Introduction
유사 분열 동안, 복제 된 게놈이 염색체 새로 형성된 딸세포 위에 자매 염색 분체의 동일한 분포가되도록하여 셀 적도 구성된다. 염색체 위치 및 분리는 두 개의 반대 중심체에서 발생하는 스핀들 미세 소관에 자신의 첨부 파일에 의해 매개된다. 충실 염색체 분배를 보장 외에도 방추사의 방향은 또한 세포 분열 평면 일을 지시. 세포 분열의 조정 방향은 개발의 여러 단계 동안 조직의 항상성이 필수적이다. 특히, 규제 유사 분열 스핀들의 위치는 휴대 내용의 비대칭 분포 될 수 있습니다 또는 다른 크기 2의 딸 세포를 생산하고 있습니다. 유사 분열 스핀들 조립 및 방향 의향에 시작 협력과 힘 발전소 3,4를 길항 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조율된다. 생성 된 힘은 B 구성OTH 당기고 미는 힘. 이러한 힘은 세포 외피와 스핀들 주소록에서뿐만 아니라 발 스핀들 내에 모두 기인 한 미소 관 역학뿐만 아니라 분자 모터 및 가교제 (도 1)에 의해 생성 될 수있다.
미세 소관은 세포 외피로서 단단한 구조에 대해 증가 할 때 가압력을 생성 할 수있다. 시스템 내에서 발생하는 총 저항력에 따라이는 유사 분열 스핀들 (낮은 힘)의 재배치가 발생하거나 미세 소관의 좌굴 또는 재앙 (높은 힘) 5-8를 트리거 할 수 있습니다. 길이가 9 미세 소관이 좌굴 강한 결정이므로 누름으로써 생성 될 수 힘의 크기는 미세 소관의 길이에 의존한다. 또한, 하나의 중심체에서 발생한 미세 소관, 다른 중심체 대해 초기 의향에 3,10- 중심체 분리 구동 제안 된 메커니즘을 밀 수있다.
광고에서성장 미세 소관에 의해 생성 된 힘을 추진, 미세 소관이 접촉 단부 셀 피질시 조건은 힘 (11)를 당겨 중재 할 수 있습니다. 여러 실험실에서 연구 피질 힘 발생기의 조절 활성을 생체 (1) 유사 분열 스핀들의 비대칭 위치 결정을 위해 필요한 것으로 나타났다. 이 당기는 힘에 필수는 (이하 '네인'이라 함) 피질 지역화 세포질 네인, 마이너스 엔드 감독 미세 소관 모터 단백질 8,12,13이다. 예를 들어, 효모, 피질 (14)을 따라 슬라이딩 모터에 의존하는 미세 소관의 미세 소관 격자 결과 대뇌 피질의 네인의 측면 상호 작용을 신진한다. 그러나, 피질 당기는 힘은 미세 소관 8 해중합에 말에 첨부 형성 네인의 기능에 의해 생성 될 수있다. 미세 소관의 수축에 의해 생성 된 에너지는 일반적으로 높은 차수의 힘으로 이어질 수있다 (~ 50 PN (15 참조 16)). 해중합 미세 소관에 대뇌 피질의 네인의 최종에 첨부 신진 효모 (17)와 C에 스핀들 위치를 촉진 엘레 13. 모터에 의존하는 슬라이딩 및 미세 소관 해중합 구동 모두 대뇌 피질의 당기는 힘이 협력 또는 생체 내에서 상호 배타적 수 있는지 여부는 현재 알 수없는이다.
미세 소관 가압력과 네인 매개 피질 당기는 힘 이외에, 중심체의 위치는 다수의 다른 단백질에 의해 방추사 내에서 제어된다. 키네신 -5- 모터는, 예를 들면, 외측으로 슬라이딩 힘 18-20의 발생을 초래 평행 극간 소관 링크를 교차 할 수 사량 체로서 존재한다. 키네신-5 모터 가족의 일원은 C.를 제외하고, 연구 모든 진핵 생물의 중심체 분리 및 바이폴라 스핀들 조립에 필요한 엘레 (참고 21에서 검토).
또한, Ase1 / PRC1 가족의 확산 가교제는 생체 내에서 체외 22-27에서 극간 미세 소관의 미세 소관 영역을 중복으로 지역화하는 것으로 알려져있다. 중복 미세 소관 영역의 Ase1 중심의 확장에 의해 생성 된 힘은 시험관 (28, 29)에 키네신-14 매개 슬라이딩 힘을 상쇄 할만큼 크다. 세포에서 Ase1 / PRC1는 스핀들 midzone 25-27,30에 미세 소관 중복 영역 확산 가교제에 의해 발생하는 힘이 크게 스핀들 조직에 기여할 수 있다는 것을 암시 안정적인 형성을 위해 필요하다. 마지막으로, 유사 분열 염색질에서 힘과 kinetochores 다양한 경로 3을 통해 유사 분열 스핀들 어셈블리 및 위치에 영향을 미친다. 이들 구성 요소는 여기에 기재된 재구성 분석법의 일부가 아닌 때문에, 상세히 설명되지 않을 것이다.
jove_content "> 다른 이론은 위에 설명 된 다른 분자 구성 요소와 세력이 주축 조립 및 위치에서 협력하는 방법에 존재하지만, 우리는 정량적 인 이해에서 멀리 아직도이다. 또한 실험에 살아있는 세포에, 정제 된 구성 요소와 생체 외 실험은 강력한를 제공 경로가이 목표를 달성 할 수 있도록. 여기에 우리가 기본 스핀들 유 중수 에멀젼 방울에서 재구성되는 최근 발표 된 방법의 적용 및 확장 버전 (로스 등. 31)에 대한 시각적 가이드를 제공하는로 시작 마이크로 유체 기술을 이용하여 부품의 최소 개수. 구면 방울이 분열 세포에 필적 크기로 생성된다. 이러한 액적 내에 정제 중심체와 튜 불린은 미세 소관 애 역학 연구 생성 및 애 - 애 상호 작용을 강제하기 위해 결합 될 수있다.하여 대뇌 피질 (예 : 네인 등) 간 극성 (예 : 키네신-5 / Ase1) 강제 발전기를 도입, 우리생체 내 상황을 닮은 시작 점점 복잡 스핀들 형 구조를 재구성한다.Protocol
마이크로 유체 칩의 1. 준비
주 : 스핀들 조립체의 상향식 연구를 위해 구형 유 중수 에멀젼의 액 적이 이용된다. 이러한 인지질 및 계면 활성제의 단층에 의해 주변 오일 상으로부터 분리 수성 미세 방울이다. 이 에멀젼 방울은 미세 유체 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 칩 내에서 생성된다. 채널 형상 및 유속의 변화를 조정할 액적 크기를 사용할 수있다. 여기에 설명 된 미세 설계에서, 액 포유류 유사 분열 세포의 기하학적 제한을 모방 약 15 ㎛의 직경이 생성된다.
- 포토 마스크의 설계 및 금형 제작
- 세 유입 채널 (31)을 포함하는 포토 마스크를 디자인합니다. 입구 채널 1은 방울 내용을 (섹션 3 참조 "기본 미세 소관 과꽃를 재구성")이 포함 된 물 상에 연결합니다. 입구 채널 2는 오일 상 (섹션 2.1 "지질 / 오일-PHA에 연결자체 준비 "). 관찰 (선택 사항) (그림 2a와 b 전에 추가 지질 / 오일 상과 에멀젼 방울을 희석 입구 채널 3을 사용).
주 : 모든 입구 채널 트랩 먼지 PDMS 입자 (단백질 -) 응집체에 먼지 필터 (2 ㎛의 채널의 미로) 뒤에되고 미세 유체 채널을 (도 2D)를 차단하는 것을 방지 할 수 있습니다. 채널은 75 μm의 폭 에멀젼 방울 (그림 2C)을 형성하는 12.5 μm의 다양한 접점에서 지질 / 오일 상과 물 상 대회이다. - 음의 극성 (포토 마스크는 투명한 설계 구조 어두운 예정), 주문 및 필름 기판에 인쇄 된 포토 마스크를 얻을 수 있습니다.
- 세 유입 채널 (31)을 포함하는 포토 마스크를 디자인합니다. 입구 채널 1은 방울 내용을 (섹션 3 참조 "기본 미세 소관 과꽃를 재구성")이 포함 된 물 상에 연결합니다. 입구 채널 2는 오일 상 (섹션 2.1 "지질 / 오일-PHA에 연결자체 준비 "). 관찰 (선택 사항) (그림 2a와 b 전에 추가 지질 / 오일 상과 에멀젼 방울을 희석 입구 채널 3을 사용).
- 금형 제작
- 클린 룸 환경 (1800 rpm으로 45 초 다음에 500 rpm으로 10 초)을 스핀 코터를 사용하여 4 인치 실리콘 웨이퍼 상에 스핀 코팅 SU-8, 포토 레지스트 (3025)에 의해 주형을 제조.
- SU-8 코팅을 노출포토 마스크를 통해 실리콘 웨이퍼. 40 μm의 두께 ~의 채널을 만들려면 제조업체의 지침에 따라 웨이퍼를 개발한다.
- 미세 유동 칩 만들기
- 플라스틱 주걱을 이용하여 보트 형 용기에 1 부 경화제 (총 40 ~ GR) 10 파트 PDMS 예비 중합체를 혼합한다. ~ 30 분 동안 진공 챔버에서 보트 형 용기를 포함하는 지역 PDMS. 공기 방울을 제거합니다. ~ 1cm가 가장자리를 직립 한 잔을 형성하기 위해 금형 주위에 알루미늄 호일을 감싸.
- PDMS의 부어 (~ 총 용적의 75 %)을 금형에 또 다른 ~ 30 분 동안 진공 챔버에서 떠난다. (기포를 제거하기 위해) 그리고 오븐에서 100 ℃에서 1 시간 동안 경화.
- 스핀 코트 100 ℃에서 1 시간 동안 경화 한 다음, 유리 슬라이드 상에 남아있는 PDMS (4000 rpm에서 30 초 다음에 200 rpm에서 5 초). 압축 공기 / N 2 -flow은, 사전에 청소가 필요하지 않습니다 사용하여 유리 슬라이드의 먼지를 제거합니다.
주 : PDMS 코팅 유리 슬라이드 마이크 모두 사용될 수있다rofluidic 칩과 흐름 전지 생산 (또한 2.2 참조). - 부드럽게 면도날을 사용하여 금형의 오프 PDMS 스트립 펀치 구멍 (입구 0.5 mm, 출구 0.75 mm)을 미세 유체 칩을 몇 초 동안 실험실 코로나 표면 treater를 사용 PDMS 코팅 유리 슬라이드를 .Corona 대우 .
- (채널이 아래를 향하도록) 유리 슬라이드 위에 마이크로 유체 칩을 놓고 O를 칩을 구워 / n은 100 ° C에서 (그림 3a). 먼지가없는 환경에서 몇 달 동안 미세 유체 칩을 저장합니다.
2. 미세 유체 설치
주 : 에멀젼 소적은 마이크로 유체 설정 및 상기 미세 유체 칩을 사용하여 생성 된 유중. 지질 / 오일 상 조성물은 실험 조건에 따라 변화 될 수있다. 오일 가용화 지질 내부에 물 대향 그들의 극성 머리기를 갖는 유수 계면에 단층을 형성한다. 단백질을 표적으로하기 위해액적 경계 (예 네인)는 바이오틴 포스파티딜 소량은 (는 바이오틴-PE) 지질 첨가 할 수있다. 이 비오틴 네인의 채용은 스트렙 타비 딘 - 매개 멀티 머화를 통해 (4.1 "네인은 방울 피질을 대상으로"참조) 할 수 있습니다. 액 계면 활성제의 첨가에 의해 안정화 PDMS 코팅 된 유동 셀에 저장된다.
- 지질 / 오일 상 준비
- 믹스 클로로포름에 용해 1,2- dioleoyl- sn- 4에 글리세로 -3- 포스 포 L 세린 (DOPS) 및 바이오틴 PE 지질 : 유리 피펫을 사용하여 유리관 1 몰비 (광범위 전에 클로로포름 피펫 린스 용도). 0.5 ㎎ / ㎖ ~의 지질 농도를 초래 ~ 250 μg의 총 지질을 준비한다.
- 조심 N이 -flow와 후속 ~ 1 시간 동안 진공 챔버 내의 지질 혼합물을 건조. 0.5 밀리그램 / ㎖ (~ 500 μl를 만들)에 미네랄 오일 및 2.5 % 계면 활성제에있는 말린 지질을 녹여.
- 의 지질 / 오일 샘플을 배치초음파 욕조와 30 분 동안 초음파 처리. 40 kHz에서 완전히 지질을 용해한다.
- 플로우 셀 제조
- 스핀 코트 PDMS 커버 유리 상 (4000 rpm에서 30 초 뒤에 200 rpm에서 5 초) (또한 섹션 1.3 참조) 유리 슬라이드 균일 한 층을 증착하기 위해 (30 초 1,500 rpm으로 다음에 100 rpm에서 5 초) PDMS의.
참고 : 최적의 영상 품질을 위해 현미경 목표와 일치하는 두께로 커버 유리를 사용해야합니다. 1.5 (~ 0.17 mm)이 경우. - 오븐에서 100 ℃에서 1 시간을 위해 PDMS 코팅 유리 커버 유리 슬라이드를 치료. 밀접하게 간격으로 흐름 세포를 확인합니다 (~ 2mm) 실험실 밀봉 필름의 얇은 조각 (~ 폭 3mm)을 PDMS 코팅 된 유리 슬라이드 위에. 먼지가없는 환경에서 보관하는 경우, 사용되지 않은 채널은 다른 시간에 사용될 수있다.
- 실험실 밀봉 막 ~ 1 분을 용융하여 PDMS 코팅 커버 슬립과 인감 흐름 세포를 커버. 100 ° C에서 누르십시오부드럽게 (도 3C). Valap (도 3c)와 실험실 밀봉 필름 - 유리 - 경계를 닫습니다. 스토어 흐름 세포 먼지가없는 환경에서 몇 개월.
- 스핀 코트 PDMS 커버 유리 상 (4000 rpm에서 30 초 뒤에 200 rpm에서 5 초) (또한 섹션 1.3 참조) 유리 슬라이드 균일 한 층을 증착하기 위해 (30 초 1,500 rpm으로 다음에 100 rpm에서 5 초) PDMS의.
- PDMS 컵 준비
- 장기 이미징 (~ 3mm 두께) PDMS의 조각으로 4 mm 직경의 구멍을 펀칭함으로써, PDMS 컵을
- PDMS의 슬라이스와 PDMS 코팅 커버 유리를 코로나 처리하고 서로의 상단에 배치합니다. / N (100 ° C에서) (그림 5a) O를 PDMS 컵 구워.
- 에멀젼 액적 형성
- 도립 명 시야 현미경 액적 형성을 모니터한다. PEEK 튜브를 사용하여 미세 유체 칩에 압력 컨트롤러를 연결합니다 (직경 : 510 μm의 (외부) 125 μm의 (내부)) (그림 3a). 완전히 입구 2에서 지질 / 오일 상과 미세 유체 칩을 입력합니다.
- MRB80 기반의 물 위상을 소개합니다 (3 절 "재구성 기본 미세 소관 과꽃 참조4) 변경 지질 / 오일 상과 물 상 압력에 의해 입구 1. 제어 방울 크기에서가 ~ 직경 15 μm의 (그림 3B)를 방울을 만들 수 있습니다.
참고 :이 설정을 사용하여이 원하는 크기의 방울을 만들려면 물 위상에 대한 지질 / 오일 상과 ~ 200 밀리바에 대해 ~ 800 밀리바를 사용합니다. - 원하는 액적 크기와 필요한 금액을 획득 한 후 (~ 샘플 당 10 μL)을 (완전히 흐름 세포를 기입) 흐름 세포에 출구 채널 및로드에서 방울을 수집합니다.
- 신중 Valap를 사용하여 유동 셀의 단부를 닫 (불완전 폐쇄 된 유출 셀 화상 그들에게 어렵게 액적 광범위한 이동 될 수있다). 또한, 액체 방울의 운동 결과 기포의 형성을 방지한다.
- 샘플 교차 오염 및 막힘을 방지하기 전과 사용 후 이소프로판올로 광범위하게 PEEK 튜브를 씻어.
3. 재구성 기본 미세 소관 Asters에
참고 실험 조건에 따라 물방울 내용을 변화시킬 수있다. 모든 버퍼 MRB80 계 (80 mM의 파이프, 1mM의 EGTA, 4 밀리미터의 MgCl 2 (PH 6.8))이고, 모든 샘플을 얼음에 제조된다. 일반적으로, 방울 항상 중심체, 미세 소관 중합, 탈산 소제 시스템 및 차단 에이전트에 필요한 구성 요소를 포함하는 (3.1 절 참조). 원하는 경우 미세 소관의 힘 - 발전기 및 필요한 보조 인자 및 타겟팅 요인이 포함될 수있다 (섹션 4.1 및 4.2 참조).
- 에멀젼 방울에 애 형성을위한 일반 설정 (그림 3 차원)
- -80 ° C에서 작은 분량 씩 미리 저장 포도당 산화 효소 (200 mM의 DTT 및 10 ㎎ / ㎖ 카탈라아제 20 ㎎ / ㎖ 포도당 산화 효소) 믹스를 준비합니다.
- κ 카세인, 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 "차단 믹스 '준비 트윈 20 (중립 마커 등) 형광 덱스 트란 작은 aliquo 사전 및 저장소 (표 1 참조)-80 ° C에서 TS. 반복 동결 - 해동 사이클을 방지합니다. 확인 모든 구성 요소가 신선하게 준비한다.
- 작은 분취 량 -150 ° C에서 Moudjou 외. (32) 및 매장 된 바와 같이 인간 림프 KE37 세포주에서 중심체 정제.
- 실온에서 중심체를 해동하고 20 분 ~ 37 ° C에서 품어. 사용하기 전에 적절한 미세 소관의 핵을 보장합니다.
참고 :이 실험 기간 동안 미세 소관의 핵을 촉진한다. - 그 동안, 튜 불린 (형광등 "어두운"), 구아노 신 트리 포스페이트 (GTP), 산소 스 캐빈 저 시스템을 포함하고, '분석 믹스'준비 (글루코스, 글루코스 산화 효소, 카탈라제 및 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT)) 분자 동력 발생기 (예를 들어 미세 소관 모터 / 가교제), 아데노신 삼인산 (ATP) 및 ATP-재생 시스템 (포스 (PEP), 피루 베이트 키나아제 (PK) 및 젖산 탈수소 효소 (LDH)) 얼음 (표 2 참조).
- 를 미리 냉각얼음에 airfuge 로터. 냉각 airfuge 로터 (3 분 30 PSI) .Add 예열 중심체 (1-2 중심체가 포함 된 물방울을 목표로 중심체의 양을 최적화)에 샘플을 스핀 다운.
- 2.3 절에 설명 된 방법을 사용하여 에멀젼 액 적을 생성하기 위해 결합 된 조합을 사용한다.
| 구성 요소 | 주식 농도 | 최종 농도 (분석에서) | 음량 | 댓글 |
| 덱스 트란-647nm | 75 μM | 3.75 μM의 (0.6 μM) | 5 μL | |
| κ 카제인 | 20 ㎎ / ㎖ | 12.5 ㎎ / ㎖ (2 ㎎ / ㎖) | 62.5 μL | |
| 트윈 -20 | 5 % | 0.375 % (0.06 %) 7.5 μL | ||
| BSA | 200 ㎎ / ㎖ | 12 ㎎ / ㎖ (1.9 ㎎ / ㎖) | 6 μL | |
| MRB80 | 19 μL | |||
| 100 μl의 최종 | 2 μL 씩에 보관 |
표 1의 '차단 믹스'의 구성 성분 차단 믹스 구성물 유 중수 에멀젼 방울 스핀들 형 구조의 재구성에 필요한.. 설명은 "기본 미세 소관 과꽃를 재구성"본문 (3)을 참조하십시오. 재료에 대한 자세한 내용은 "자료 표를 참조하십시오.
| 구성 요소 | 주식 concentratio엔 | 최종 농도 | 음량 | 댓글 |
| 차단 믹스 | 1.6 μL | |||
| 튜 불린 | 500 μM | 30 μM | 0.6 μL | |
| 튜 불린-561분의 488 | 50 μM | 3 μM | 0.6 μL | |
| GTP | 50 mM의 | 5 밀리미터 | 1.0 μL | |
| 네인-TMR | 178 nm의 | 30 nM의 | 1.7 μL | |
| 스트렙 타비 딘 | 5 ㎎ / ㎖ | 200 nm의 | 0.4 μL | 대뇌 피질의 네인 전용 |
| 키네신-5 | 1.6 밀리미터 | 80 nM의 | 0.5 μL | |
| ATP | 25 mM의 | 1 ㎜ | 0.4 μL | 모터 전용 |
| 원기 | 0.5 M | 25.6 밀리미터 | 0.5 μL | 모터 전용 |
| PK / LDH | 800 U / 1,100 U | 23 U / 32 U | 0.3 μL | 모터 전용 |
| Ase1-GFP | 400 nm의 | 80 nM의 | 2.0 μL | |
| 포도당 | 2.5 M | 50 mM의 | 0.3 μL | 마지막 단계 |
| 포도당 산화 효소 | 50 배 | 1.0 배 | 0.3 μL | 마지막 단계 |
| MRB80 | 엑스 | |||
| 9 μl의 최종 |
표 2 : '분석 믹스'의 구성 성분. 자료 표를 참조하십시오.
4. 소개 스핀들 어셈블리 요인
참고 : 여기에 설명 된 분석에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 S.의 잘린 버전을 -tagged 세레 비지에 네인 인위적 33 -tag 아미노 말단 글루타티온 S 트랜스퍼 라제 (GST)에 의해 이량 체화되는 것을 사용 하였다. 이 단백질은 단백질의 두 복사 IgG에 결합 도메인을 포함하는 친 화성 태그를 통해 정제한다. 여기에서 사용 된 변형은 카르복시 말단 및 N- 말단 SNAP 태그는 정제 된 단백질을 사용하는 비 오티 상으로 테트라 메틸 (TMR) 라벨로 표지된다. 구조의 자세한 내용은 로스 등의 알을 참조하십시오 (31).; 정화 자세한 내용은, 녹화를 참조하십시오케이 - 피터슨 등. 33. GFP - 비오틴 - 네인-TMR은 네인하는 바이오틴 PE 지질 (그림 3E)를 연결 비오틴 - 스트렙 타비 딘 복합체의 형성을 통해 액적 피질을 대상으로 할 수 있습니다.
- 네인 액적 코어 텍스에 타겟팅
- '세이 믹스'로 GFP-비오틴 네인-TMR 포함 30nm의 최종 액적 농도 (표 2 참조). "검정 믹스 '로 스트렙 포함 200nm의 최종 액적 농도 (표 2 참조).
참고 : 네인은 미세 소관에 단계적인 운동 ATP-가수 분해에 따라 달라집니다. 따라서, ATP 및 "검정 믹스 '로 (PEP 및 PK / LDH를 포함)는 ATP의 재생 시스템을 포함한다 (표 2 참조).
참고 : 재조합 전체 길이 S. pombe GFP-Cut7 (키네신-5) 친절하게 에즈 연구소 (분자 생명 공학, TECHNISCHE Universitat 드레스덴, 독일 드레스덴 센터)에 의해 제공되었다 참조하십시오. 재조합 전체-1ength 히스티딘 - 태그 S. pombe GFP-Ase1는 친절하게 Jansons 연구소 (와게 닝겐 대학, 와게 닝겐, 네덜란드)에서 제공하는 80 nm의 농도에서 '분석 믹스'에 추가되었습니다.
- '세이 믹스'로 GFP-비오틴 네인-TMR 포함 30nm의 최종 액적 농도 (표 2 참조). "검정 믹스 '로 스트렙 포함 200nm의 최종 액적 농도 (표 2 참조).
5. 이미지
참고 실험 중에 미세 소관 성장 온도를 변화시킴으로써 제어 될 수있다. 촬상 조건을 선택할 때, 트레이드 오프는 고품질의 영상, 긴 시간 기간에 대한 스핀들 조립체를 모니터링하는 기능 사이되어야한다. 다른 조건에서, 스핀들 형성의 동역학과 비교하기 위해, 다른 내용 액을 혼합 및 그 유로에 이미징 될 수있다.
- 기본 이미지 설정
- 밀폐 된 챔버를 이용하여 온도 제어 환경에서 이미지. ~ 30 분에서 26 ° C를 후 개별 미세 소관을 시각화합니다. 촬상 동안 30 ° C 이상까지 온도를 증가시킴으로써 미세 소관의 성장을 촉진한다.
참고 : Settings는 아래의 현미경 설정에 특정한 다른 시스템과 다른 운영 소프트웨어와 다를 수 있습니다. 여기에 설명 된 분석의 모든 회전 디스크 공 촛점 머리를 가진 전동 역 시스템의 이미징 및 Andor의 지능 지수 3.1로 이미징 소프트웨어를 사용하여 작동한다. 100X 오일 침지 목적과 EMCCD 카메라와 함께 모든 이미지를 얻습니다. - 설정 여진 레이저 488, 561 ~ 약 10 %의 강도로 641 나노 미터. 의 '취득'패널로 이동 10 %로 'AOTF'탭과 슬라이드 레이저 강도를 클릭합니다. 설정을 저장하기 위해 '기록'을 클릭합니다.
- Z -projections를 들어, 1 μm의 간격 (~ 20 이미지 / 방울)와 스택을. '패널을 클릭'주 '카메라로 이동 편집 Z'와 설정 'Z 단계'1.0.를 클릭하면 '설정을 저장하기 위해'다음.
- '인수'패널에서 '카메라'탭을 클릭하여 최대 선형 EM-이득을 설정하고 300 세트 노출에 EM 이득 막대를 밀어같은 탭에서 200 밀리 배. 설정을 저장하기 위해 '기록'을 클릭합니다.
- 밀폐 된 챔버를 이용하여 온도 제어 환경에서 이미지. ~ 30 분에서 26 ° C를 후 개별 미세 소관을 시각화합니다. 촬상 동안 30 ° C 이상까지 온도를 증가시킴으로써 미세 소관의 성장을 촉진한다.
- 라이브 영상
- 라이브 영상의 경우, 사용하여 소프트웨어 컨트롤 Z -projections 매 2 분을합니다. ~ 100 밀리의 노출 시간을 감소시켜 1-2 시간 기간 동안. (5.1.3에 설명 된대로) (로 5.1.4에서 설명) 2 μm의 Z -intervals을 증가시킨다. '반복 t'를 클릭하고 2 분으로 설정, 주 '카메라'패널에서 시계열을 설정합니다. 120 분의 총 시간 간격.
- 실시간 분석의 경우, 액 적을 최대한 움직일 수 있는지 확인하기 위해 PDMS 컵 대신 일반 플로우 셀을 사용한다.
- 이 조건의 결합 이미징
- 마이크로 유체를 사용하여 방울을 생산하고 얼음에 PDMS 코팅 유리 슬라이드 위에 저장합니다. 방울들의 제 2 세트가 형성 될 때까지이 미세 소관 핵 형성을 방지한다. 방울들의 제 2 세트를 생성하기 전에, PEEK 튜브와 함께 미세 유체 칩 린스MRB80 완전히는 지질 / 오일 상과 미세 유체 칩 리필.
- 와 다른 색상으로 물방울 구별하기 위해 형광 덱스 트란 (또는 다른 파장의 형광으로 사용 덱스 트란)없이 방울을 생성합니다. 물방울의 두 번째 배치를 제조 한 후, 부드럽게 피펫 팅하여 방울을 섞어 하나의 흐름 셀 / PDMS-컵에 넣습니다.
- 이미지 분석.
- 피지 (오픈 소스 소프트웨어 온라인) (34)를 사용하여 이미지를 분석 할 수 있습니다.
- 'hyperstack하는 스택'- 'hyperstacks'- 실시간 분석은 '이미지'를 사용 hyperstacks에 스택을 변환합니다. Z-조각 및 시간 프레임의 정확한 수를 설정합니다.
- '스택'- - 'Z-프로젝트', '이미지', Z-예측을 선택하기 위해. '최대 강도'투사을 선택합니다.
- 3 차원 복원의 경우, 첫 번째 '이미지'로 이동 - '속성'및 픽셀 heigth, 복셀 깊이와 FR과 적절한 픽셀을 설정AME 간격. '확인'을 클릭합니다. '스택'- - '3D 프로젝트'는 '보간'확인란을 선택하고 '확인'을 클릭 '이미지'를 선택합니다.
Representative Results
이전 섹션에 제시된 방법은 유 중수 에멀젼 액 적의 형상을 한정하여 복잡성이 증가함에 따라, 스핀들 형 구조의 재구성을 허용한다. 이 섹션에서는 성적이 분석의 능력을 보여 대표적인 결과를 설명합니다.
바이폴라 스핀들 조립 될 때 유사 분열 동안, 세포는 인간 세포에 대해 측정 된, 약 15 ㎛의 직경을 갖는 구체를 형성하는 라운드. 이 특성 유사 분열 세포 형태는 제한하고 모두 스핀들 크기와 방향 (35, 36)를 지시하는 기하학적 경계를 제공합니다. 미세 유체 기술은 정확하게 살아있는 세포에서 관찰 된 상황과 유사하기 때문에 체외에서 유사 분열 스핀들 상향식 재구성을 허용 기하 구속의 레벨을 제공한다.
(그림 4a, 왼쪽 패널) 내에서 확산. 약 20 ~ 30 분 후, 첫 번째 미세 소관은 미세 소관은 모든 방향으로 피질에 성장 표시 및 중심체 확산이 제한된다됩니다. 중간 길이 (액적 직경의 약 50 %)의 미세 소관과 과꽃은 (입체), 다른 중심체와 피질 서로 밀어 미세 소관으로, 각각 다른 물리 칠 수 있습니다. 이것은 서로 (그림 4a, 가운데 패널)을 반대하는 두 개의 중심체 전형적인 '양극'스핀들과 같은 배열을 초래한다. 미세 소관은 액적 직경의 ~ 50 % 이상 증가하는 경우미터는 중심체는 방울 피질 (그림 4a, 오른쪽 패널)을 따라 성장하는 미세 소관으로, 액체 방울의 반대 경계에 더 밀어 얻을. 이들 분석에서 미세 소관 성장률 온도-tubulin의 농도 모두에 매우 민감하다는 것이 중요하다. 핵이 처음 발견 될 때 정상 상태 애 위치에 도달하면이 매개 변수는 따라서 강력하게 시간에 영향을 미칠 것입니다.
세포에서 대뇌 피질의 당기는 힘은 미세 소관 플러스 엔드 및 피질 관련 네인 사이의 부하 베어링 첨부 파일의 형성을 통해 생성된다. 동물 세포에서이 협회는 Gαi 1의 N 말단 미리 스토 일화를 통해 세포막을 대상으로하는 Gαi / LGN / NUMA 단지에 따라 달라집니다. 이러한 재구성 분석법에서 Gαi / LGN / NUMA 착물의 요구를 직접 통해서 비오틴 네인 지질에 결합하여 우회비오틴 - 스트렙 트 아비딘 - 비오틴 복합체의 형성. 이 채권은 상대적으로 안정적 (K D ~ 10 -14 M) (37)이며, 빠르게 형성 (일반적으로 미세 소관의 핵 명백한되기 전에, 에멀젼 액적 형성 후 10 분 이내) (그림 4B). 네인의 부재에서, 중심체가 액적 피질 (도 4c)의 양측에 가압되는 반면 피질 네인의 존재 중심체는 일반적 이상의 중앙 위치를 유지한다. 우리는이 방지하고 미세 소관 추진 세력에 대항 두 가지 효과의 결과이다 추론. (1) 네인 직접 미세 소관의 재해하여 미세 소관의 길이를 제한하는 과도한 미세 소관의 좌굴을 방지하고, (2) 대뇌 피질의 당기는 힘이 애 - 애 스터의 반발 세력에 대항 개별 과꽃 8에 그물 중심 세력으로 이어질를 촉진한다.
Ase1는 F를 유도 확산 성 가교제경향 orces는 반 평행 미세 소관 (29)의 중첩 영역을 증가시킵니다. 이과 일치는, (네인 및 부재)를 Ase1의 존재 중심체는 Ase1이 극간 미세 소관 (그림 4D)를 번들로 제공하는 현지화와 가깝게 찾을 수 있습니다. 키네신-5 가족의 구성원은 (소개 참조) 스핀들 내에서 추진하는 힘을 제공하여 중심체 분리를 구동한다. Cut7합니다 (S. pombe 키네신 -5- ortholog)의 존재 하에서조차 Ase1 중심체 (도 4E)의 존재하에 에멀젼 소적의 양측에 가압된다. 피질 간 극성 동력 발전기를 결합함으로써, 복잡도의 레벨은 상기 바이폴라 결국 분열 스핀들 조립체의 포괄적 인 이해에 이르는 이들 실험에서 증가 될 수있다. 이러한 결과의 상세한 정량적 설명은 미래에 사용할 수 있습니다 (로스 외., 준비 원고).
(도 5c)에. 이것은 정상 상태 동작과 스핀들 조립 속도론 모두의 연구를 용이하게한다. 동일한 샘플의 서로 다른 내용으로 방울을 조합함으로써, 예를 들면, 가능한 직접 (도 5b)와 피질 힘 발생기 않고 물방울 중심체 위치 스핀들 조립체 동력학과 비교된다.
그림 1 : 힘은 유사 분열 스핀들에 작용하는 여러 힘 생성 분자는 스핀들 형성 및 위치를 촉진하기 위해 유사 분열 스핀들의 미세 소관에 작용한다.. 셀 피질로 성장 미세 소관은 중심체의 미는 힘을 생성합니다. (보라색) 두피 네인은 해중합 미세 소관을 캡처하고 중심체에 당기는 힘을 생성합니다. PRC1 / Ase1 가족의 가교제가 힘을 슬라이딩 바깥쪽으로 반대 생성하는 반면, 스핀들 내에서 키네신-5 / Cut7 모터 단백질, 반 평행 미세 소관에서 바깥쪽으로 슬라이딩 힘을 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2 :. 4 마이크로 유체 칩을 포함하는 4 인치 포토 마스크의 미세 유체 칩 설계 (A) 디자인. (B)는 단일 칩의 상세한 표현. 칩은 하나의 출구 채널 및 먼지 필터 뒤에 세 개의 유입 채널을 포함한다. 입구 채널 (1)이 물 단계를 포함 지질 / 오일 상 및 제 3 채널이 채널은 추가적인 지방 / 오일 상으로 형성된 방울을 희석 할 수있다. (C) (상단과 하단에서 오는) 지질 / 오일 위상 (왼쪽에서 오는) 물 위상에 맞는 접합의 상세한 표현입니다. 교차로에서 물방울이 형성되고 오른쪽에있는 출구 통로쪽으로 흐른다. (D) 2 μm의 채널 먼지 필터의 상세한 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 유 중수 에멀젼 액적 형성을위한 방법론 (A) 밝은 필드 현미경 미세 유체 칩과 마이크로 유체 관. 모두 물과 지방 / 오일 상 관이 각각 칩 입구 (1)과 (2)에 접속된다. 발수 지질 / 오일 위상이 충족 마이크로 유체 칩 (B) 제한. 압력을 변화시킴으로써, 소적 크기는 조절 될 수있다. PDMS 코팅 플로우 셀 (C) 설계. 플로우 셀에 방울을 넣은 후, 구단은 추가 Valap 폐쇄된다. (D)의 액적 형성의 회로도. 방울 중심체, 튜 불린 및 방추사 형성에 필요한 추가의 성분을 캡슐화하는데 사용된다. 대뇌 피질의-네인 타겟팅 (E) 도식. 바이오틴 (바이오) 네인은 스트렙 타비 딘 (STRP)를 통해 바이오틴 지질을 대상으로한다. 
그림 4 :. 복잡성 증가와 스핀들 - Reconstitutions의 대표 결과 (A), 짧은 중간, 긴 미세 소관의 예를 보여주는 두 개의 중심체가 포함 된 물방울의 최대 강도 예측. 중심체와 미세 소관은 10 % HiLyte 488 튜 불린 표지의 첨가에 의해 가시화된다. 스케일 바는 10 μm의 =. (- 왼쪽)와 스트렙 타비 딘 (STRP)의 존재 (+, 오른쪽)이 없을 GFP - 비오틴 네인 - TMR의 (B) 버전. 대뇌 피질의 GFP - 비오틴 - 네인 - TMR의 (오른쪽 +,) - (왼쪽) 또는 존재 (C) 미세 소관의 애의 부재에 위치. (D) 미세 소관의 애 (왼쪽 패널, GREEN Ase1의 존재) 위치 (가운데 패널, 레드). Ase1 및 Cut7 (키네신-5) (중간 패널, 레드)의 존재 (E) 미세 소관의 애 (왼쪽 패널, 녹색) 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 5 : 체외에서 이미징 애 위치 역학 (A) 몇 시간까지 액적 이미징을 할 수있는 PDMS 컵의 디자인.. (B) 생성, 저장 및 액적 이미징 형광 덱스 트란의 부재 (왼쪽) 포함 (우) (알렉사 647)에 의해 도시 된 다른 내용을 포함하는 (송신). (C) 60 분의 시간 경과의 단일 평면 이미지 (2 분 간격) 광고의 Z-스택 (2 μm의 거리)에서 촬영하나의 중심체를 포함 roplet. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
방법은 유 중수 에멀젼 방울에 기본 유사 분열 스핀들을 재구성하기 위해 여기에 존재하는 최근의 노력을 설명했다. 기하학적 경계 내에서 스핀들 어셈블리를 공부하는 것은 많은 장점을 제공한다. 주요 피드백 메커니즘 방추사의 미세 소관 그들이 조립 된 기하학적 제한 사이에 존재한다. 미세 소관은 유사 분열 스핀들 변위가 발생할 수 있습니다 기하학적 경계로 성장할 때 힘을 밀어 생성 할 수 있습니다. 또한, 물리적 인 장벽으로 성장하면 미세 소관 재해를 유발할 수있다. 또한, 밀폐 된 형상 내의 스핀들 조립체는 차례로 직접 미세 소관 증가율 (36)에 영향을 미치는 등의 튜 불린 등의 개별 구성 요소의 점진적인 고갈을 초래할 수있다. 이들은 여기에 설명 된 분석법을 이용하여 연구 할 수 스핀들 조립체의 모든 중요한 결정 요인이다.
설명 된 분석은 작은 농도 differe에 매우 민감하다액적 성분 NCES. 이것은 작은 농도 차이가 너무 느리거나 너무 빠른 미세 소관의 성장을 초래할 수 tubulin에 대한 경우이다. 이 경우, 미세 소관 성장률들은 여전히 실험의 첫 번째 ~ 30 분 동안 온도를 조정함으로써 보정 할 수있다. 방추사 조립체 및 위치도 (피질) 힘 발생기의 농도의 변화에 매우 민감하다. 이렇게 정제 된 성분의 농도, 순도 및 활성에 의존 할 가능성이 모든 새로 정제 된 단백질을 적정 신중해야한다.
또한, 특정한 절충은 분석의 특성에 따라, 촬상 설정에서 수행 될 수있다. 먼저, 수용성 형광 튜 불린 이량 높은 수준의 화상 개별 미세 소관을 어렵게 만든다. 미세 소관은 이상 성장 수용성 튜 불린 천천히 고갈 된 바와 같이, 신호 대 잡음비가 점점 높아져 individu의 이미징을 허용알 미세 소관. 오픈 시스템 설정과는 달리 기하 구속 상당한 표백 결과, 벌크 저장소 내의 형광 분자 산소 제거제 시스템 부품의 교환을 방지한다. 특히, 시간이 지남에 따라 스핀들 어셈블리 및 위치 모니터링, 그것도 강력한 탈산 소제 시스템의 존재하에 낮은 광도를 가진 이미지에 요구된다.
이들 방법은 시험 관내 간략화 스핀들 형 구조의 상향식 재구성을 가능하게한다. 여기에 소개 된 구성 요소에 더하여, 다른 많은 요인 등 3 바이폴라 스핀들 형성, 위치, 방향, 정형을, 영향을 설명 하였다. 이 시스템은 추가의 힘 발생기의 개별 및 결합 효과를 연구하기 위해 확장 될 수있다. 이 시스템에서 현재 존재하지 않는다 스핀들 형성에 중요한 기여는 유사 분열 염색체 수 있습니다. 유사 분열 염색질은로 표시되었습니다'극성 토출 힘'(3), (2) 염색질 바인딩 RanGEF RCC1 (38)에 의해 RanGTP 구배의 형성, (3) kinetochores (해중합과 상호 작용할 수있는 소위 생성 할 수 있습니다 (1) chromokinesins에 의해 직접 스핀들 형성 ) 미세 소관 (39) 및 (4) 반대 미세 소관 (40) 사이에-기계 스프링 역할을 할 수있는 염색질 자체.
마지막으로, 기술 시스템은 현재 제한된 시간과 공간 활동을 제어 도입 힘 발전기의 국산화를 제공합니다. 세포, 많은 스핀들 어셈블리 요소는 특정 구획에 지역화 또는 제한된 시간 창에서 활성화됩니다. 현저한 예는 구체적으로는 (C)의 후방 측에 충실 네인의 활성 인 엘레 한 세포 단계의 배아는 비대칭 스핀들 포지셔닝 및 세포 분열을 촉진한다. 이 시스템에서, 우리는 현재와 같은 t을 흉내 낸의 가능성을 모색하고 있습니다광학 유전 기술에서 차용 emporal 및 비대칭 활동에 사용하는 방법. 또한, AS는 C.의 경우와 엘레 배아와 단단한 세포벽과 세포는 많은 세포 유사 분열에서 반올림하지 않습니다. 기하학적 구속 형상은 스핀들 (41)에 작용하는 힘에 기초 영향을 미칠 것이다. 따라서, 잠재적으로 정형 및 에멀젼이 기억 42,43 방울 허용 더 복잡한 마이크로 유체 시스템의 사용뿐만 아니라 비 구형 방울 스핀들 어셈블리 및 위치를 재구성하는 것이 중요 할 것이다. 마지막으로, 조직에서 세포 - 세포 및 세포 - 기질 시그널링 및 첨부들은 상피 세포에서 관찰 된 바와 같이, 스핀들 방향 지시로 번역 될 수있는 외부 신호를 제공하고, 줄기 세포. 이러한 전문적인 측면 모두이 현재 연구에서 고려되지 않은 및 유사 분열 스핀들 assemb의 생체 -like 더 reconstitutions으로 구축하는 미래의 도전을 제공 할 수 있습니다LY 및 위치.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Preparation of microfluidic chips | |||
| Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
| SU-8 3025 | MicroChem | ||
| Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0>10-20 Ω-cm, 500-550 μm, SSP, with 2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
| Spin coater | Polos | SPIN150I | |
| PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
| 2. Microfluidic setup | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
| Glass pipets | |||
| Glass tubes | |||
| Vacuum pump | Laboport | KNF | |
| Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
| Sonicator | Branson | M2800H | |
| Coverslips | 24 mm x 60 mm, thickness 1.5 | ||
| Glass-slides | 26 mm x 76 mm | ||
| Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
| Laboratory sealing film | Parafilm | ||
| Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
| Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
| Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
| PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
| Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
| 3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
| BSA - Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
| DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
| Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
| 4. Introducing spindle-assembly factors | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
| ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
| PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |
References
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