° C plate av embedding maskinen avkjøles i minst 30 min.
- Sjekk at voksen er avkjølt og størknet, og fjerne parafinblokken fra formen. Blokken skal sprette ut lett og ikke stikke eller sprekke. Hvis dette skjer, smelte blokken og gjenta dette trinnet. Parafinblokk kan seksjoneres når den størkner. Blokker kan oppbevares i romtemperatur i mange år.
- Plasser parafin blokk i mikro- og § 10 mikrometer tykkelse til voksen lager fjernet i tilstrekkelig grad for den innebygde levervev for å være synlig.
- Endre innstillingen på mikrotomen å kutte på 5 mikrometer tykkelse. Bruk pinsett, plukke opp et godt kuttet seksjon ved å holde det på kanten og nøye flyte seksjonen i vannbad ved en temperatur på 40 ° C.
- Stikk forsiktig en ren glass skyve under den flytende delen og løfte den på overflaten av glass-slide. Plasser lysbildet på et lysbilde varmere ved 37 ° C over natten.
5. Masson Trichrome Farging
- Før du søker flekker, behandle lysbildene for å fjerne voks og rehydrere vev som følger:
- Fordyp seksjonene i xylen i 5 min. Gjenta 2x.
- Fordyp delene i 100% etanol i 3 min. Gjenta 1x.
- Fordyp seksjonene for 1 min hver i følgende løsninger etanol: 90%, 80% og 70%.
- Skyll skyve under vann fra springen for å fjerne alle eksisterende etanol på lysbildet.
- Fordype lysbilder i Iron Hematoxylin for 10 min å farge kjernen.
- Skyll lysbildene med vann for å fjerne overskudd av flekken fra lysbildet.
- Fordype lysbildene i Biebrich Scarlet-syrefuksin for 2 min å farge cytoplasma.
- Skyll lysbilder med vann.
- Plasser glir i fosforwolfram / fosfomolybdensyre løsning i 10 minutter for å fremme opptaket av Aniline blått. Endre fosforwolfram / fosfomolybdensyre løsning etter 2 runder med bruk.
- Plasser lysbildene i anilin blå løsning for 10 min å farge kollagen fibrene.
- Skyll det overskytende flekken med vann og plassere objektglassene i 1% eddiksyreløsning i 1 min for å tillate differensiering for å finne sted for å gjøre fargen på sleiden mer delikat og gjennomsiktig.
- Skyll lysbilder med vann og fortsett å dehydrere vevet seksjoner. Dehydrering trinnene er som følger:
- Fordype lysbildene suksessivt i 10 sek hver gang, i følgende concentrations etanol: 70%, 80%, 95% og 100%.
- Fordype lysbildene i 30 sek i 100% etanol. Gjenta 1x.
- Skyll lysbildene gjennom 3 stasjoner xylen i 5 minutter hver til å fjerne etanol.
- Monter et glass dekkglass på prøven med montering media (f.eks DPX mountant) og la tørke.
Merk: DPX er en syntetisk harpiks som tørker raskt, bevarer flekken og beskytter vev delen.
6. fibrose Scoring på Massons Trichome Stained Deler av Liver
- Ha en veterinær patolog vurdere alvorlighetsgraden av fibrose i henhold til fibrose scorer 25. Det ville være optimal hvis den fibrose scoring er utført av to eller tre patologer uavhengig av hverandre på en blindet måte. I et slikt scenario, få en endelig score etter diskusjon og gruppearbeid gjennomgang for å sortere ut eventuelle forskjeller i scoring.
| Score | Beskrivelse |
| 0 | Ingen fibrose |
| 1 | Fibrøs utvidelse av enkelte portalområder, med eller uten kort fiber septa |
| 2 | Fibrøs utvidelse av de fleste portalområder, med eller uten kort fiber septa |
| 3 | Fibrøs utvidelse av de fleste portalområder, sporadisk portal til portal (PP) bridging |
| 4 | Fibrøs utvidelse av portalområder med merkede bygge bro (portal til portal (PP) samt portal til sentrale (PC) |
| 5 | Merket bygge bro (PP og / eller PC) med sporadiske knuter (ufullstendig skrumplever) |
| 6 | Skrumplever, sannsynlig eller klar |
Tabell 1: Fibrose Score brukes til lesing av Massons Trichome Stained Lever §§ 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMN behandlede rotter gå ned i vekt og bli mindre sprek med ruffled pels. Det er betydelig tap i gjennomsnittlig kroppsvekt av DMN behandlede rotter; først påvises etter 2 uker med DMN behandling, og denne forskjellen forblir gjennom uker 3 og 4 etter DMN behandling (Figur 1a). Som rottene får DMN løpet av påfølgende uker, skade på leveren gjør at den blir mindre. Leverindeksen; som er prosent av levervekten ved endelig kroppsvekt var signifikant lavere for de dmn behandlede rotter (Figur 1b).
Figur 1: a) kroppsvekten hos dmn behandlede rotter. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 sammenlignet med normal kontrollgruppe b) leverindeks.; prosent levervekt ved endelig kroppsvekt av DMN behandlede rotter etter 4 uker med DMN treling. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 sammenlignet med normal kontrollgruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
På offer, etter 4 ukers DMN behandling, er leveren mindre og hardere (figur 2a) sammenlignet med de fra alderen matchet kontrolldyrene (figur 2b). Fibrin kan være til stede på leveren overflate og tilstøtende lever fliker blir overholdt. Omtrent 20% av rottene har ascites.
Figur 2: a) Liver fra en rotte etter 4 ukers DMN behandling b) Liver fra alderen matchet kontrollgruppe rotte.. I (a) i leveren er krympet, fast og blek med et gulaktig skjær sammenlignet med leverenfra sin alderen matchet kontrollgruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Skade på leveren forårsaker økt permeabilitet av hepatocytter cellemembranen. Økt ALAT og ASAT er indikatorer på hepatocytter skade. Serum ALT (figur 3a) og AST (figur 3b) av det dmn behandlede gruppe er signifikant høyere enn i kontrollgruppen etter uke 2 og 4 av dmn injeksjon. Serum ALAT og ASAT vanligvis øker etter hver uke av DMN behandling.
Figur 3: a) Serum alaninaminotransferase (ALAT) og b) serum aspartataminotransferase (AST) nivåer av DMN behandlede rotter ved uke 0, 2 og 4 etter siste DMN injeksjon. Dataene er represented som middel ± SD (n = 6 - 8). * P <0,05 sammenlignet med normal kontrollgruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Histologisk undersøkelse av lever fra dmn behandlede rotter viser at det er progressiv økning og utvidelse av fibrøst septa, med tap av hepatocytter, over tid sammenlignet med kontrollrotter. Masson er Trichome flekken er vanlig å markere kollagen innskudd i leveren vev: disse er farget blå.
Figur 4: Mikrofotografier av leversnitt farget med Masson er Trichome: a) lever seksjon fra en normal kontroll rotte, b) lever delen fra en rotte etter å ha mottatt en uke med dimethylnitrosamine (DMN), c) lever delen fra en rotte etter å ha mottatt 2 uker DMN. Det er fiber utvidelse av de fleste portalområder med sporadiske portal til portal bygge bro. D) Liver delen fra en rotte etter å ha mottatt 3 uker DMN. Merk fiber utvidelsen av portal områder med markert portal til portal samt portal til sentrale bridging. E) Liver delen fra en rotte etter å ha mottatt 4 uker med DMN. Det er skrumplever med nodule formasjon. Kontrollen Leveren er fra gruppen avlivet sammen med rotter etter 4 uker med DMN injeksjon. Det er et mønster av progressiv økning av fibrose score fra 0 i (a); 2 i (b); 3 i (c) 4-i (d) til 5/6 i (e). Alle mikrofotografier tatt med en forstørrelse på 40 ganger med en lengdeenhet av målestokken ekvivalent til 100 um. Vennligst cslikke her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en metode for å lage en dyremodell av leverfibrose og for å bedømme graden av leverfibrose. Det er viktig å levere riktig dose av DMN og holder seg til planen for ukentlige intraperitoneale injeksjoner. Etter hvert som eksperimentet utvikler seg, er det viktig å veie rottene og beregne en dose ved starten av hver uke av DMN injeksjoner. Husk at DMN er giftig og må håndteres i avtrekksskap på. Vi utfører intraperitoneale injeksjoner i avtrekksskap i tillegg. Med behovet for gjentatte injeksjoner, er det riktig beherskelse og teknikk for injeksjon viktig å unngå innføring av forurensninger og skader på indre organer. Vi har sjelden dødelighet fra intraperitoneale injeksjoner.
Rotter bør overvåkes 2x i dag gjennom hele forsøksperioden. I løpet av den siste uken av DMN injeksjon, bør dyrene følges enda oftere og nøye for døende tegn. Dette er de period når leverskader er mest alvorlig og berørt rotter vil bli inappetent, mister kroppsvekt og tilstand. 25 - 40% av rotter kan bli alvorlig syk i denne perioden og dø hvis det ikke er noen veterinær intervensjon. Derav nøye overvåkning gjør det mulig for forskere å vurdere tilstanden til dyret og planlegge passende avslutning av forsøket, slik at organene kan nyhøstet fra en rotte avlivet i stedet for å gå tapt for nedbrytning fra uventet død.
Vi har funnet ukentlig måling av ALAT og ASAT å være nyttige indikatorer for utviklingen av leverskader. Vi har også observert at AST er mindre spesifikk enn ALT og knytter dette til sin utgivelse fra skadede erytrocytter og muskelvev i tillegg til leveren.
Sikre at tilstrekkelig mengde blod er oppsamlet under dannelse av det nødvendige volum av serum for analyse. Vi vanligvis samler 200 - 300 mL blod per rotte.
I løpet av collection av leveren vev for histologisk undersøkelse, anbefaler vi prøven hentes fra samme lapp. Dette gjøres etter å ha sjekket at endringene i leveren er ensartet. DMN forårsaker gener endringer i leveren. I de tidlige stadier av studien, vi samplet fra venstre laterale og mediale lapper samt høyre mediale lapp. Vi har ikke observere eventuelle forskjeller i de mikroskopiske endringer mellom disse fliker.
Lever seksjonene skal være løst i 10% bufret formalin i minst 24 timer og behandlet kort tid etter. Langvarig utover en uke kan resultere i vevet blir sprø og vanskelig å seksjonen etter parafin innebygging. Cutting egnede 5 mikrometer tynne snitt krever øvelse og tålmodighet. Seksjoner som vurderes å være egnet med det blotte øye (trinn 4.11) kan undersøkes med mikroskop for å sjekke at de ikke har gjenstander som folder eller tårer i seksjonen. Den fargeprosedyre er best utført i henhold to tidsperioder for lysbilde nedsenking på hvert trinn uten pauser. Under fargeprosessen, sikre at seksjonene blir holdt fuktig hele tiden og overføres fra en fargeløsning til den neste så snart som mulig.
Evaluering av Masson er Trichome farget seksjoner for graden av fibrose krever input av en veterinær patolog. Han / hun er en avgjørende gruppemedlem som bør være en del av studien fra begynnelsen, som han / hun ville være i stand til å gi råd og delta i riktig høsting av organer i alle faser av forsøket. Dermed dagens gullstandard for leverfibrose scoring er vurderingen av riktig farget vevssnitt av en patolog. Selv om det ville være optimalt å ha input av mer enn en patolog, kan dette ikke være mulig i mindre organisasjoner. I slike tilfeller kan objektivitet forbedres ved bruk av bildeteknologi 26. Vi har funnet at resultater fra bildeteknologier sammenlignbare med patologisk scoring (upubliserte data), og anbefaler at den kan brukes som en supplerende metode for evaluering.
I sammendrag, dmn indusert modell av leverfibrose har mange fordeler fremfor andre dyremodeller. Det er en forholdsvis enkel modell for å lage så den ikke krever kirurgisk ferdigheter. Dmn er miljømessig sikrere og mindre giftig for mennesker og dyr enn CCI4 og tar en kortere tid for å fremkalle sykdom enn TAA. Sammenlignet med leversykdom produsert av CCI4, TAA, og gallegang ligation, produserer DMN en nærmere presentasjon av menneskelig leverfibrose. Av disse grunner, ser vi for oss at modellen vil fortsette å bli brukt mye for å studere mekanismene av leverfibrose, så vel som for screening av potensielle anti-fibrotiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dimethylnitrosamine | Wako | 147-03781 | |
| Formalin | Sinopharm chemicals | F63257009 | |
| Ethanol | Sigma | 64-17-5 | |
| Xylene | Fisher | 1330-20-7 | |
| Masson trichome stains | |||
| Aniline Blue | Electron Microscopy Sciences | #42755 | |
| Acid Fuschin | Electron Microscopy Sciences | RT42685 | |
| Scarlet Red | Electron Microscopy Sciences | #26905 | |
| Phosphotungstic Acid Hydrate | ALFA AESAR | ALFA40116.4 | |
| Phosphomolybdic Acid Hydrate | Sigma SG | 221856-25G | |
| Weigert's Iron Hematoxilyn | Merck | 1.15973.0002 | |
| DPX Mounting Medium | Merck | HX066873 | |
| Tissue processor | Leica | Leica TP 1020 | |
| Embedding machine | Sakura | Sakura Tissue Tek TEC5 Embedding System | |
| Microtome | Leica | Leica RM 2235 | |
| Vet Test Analyzer | Idexx | Vet Test 8008 |
References
- Magee, P. N. Toxic liver injury; the metabolism of dimethylnitrosamine. Biochem J. 64 (4), 676-682 (1956).
- Pritchard, D. J., Butler, W. H. Apoptosis-the mechanism of cell death in dimethylnitrosamine-induced hepatotoxicity. J Pathol. 158 (3), 253-260 (1989).
- Madden, J. W., Gertman, P. M., Peacock, E. E. Dimethylnitrosamine-induced hepatic cirrhosis: a new canine model of an ancient human disease. Surgery. 68 (1), 260-267 (1970).
- Jenkins, S. A., Grandison, A., Baxter, J. N., Day, D. W., Taylor, I., Shields, R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol. 1 (5), 489-499 (1985).
- Jézéquel, A. M., Mancini, R., Rinaldesi, M. L., Macarri, G., Venturini, C., Orlandi, F. A morphological study of the early stages of hepatic fibrosis induced by low doses of dimethylnitrosamine in the rat. J Hepatol. 5 (2), 174-181 (1987).
- George, J., Chandrakasan, G. Molecular characteristics of dimethylnitrosamine induced fibrotic liver collagen. Biochim Biophys Acta, Protein Struct Mol Enzymol. 1292 (2), 215-222 (1996).
- Winwood, P. J., Arthur, M. J. Kupffer cells: their activation and role in animal models of liver injury and human liver disease. Semin Liver Dis. 13 (1), 50-59 (1993).
- Nakamura, T., Sakata, R., Ueno, T., Sata, M., Ueno, H. Inhibition of transforming growth factorβ prevents progression of liver fibrosis and enhances hepatocyte regeneration in dimethylnitrosamine-treated rats. Hepatology. 32 (2), 247-255 (2000).
- Shek, F. W., Benyon, R. C. How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis? Eur J Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 123-126 (2004).
- Wang, J. H., Shin, J. W., Son, J. Y., Cho, J. H., Son, C. G. Antifibrotic effects of CGX, a traditional herbal formula, and its mechanisms in rats. J Ethnopharmacol. 127 (2), 534-542 (2010).
- Su, L. J., Hsu, S. L., Yang, J. S., Tseng, H. H., Huang, S. F., Huang, C. Y. F. Global gene expression profiling of dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis: from pathological and biochemical data to microarray analysis. Gene Expr. 13 (2), 107-132 (2006).
- Müller, A., Machnik, F., Zimmermann, T., Schubert, H. Thioacetamide-induced cirrhosis-like liver lesions in rats usefulness and reliability of this animal model. Exp Pathol. 34 (4), 229-236 (1988).
- Martinez-Hernandez, A. The hepatic extracellular matrix. II. Electron immunohistochemical studies in rats with CCl4-induced cirrhosis. Lab Invest. 53 (2), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3894794 166-186 (1985).
- Pritchard, M. T., Apte, U. Models to Study Liver Regeneration. Liver Regeneration. , 15-40 (2015).
- Kountouras, J., Billing, B. H., Scheuer, P. J. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol. 65 (3), 305-311 (1984).
- Marques, T. G., Chaib, E., et al. Review of experimental models for inducing hepatic cirrhosis by bile duct ligation and carbon tetrachloride injection. Acta Cir Bras. 27 (8), 589-594 (2012).
- Wasser, S., Tan, C. E. Experimental models of hepatic fibrosis in the rat. Ann Acad Med Singapore. 28 (1), 109-111 (1999).
- George, J., Chandrakasan, G. Biochemical abnormalities during the progression of hepatic fibrosis induced by dimethylnitrosamine. Clin Biochem. 33 (7), 563-570 (2000).
- Shimizu, I., Ma, Y. R., et al. Effects of Sho-saiko-to, a Japanese herbal medicine, on hepatic fibrosis in rats. Hepatology. 29 (1), 149-160 (1999).
- Wang, Y., Gao, J., Zhang, D., Zhang, J., Ma, J., Jiang, H. New insights into the antifibrotic effects of sorafenib on hepatic stellate cells and liver fibrosis. J Hepatol. 53 (1), 132-144 (2010).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat. J Vis Exp. (99), (2015).
- Parkinson, C. M., O'Brien, A., Albers, T. M., Simon, M. A., Clifford, C. B., Pritchett-Corning, K. R. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Ruehl-Fehlert, C., Kittel, B., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Ishak, K., Baptista, A., et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol. 22 (6), 696-699 (1995).
- Sant'Anna, L. B., Sant'Anna, N., Parolini, O. Application of computer assisted image analysis for identifying and quantifying liver fibrosis in a experimental model. J Comput Interdiscip Sci. 2 (2), 139-148 (2011).
