Summary
Den hund hjerne er en værdifuld model til at studere voksen neurogenese. Præsenteret her er protokoller til isolering og udvide voksne hunde hippocampus neurale precursorceller fra primær hjernevæv.
Protocol
I overensstemmelse med New South Wales, Australien lov, post mortem hjernevæv blev erhvervet fra voksne hunde aflivet af årsager relateret til undersøgelsen.
1. Fremstilling af Culture Medium
- Der fremstilles en 0,1% gelatine opløsning ved tilsætning af 0,1 g gelatine pulver til 100 ml destilleret vand og omrøre ved 37 ° C indtil opløsning. Steriliser opløsningen ved UV-bestråling i 15 minutter. Dette medie kan derefter opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
- Der fremstilles en 3: 1-forhold mellem Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) og næringsblanding F12 ved tilsætning 167 ml F-12 til 500 ml DMEM (4,5 g / L D-glucose). Tilsættes 6,7 ml penicillin / streptomycin-opløsning (for en 1% slutkoncentration). Dette medie kan opbevares i mørke ved 4 ° C i op til 1 måned.
- Forbered 500 ml serum medier ved at kombinere 440 ml DMEM (4,5 g / L D-glucose), 5 ml L-alanyl-L-glutamin dipeptid (200 mM), 5 ml penicillin / streptomycin og 50 ml føtalt bovine serum (FBS). Dette medie kan opbevares i mørke ved 4 ° C i op til 1 måned.
- Komplet vækstmedium består af neural stamcelle (NSC) Basal Medium og Proliferation Neural Supplement-A (NS-A), 2% FBS, 2 ug / ml heparin, 20 ng / ml epidermal vækstfaktor (EGF) og 10 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF). Gør dette medie frisk, umiddelbart før hjernen dissektion, og opvarm til 37 ° C i et vandbad.
2. Brain Extraction
- Begynd udvinding inden 6 timer efter slagtningen ved sterilisere dorsale overflade af hundens hoved ved hjælp povidon-jod.
- Ved hjælp af en skalpel en langsgående snit langs det sagittale midterlinjen over hele dorsale overflade af kraniet, for at blotlægge de underliggende tyggemuskler. Længden af denne nedskæring vil afhænge af arten og alder af hunden.
- På rostralt og caudale grænser kraniet, foretage yderligere 5 - 10 cm vinkelrette snit på begge sider, passing bag øjne og ører henholdsvis tillader huden at blive fuldt igennem.
- Ved hjælp af en skalpel, adskille tyggemuskler fra deres tilknytning til den sagittale toppen af kraniet og skrabe eventuelt resterende bindevæv fra kraniet.
- Ved hjælp af en oscillerende knogle savsnittet hætten af kraniet i en perifer linje. Ved hjælp af en sonde eller skalpel skille eventuelle resterende vedhæftede filer med dura, og fjern derefter forsigtigt kalot at udsætte dorsale overflade af hjernen.
Forsigtig: Tykkelsen af knoglen varierer i forskellige regioner i kraniet, så forsigtighed skal udvises for ikke trænge for dybt og beskadige underliggende hjerne. - Skille de rygmarven ved at indsætte en skalpel mellem den øvre cervikale hvirvler.
- Med den ene hånd til forsigtigt at løfte hjernen, brug en skalpel til omhyggeligt befri hjernen fra kranielle grube og skille de forbindende nerver og blodkar placeret på dens ventrale side. Løft forsigtigt bregn ud af kraniet og ind i en beholder med DPBS.
Forsigtig: De store olfaktoriske løg af hundens hjerne kan strække sig dybt ind i forreste kranie fossa. Der skal udvises forsigtighed ved fjernelse hjernen for at bevare disse strukturer.
3. Hippocampal Dissektion
- Skyl hjernen i Dulbeccos phosphatbufret saltvand (DPBS) for at fjerne noget blod og placere den dorsale side ned på en 150 mm petriskål.
- gennemskære langsomt hjernen langs gennem midten sagittale plan under anvendelse af en våd hjerne kniv og en enkelt skive, der udnytter den fulde længde af bladet. Må ikke anvendes yderligere nedadgående pres, eller bruge en savning bevægelse, da dette kan beskadige vævet.
- Placering hver halvkugle mediale overflade op, dissekere ud hippocampus ved hjælp af en skalpel og fin pincet, og overføre det til en 35 mm vævskulturskål.
4. Isolering af neurale precursorceller
- Hak tudstede prøver ved hjælp af en skalpel i ca. 1 mm 3 stykker.
- Overfør vævet i et 15 ml rør, tilsættes 2 ml 0,1% trypsin EDTA og inkuberes i 7 minutter i et vandbad ved 37 ° C.
- Standse enzymreaktionen ved tilsætning af 4 ml serum medier til røret. Pelletere suspensionen ved centrifugering ved 100 xg i 7 min og fjern supernatanten.
- Resuspenderes pelleten i 300 pi DPBS, og dissocieres mekanisk ved forsigtigt at pipettere op og ned ved hjælp af en 1.000 pi pipettespids, indtil en glat homogenatet former.
- Tilsættes 14 ml serum medier til røret og passerer cellesuspensionen gennem en 40 um cellefilter. Pelletere suspensionen ved centrifugering ved 100 xg i 7 min, supernatanten fjernes, og resuspender i komplet vækstmedium.
5. neurosfære Kultur
- Fra cellesuspensionen opnås ved isolation, tælle antallet af levedygtige celler ved hjælp af udelukkelse trypanblåt og en hemocytometer.
- Fortynd cellesuspensionen i komplet vækstmedium og frø ved 1 x 10 5 celler / cm2 i uovertrukne brønde i en 6-brønds plade.
- Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 og> 95% fugtighed i 14 - 28 døgn erstatte 50% af dyrkningsmediet hver 7. dag. Mål diameteren af neurosfærer regelmæssigt. Hvis lov til at vokse ud over 100 um i diameter, kan celledød og spontan differentiering forekommer inden for de neurosfærer.
6. neurosfære Passage
- Til passage som et flydende kultur, når neurosfærerne nåede ca. 100 um i diameter, kombinere alle de neurosfære indeholdende medier i et enkelt rør. Pellet ved centrifugering ved 100 xg i 7 min og fjern supernatanten.
- Pellet resuspenderes i 1 ml 0,1% trypsin EDTA og inkuberes i 7 minutter i et vandbad ved 37 ° C. Pipettér forsigtigt op og ned 100 gange under anvendelse af en 200 pi pipettespids, at sikre dissociatipå af de neurosfærer.
- Standse enzymreaktionen ved tilsætning af 5 ml serum medier til røret og der centrifugeres ved 100 xg i 7 min.
- Fjern supernatanten, resuspender cellepelleten i 1 ml komplet vækstmedium og tælle antallet af levedygtige celler under anvendelse af trypanblå farveeksklusion og et hæmocytometer.
- Fortynd cellesuspensionen i komplet vækstmedium og frø ved 1 x 10 5 celler / cm2 i uovertrukne brønde i en 6-brønds plade. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 og> 95% fugtighed i 14 - 28 døgn erstatte 50% af dyrkningsmediet hver 7. dag.
7. Klæbende Culture of Neural precursorceller
- Tilsæt en tilstrækkelig mængde af 0,1% gelatineopløsning at dække overfladen af en vævskulturskål og helbredelse i en inkubator ved 37 ° C i 1 time inden behandlingen neurosfærerne for adhærerende kultur.
- Fra den flydende neurosfære kultur, kombinere alle medier i et enkelt rør. Pelletere NEURospheres ved centrifugering ved 100 xg for 7 min og fjern supernatanten.
- Pellet resuspenderes i 1 ml 0,1% trypsin EDTA og inkuberes i 7 minutter i et vandbad ved 37 ° C. Pipettér forsigtigt op og ned 100 gange under anvendelse af en 200 pi pipettespids.
- Der tilsættes 5 ml serum medier til at standse enzymreaktionen og der centrifugeres ved 100 xg i 7 min. Supernatanten fjernes, og resuspender cellepelleten i 1 ml komplet vækstmedium og tælle antallet af levedygtige celler under anvendelse af trypanblå farveeksklusion og et hæmocytometer.
- Fortynd cellesuspensionen i komplet vækstmedium, fjerne gelatine fra vævskulturkolber og frø cellerne ved 1 x 10 4 celler / cm2.
- Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 og> 95% fugtighed. Erstatte medier med friske, opvarmet, komplette vækstmedier hver tredje dag, indtil kulturen når ca. 80% konfluens (efter ca. 7 dage).
8. Neural Colony Forming Assay
- Kombiner Neural kolonidannende celle (NCFC) assaymedier komponenter: NCFC serumfrit medium, Proliferation NS-A, og collagen-opløsning (3 mg / ml). Supplere denne medier med 2 ug / ml heparin, 20 ng / ml EGF, og 10 ng / ml bFGF.
- Efter hippocampale væv dissociation Resuspender cellerne i neural kolonidannende assaymedium, forvarmet til 37 ° C i et vandbad. Frø cellerne ved en klonal tæthed på 1,1 x 10 5 celler / ml i en 35 mm dyrkningsskål.
- Inkubér cellerne i denne halvfast collagenmatrix ved 37 ° C, 5% CO2 og> 95% fugtighed. Kultur i 28 dage, der erstatter 50% af vækstmediet hver 7. dag.
9. Differentiering af neurale precursorceller
- Tilsæt en tilstrækkelig mængde 5 pg / cm2 laminin løsning til at dække overfladen af en vævskulturskål og helbredelse i en inkubator ved 37 ° C i 24 timer før behandlingen af cellerne i differentieringtion.
Bemærk: Fjern laminin opløsning og skyl den belagte overflade to gange i DPBS umiddelbart før podning. - Når passage, frø cellesuspensionen ved 1 x 10 4 celler / cm2 i DMEM-F12 (3: 1) media (forvarmet til 37 ° C) suppleret med 20 ng / ml EGF og 40 ng / ml bFGF på lamininovertrukne dyrkningsskål.
- Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 og> 95% fugtighed og tillader celler at proliferere i 3 dage.
- At differentiere de adhærente neurale precursorceller, efter 3 dage erstatte medier med differentiering medier indeholdende DMEM-F12 (3: 1) medier forud opvarmet til 37 ° C, suppleret med 10 ng / ml hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF).
- Under differentiering erstatte 50% af medierne hver 3. dag. Differentiering sker gradvist over ca. 21-28 dage.
Forsigtig: Når cellerne er begyndt at differentiere, kun erstatte 50% af medierne på én timig som eksponering for luft kan have en skadelig virkning på sundheden af cellerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gennem brug af in vitro neurale precursorceller assays, neurogenese og neurale precursor cellepopulationer blev karakteriseret og sammenlignet hen over dorsoventral akse af den voksne hunde hippocampus. Neurale præcursorceller afledt isoleret hippocampus væv dannet flydende neurosfærer senest 14 dage efter isolation og nåede en diameter på 100 um med 28 dage af kultur. Neurosfærer afledt af dorsale og ventrale isolater viste ingen forskel i den gennemsnitlige størrelse, og efter enzymatisk dissociation i enkelte celler, kunne passeres som flydende neurosfære-kulturer. Sekundære flydende neurosfærer fra begge hippocampale regioner var i stand til at danne inden for 5 dage fra passagen. Når podet ved 1 x 10 4 celler / cm2 på 0,1% gelatineovertrukne dyrkningskolber, neurale precursorceller var også i stand til at proliferere som adhærente monolag (figur 1A). Ingen morfologiske forskelle blev observeret between dorsale og ventrale hippocampus neurale precursorceller og begge vedhængende kulturer var i stand til at gennemgå mere end 10 populationsfordoblinger uden nogen observerede opbremsning i passage-tid (figur 1B). Nestin og Sox2 neural stamcelle genekspression i adhærerende kultur var ikke signifikant forskellig på tværs af hippocampale dorsoventral akse (figur 2). Mere omfattende karakterisering af genet og proteinekspression, hvilket bekræfter den neurale forstadie identitet af disse celler, er rapporteret i vores offentliggjorte oplysninger 7.
Ved anvendelse af en tilpasset Neural Colony Forming assay 4,6 vurderede vi neural precursorcelletype frekvens for at kvantificere potentielle forskelle i neurale precursor cellepopulationer tværs af dorsale og ventrale underregioner af hunde hippocampus. Celler blev podet ved klonal densitet i en halvfast kollagenmatrix, der udelukker cellefusion, og dyrket i 28 dage (figur 3A F = 96,8; p = 0,001; Fig 3B ).
Under differentiering betingelser, viste vedhængende hunde neurale precursorceller progressive ændringer i grov morfologi, udvikling længere og mere omfattende processer. Proteinekspression for neuronal (βIII-tubulin) og glia (gliafibrillært surt protein, GFAP) markører steg også efter differentiering (figur 4). Ingen signifikant forskel observeret i antallet af positivt mærkede celler mellem dorsale og ventrale isolater. Vores tidligere offentliggjorte data bekræfter disse protein udtryk ændringer, viser opregulering af deres tilknyttede gener sammen med nedregulering af neurale prækursorer gener over 28 dage differentiering periode 7.
Figur 1:. In vitro Udvidelse af Voksen Canine Hippocampal Neural precursorceller Voksne hunde hippocampus neurale precursorceller isoleret fra det dorsale og ventrale hippocampus regioner udvides som (A) flydende neurosfærer eller som (B) et klæbende monolag (C) Som en. klæbende monolag disse neurale precursorceller kunne undergå passage over 10 gange uden væsentlig nedgang i fordobling hastighed. n = 5; skala = 50 um. Modificeret fra offentliggjorte figur 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
/ftp_upload/54953/54953fig2.jpg "/>
Figur 2:. Genekspression i prolifererende voksen Canine Hippocampal Neural precursorceller Ekspression af neural stamcelle gener (A) Nestin og (B) Sox2 blev bekræftet hos voksne hunde hippocampale neurale precursorceller under adhærerende proliferative dyrkningsbetingelser. Ekspression af disse gener var ækvivalent i både dorsale og ventrale hippocampus afledte celler. Voksne hunde fibroblaster blev anvendt som en kontrol linje til at sammenligne forskelle i relativ genekspression. n = 5; fejllinjer = SEM. Modificeret fra offentliggjorte figur 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Neural Colony Forming Assay (A)Voksne hunde neurale precursorceller, podet ved klontæthed til en halvfast kollagenmatrix, danner neurosfærer inden for 28 dages dyrkning. (B) Neurale precursorceller afledt fra den dorsale hippocampus generere væsentligt flere neurosfærer per arealenhed end dem, der stammer fra den ventrale hippocampus. n = 5; fejllinjer = SEM; skala = 50 um. Modificeret fra offentliggjorte figur 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Immuncytokemi af differentierede Voksen Canine Hippocampal Neural precursorceller Når dyrket i BDNF i 28 dage, voksne hunde neurale forstadier fra både dorsale og ventrale hippocampus differentierer til modne neuronal (βIII-tubulin posomt) og gliale (GFAP-positiv) celletyper. n = 5; skala = 50 um. Modificeret fra offentliggjorte figur 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De her beskrevne protokoller er optimeret til at fastholde gunstige dyrkningsbetingelser for maksimering af cellelevedygtighed. Hastigheden og omhu under ekstraktion, isolering og ekspansion er af afgørende betydning. Et afgørende skridt til etablering af vedhæftende monolag ekspansion er den effektive adskillelse af de primære neurosfærer. Efter passage, utilstrækkeligt dissocierede neurosfærer kan generere sekundære flydende neurosfærer. Under medier forandring, kan disse neurosfærer fjernes, adskilles og genpodedes for vedhængende monolag passage. Omvendt, hvis post-dissociation cellelevedygtighed er under 80%, kan dette være indikativt for overdreven pipettering under dissociation. Neurale prækursorceller, særlig deres differentierede modstykker, er følsomme over for ændringer i pH uden for fysiologiske område, og udsættelse for luft. Observation af pludselige udbredt celledød kan tilskrives disse faktorer. Derfor et afgørende skridt i løbet af medier chanGES er for medierne, der skal foretages frisk hver gang, og for kun 50% af den mængde, der skal udskiftes. Endelig mens mitogene faktorer EGF og bFGF støtter overlevelse og proliferation af hippocampus neurale forstadier under serumfrie betingelser in vitro 22,23, det cellulære respons på disse mitogener er meget afhængig af cellen udviklingsmæssige alder og mitogene koncentration 24,25. Derfor er afgørende for generering af ensartede, reproducerbare cellekulturer sikrer minimal eksperimentelle variation i disse komponenter.
For at opnå maksimal levedygtighed, bør celler seedes til dyrkning inden for 6 timer efter slagtning. Imidlertid kan den ekstraherede hjerne gemmes midlertidigt i PBS ved 4 ° C. Denne modifikation kan tillade isolation at være forsinket med op til 24 timer med minimal reduktion i celle udbytte 26,27. Vækstfaktor tilskud af dyrkningsmediet kan også modificeres til at forbedre proliferation eller til at fremme Forskelntiation af specifikke neurale celletyper. Insulin-lignende vækstfaktor 1 (ved 100 ng / ml) har vist sig at have en støttende virkning på gnavere neurale stamceller in vitro 28,29, mens under differentiering betingelser pro-neuronal faktor BDNF 30 kan anvendes sammen med faktorer sådanne interleukin 7 (ved 500 ng / ml) eller retinsyre (ved 0,1 uM) for at inducere en bias i retning neuronal undertype eller glia differentiering 31,32.
Beslutningen om at udvide neurale precursorceller som flydende neurosfærer eller som en klæbende monolag afhænger i høj grad af de ønskede efterfølgende anvendelser og kultur karakteristika. Mens neurosfære kultursystem er forenklet og meget reproducerbar, er det begrænset i sin evne til at generere homogene populationer af celler. Den komplekse mikromiljø inden for hver sfære kan fremme apoptose og spontan differentiering, fremme en heterogen population 33, mens reported fusion af neurosfærer der kan forvirre kvantificering af neural precursor cellepopulationer 34. Endvidere kan den gentagne mekaniske dissociering kræves til neurosfære passage også føre til en skadelig stress, ældning eller endda celledød. Brugen af alternative dissociation enzym, såsom papain, kan påvirke den resulterende cellelevedygtighed 16. Omvendt det vedhængende monolagskultur system med mere ensartet eksponering for miljømæssige mitogener, tilskynder til større ensartethed i celletype og mere symmetrisk division. Dette system har vist sig at producere en niche uafhængig population af celler, baseret på ekspressionen af vigtige stamcellemarkører 35,36. Dette system kræver brug af præ-coatede dyrkningsbeholdere at fremme cellulære tilslutning. Valget af kultur substrat bør overvejes nøje, da det kan få væsentlig indvirkning på differentiering profil af de dyrkede neurale forstadier 25,37.
Here vi præsenterer effektive protokoller til isolering, udvidelse og differentiering af voksne hunde hippocampus neurale precursorceller fra væv frisk post mortem. Voksne hunde neurale forstadier er underrepræsenteret i litteraturen 18; med komplet protokoller for deres isolation og ekspansion, endnu mindre 17. Vores protokoller kan så tjene til at øge bevidstheden om dette værdifulde dyremodel og udgør en væsentlig tilføjelse til denne beskedne antal undersøgelser. Af betydning, ved hjælp af vores unikke metode, voksne hunde hippocampus neurale forstadier held kan udvides mere end 10 populationsfordoblinger. En lignende undersøgelse under anvendelse af voksne hunde hippocampal neural precursor rapporteret at større neurosfærer, passeret ved 100 - 150 um i diameter, ophørte proliferation ud over den femte generation 17. Som nævnt i vores protokol, kan overdreven vækst neurosfære tilskynde spontan differentiering og apoptose, hvilket over seriel passage kan have led til denne reducerede proliferative evne. Vi giver også en protokol for adhærerende monolag udvidelse af denne cellepopulation, som et alternativ til den klassiske neurosfære udvidelsessystem 17-21. Denne alternativt system giver brugeren mere kontrol over det cellulære miljø, og væsentligt udvider rækken af downstream-applikationer for disse celler, med potentiale for fænotypisk homogenisering og instrueret neuronal differentiering 35,38.
Dyrkede voksne hunde hippocampus neurale precursorceller har programmer på tværs af en bred vifte af cellulære og neurobiologiske forskningsområder. Den hund hjerne har en tættere homologi til den humane hjerne end eksisterende gnavermodeller. Som sådan, voksne hunde neurale precursorceller udgør en vigtig, men dublerede, ressource. Disse celler kan anvendes til at opnå yderligere indsigt i mekanismerne bag voksne neurogenese i mennesker, og til udvikling af regenerative behandlinger, Target denne proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 μl filtered pipette tip | Axygen | TF1000 | |
| 150 mm Petri dish | BD Biosciences | 351058 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio One | 188271 | |
| 200 μl filtered pipette tip | Axygen | TF200 | |
| 24 well culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
| 35 mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353001 | |
| 40 µm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 6 well culture plate | BD Biosciences | 351146 | |
| B-27 Supplement (50x) serum free | Life Technologies | 17504044 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life Technologies | 13256029 | |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | Millipore | GF029 | |
| Collagen solution | Stem Cell Technologies | 04902 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| DMEM (4.5 g/L, D-glucose) 500 ml | Life Technologies | 11960044 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | BD Biosciences | 354001 | |
| F-12 nutrient mixture (Ham) (1x) Liquid | Life Technologies | 31765035 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies | 16141079 | |
| Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide (GlutaMAX) | Life Technologies | 35050061 | |
| Heparin sodium salt from (porcine) | Sigma-Aldrich | H314950KU | |
| Laminin (mouse) | Life Technologies | 23017015 | |
| NCFC serum free medium (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5720 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit from Stem Cell Technologies. Cat: 05740 |
| Proliferation NS-A (NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 05773 | Also available in the Neurocult NCFC Assay Kit Cat: 05740, and NS-A Prolieration Kit (Rat) Cat: 05771 from Stem Cell Technologies. |
| NSC basal medium (Rat; NeuroCult) | Stem Cell Technologies | 5770 | Also available in the Neurocult NS-A Prolieration Kit (Rat) from Stem Cell Technologies. Cat: 05771 |
| Penicillin/Streptomycin (5,000 U/ml) | Life Technologies | 15070063 | |
| Povidone-iodine | Munipharma | Betadine | |
| Trypan blue (0.4%) | Life Technologies | 15250061 | |
| Trypsin EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| Class II biological safety cabinet | ThermoFisher Scientific | Safe 2020 1.2 | |
| Brain knife (disposable) | Macroknife | ||
| Cell culture incubator | ThermoFisher Scientific | HERAcell 150i | |
| Centrifuge | Hettich | Universal 320R | |
| Dumont #5 Forceps | Dumont | ||
| Easypet Electric pipette | Eppindorf | ||
| Hemocytometer | Boeco | Bright-Line Improved Neubauer | |
| Manual pipettes | Eppindorf research | ||
| Oscillating bone saw | |||
| Scalpel blades (No.21) | Paramount | ||
| Scissors | Delta | ||
| Water bath | Grant | JB Aqua 18 plus |
References
- Kheirbek, M. A., Hen, R. Dorsal vs ventral hippocampal neurogenesis: implications for cognition and mood. Neuropharmacol. 36 (1), 373 (2011).
- Tanti, A., Rainer, Q., Minier, F., Surget, A., Belzung, C. Differential environmental regulation of neurogenesis along the septo-temporal axis of the hippocampus. Neuropharmacol. 63 (3), 374-384 (2012).
- Eriksson, P. S., et al.
- Bull, N. D., Bartlett, P. F. The adult mouse hippocampal progenitor is neurogenic but not a stem cell. J Neurosci. 25 (47), 10815-10821 (2005).
- Kempermann, G., et al. Why and how physical activity promotes experience-induced brain plasticity. Front Neurosci. 4 (189), 1-9 (2010).
- Golmohammadi, M. G., et al. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26 (4), 979-987 (2008).
- Lowe, A., et al. Neurogenesis and precursor cell differences in the dorsal and ventral adult canine hippocampus. Neurosc. Lett. 593, 107-113 (2015).
- Sasaki, M., et al. MRI identification of dorsal hippocampus homologue in human brain. Neuroreport. 15 (14), 2173-2176 (2004).
- Powell, E. W., Hines, G. The Hippocampus. , Springer. 41-59 (1975).
- Jung, M. -A., et al. Canine hippocampal formation composited into three-dimensional structure using MPRAGE. J Vet Med Sci. 72 (7), 853-860 (2010).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Ray, J., Raymon, H. K., Gage, F. H. Generation and culturing of precursor cells and neuroblasts from embryonic and adult central nervous system. Methods Enzymol. 254, 20-37 (1995).
- Oliver-Dela Cruz, J., Ayuso-Sacido, A. Neural stem cells from mammalian brain: isolation protocols and maintenance conditions. INTECH Open Access Publisher. , (2012).
- Pacey, L., Stead, S., Gleave, J., Tomczyk, K., Doering, L. Neural stem cell culture: neurosphere generation, microscopical analysis and cryopreservation. Nat Protoc. , (2006).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), e2393 (2010).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
- Lim, J. -H., Koh, S., Olby, N. J., Piedrahita, J., Mariani, C. L. Isolation and characterization of neural progenitor cells from adult canine brains. Am J Vet Res. 73 (12), 1963-1968 (2012).
- Herranz, C., et al. Spontaneously Arising Canine Glioma as a Potential Model for Human Glioma. J Comp Pathol. 154 (2), 169-179 (2016).
- Walton, R. M., Parmentier, T., Wolfe, J. H. Postnatal neural precursor cell regions in the rostral subventricular zone, hippocampal subgranular zone and cerebellum of the dog (Canis lupus familiaris). Histochem Cell Biol. 139 (3), 415-429 (2013).
- Walton, R. M., Wolfe, J. H. Abnormalities in neural progenitor cells in a dog model of lysosomal storage disease. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (8), 760-769 (2007).
- Milward, E. A., et al. Isolation and transplantation of multipotential populations of epidermal growth factor-responsive, neural progenitor cells from the canine brain. J Neurosci Res. 50 (5), 862-871 (1997).
- Ray, J., Peterson, D. A., Schinstine, M., Gage, F. H. Proliferation, differentiation, and long-term culture of primary hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. 90 (8), 3602-3606 (1993).
- Palmer, T., Ray, J., Gage, F. FGF-2-responsive neuronal progenitors reside in proliferative and quiescent regions of the adult rodent brain. Mol Cell Neurosci. 6 (5), 474-486 (1995).
- Zhu, G., Mehler, M., Mabie, P., Kessler, J. Developmental changes in progenitor cell responsiveness to cytokines. J. Neurosci. Res. 56 (2), 131-145 (1999).
- Whittemore, S. R., Morassutti, D. J., Walters, W. M., Liu, R. -H., Magnuson, D. S. Mitogen and substrate differentially affect the lineage restriction of adult rat subventricular zone neural precursor cell populations. Exp. Cell. Res. 252 (1), 75-95 (1999).
- Kennedy, P. Postmortem survival characteristics of rat glial cells in culture. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 50 (6), 798-800 (1987).
- Viel, J. J., McManus, D. Q., Cady, C., Evans, M. S., Brewer, G. J. Temperature and time interval for culture of postmortem neurons from adult rat cortex. J. Neurosci. Res. 64 (4), 311-321 (2001).
- Huat, T. J., et al. IGF-1 enhances cell proliferation and survival during early differentiation of mesenchymal stem cells to neural progenitor-like cells. BMC Neurosci. 15 (91), 1-13 (2014).
- Supeno, N. E., et al. IGF-1 acts as controlling switch for long-term proliferation and maintenance of EGF/FGF-responsive striatal neural stem cells. Int. J. Med. Sci. 10 (5), 522-531 (2013).
- Ahmed, S., Reynolds, B. A., Weiss, S. BDNF enhances the differentiation but not the survival of CNS stem cell-derived neuronal precursors. J Neurosci. 15 (8), 5765-5778 (1995).
- Wohl, C. A., Weiss, S. Retinoic acid enhances neuronal proliferation and astroglial differentiation in cultures of CNS stem cell-derived precursors. J Neurobiol. 37 (2), 281-290 (1998).
- Araujo, D. M., Cotman, C. W. Trophic effects of interleukin-4,-7 and-8 on hippocampal neuronal cultures: potential involvement of glial-derived factors. Brain Res. 600 (1), 49-55 (1993).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3 (10), 801-806 (2006).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), 283 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1 112-120 (2006).
- Ma, W., et al. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC Dev Biol. 8 (90), 1-13 (2008).
- Goffredo, D., et al. Setting the conditions for efficient, robust and reproducible generation of functionally active neurons from adult subventricular zone-derived neural stem cells. Cell Death Differ. 15 (12), 1847-1856 (2008).
